袁紹輝，博超剛，李洪濤，韓雪松

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，哈爾濱 150001)

進(jìn)入更年期后的女性，隨著體內(nèi)雌激素水平的逐漸下降，椎體會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松以及局部骨缺損，其嚴(yán)重影響更年期后女性的骨骼質(zhì)量[1]。骨質(zhì)疏松通常采用補(bǔ)鈣及其他一些保守治療方法，但治療效果往往不理想，并易引起病理性骨缺損，脊柱尤為顯著。近年來骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morthogenetic protein，BMP)的出現(xiàn)引起了組織工程研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。大量基礎(chǔ)實驗已證實BMP在骨缺損愈合過程中可以引起骨骼細(xì)胞發(fā)生與再生、加速骨骼纖維的交織與礦化[1-4]。其中，Ⅰ型骨膠原蛋白是骨缺損愈合過程中促進(jìn)骨細(xì)胞分化和增強(qiáng)成骨細(xì)胞黏附能力的主要因素[5-7]。同時，纖維蛋白是一種良好的蛋白附著載體，可以攜載多種BMP同源異構(gòu)體，因此可作為理想的藥物緩釋載體，促進(jìn)骨缺損愈合[8-10]。

目前以纖維蛋白為載體的BMP-4/7對骨質(zhì)疏松性椎體骨缺損愈合的相關(guān)報道較少見。本研究通過觀察以纖維蛋白為載體的BMP-4/7對大鼠骨質(zhì)疏松性椎體骨缺損愈合過程中Ⅰ型骨膠原蛋白含量及局部生物力學(xué)強(qiáng)度的變化，探討以纖維蛋白為載體的BMP4/7對骨質(zhì)疏松性椎體骨缺損愈合的作用。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：選擇雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠84只，8個月齡，體重180～200 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物中心提供，為無特定病原體動物，醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會合格證號：13-067。實驗對動物的處理方法符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》(中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部)。

主要儀器及試劑：Fax itron樣本放射系統(tǒng)(美國Itron公司)；AG-I生物力學(xué)測量系統(tǒng)(日本島津公司)；DPX2L型雙能X線骨密度儀(美國Lunar公司)；WDW-10KN型計算機(jī)電子萬能力學(xué)試驗系統(tǒng)(日本松下公司)；X-TIRE361T光譜微孔板光密度儀(美國Bio-Rad公司)；Fax itron樣本放射系統(tǒng)(美國Faxitron公司)；Bradford試劑盒、G250染色液、二喹啉甲酸標(biāo)準(zhǔn)蛋白(美國Invitrogen公司)；鼠抗人Ⅰ型膠原單克隆一抗(美國Invitrogen公司)；兔抗鼠二抗IgG(美國Santa Cruz公司)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組 84只大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為4組，每組21只。A組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+(BMP-4/7 24 μg+纖維蛋白20 mg)；B組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+胎牛血清；C組：正常骨質(zhì)骨缺損+(BMP-4/7 24 μg+纖維蛋白20 mg)；D組：正常骨質(zhì)骨缺損+胎牛血清。

1.2.2骨缺損模型的建立 麻醉采用腹腔注射麻醉(氯氨酮0.1 g/kg)。A組、B組大鼠切除雙側(cè)卵巢，C組、D組切除少量腹部脂肪組織。所有大鼠于術(shù)后3個月在麻醉下建立骨缺損模型。大鼠取側(cè)臥位，消毒后逐步顯露橫突韌帶、坐骨神經(jīng)，保護(hù)神經(jīng)，充分顯露椎體，于L5椎體側(cè)面中心行開窗術(shù)，面積為1.5 mm×3.0 mm，深度約為椎體松質(zhì)骨直徑，刮除術(shù)區(qū)內(nèi)所有松質(zhì)骨，A組和C組注入BMP-4/7(前期工作構(gòu)建)[6]和纖維蛋白混合物；B組和D組注入等量胎牛血清(購于哈爾濱宏博生物技術(shù)有限公司)，封閉骨窗，逐層縫合。嚴(yán)格無菌環(huán)境下進(jìn)行所有手術(shù)，術(shù)后飼養(yǎng)于完全清潔級環(huán)境中(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物中心清潔級動物室)。全部實驗大鼠于術(shù)后當(dāng)日立即行放射系統(tǒng)拍攝，判斷骨缺損模型建立情況。

1.2.3免疫印跡法在蛋白水平檢測Ⅰ型骨膠原蛋白 制備蛋白：各組動物分別于骨缺損建模后第1、2、4、5、8、12周各處死3只大鼠[8]。將L5骨缺損標(biāo)本常規(guī)脫鈣7 d(置于200 g/L的乙二胺四乙酸中4 ℃下脫鈣)。組織裂解法[11]：利用蛋白酶，溶菌酶或細(xì)胞壁分解酶在一定條件下作用于生物標(biāo)本，而使細(xì)胞膜或細(xì)胞壁破碎，釋放胞內(nèi)蛋白質(zhì)；利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量測定微量蛋白質(zhì)濃度。二喹啉甲酸標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度已稀釋至500 μg/mL，-20 ℃保存[9]。

免疫印跡法分析骨痂中Ⅰ型膠原蛋白水平：機(jī)械碎裂法裂解標(biāo)本，準(zhǔn)備好硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜)，在半干電轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡15 min。按雙層濾紙→分離膠→NC膜→雙層濾紙的順序疊放，用濕玻棒輕輕滾過，凝膠靠近負(fù)極，而NC膜靠近正極。設(shè)定電流100 mA,轉(zhuǎn)移約35 min，轉(zhuǎn)移完畢，蒸餾水沖洗，將NC膜放放已盛有TBST(TBS+0.05%的吐溫)的培養(yǎng)皿中在搖床約 4 min。在培養(yǎng)皿中加入體積為10～15 mL的含5%的脫脂奶粉的TBST，放入NC膜，室溫下?lián)u動封閉30 min以上，用膠膜蓋好培養(yǎng)皿，置膠膜蓋好培養(yǎng)皿，置冰箱中過夜，上一抗(Ⅰ型膠原一抗為鼠抗人Ⅰ型膠原單克隆抗體，稀釋度為1∶1 500)(10 μL IgG加TBST 15 mL)：將NC膜TBST洗滌搖洗3次，每次5 min。室溫在搖床上雜交2 h。洗滌，上二抗[兔抗鼠二抗(IgG)，稀釋度為1∶2 000](10 μL IgG加TBST 20 mL)雜交1 h。用TBST洗滌NC膜4次，每次10 min，將配好的發(fā)光液化學(xué)發(fā)光試劑 1 mL 滴到NC膜上，并確保發(fā)光液均勻布在膜上，反應(yīng)3～5 min。曝光4 min，顯影8 s，定影，晾干，記錄，保存實驗結(jié)果。將X線膠片置于Gel Doc2000圖像分析系統(tǒng)。測定目的條帶的平均吸光度值，每個組進(jìn)行5次重復(fù)實驗，取平均值作為Ⅰ型膠原蛋白含量的相對值。

1.2.4骨痂組織的骨密度測定 于骨缺損建模后第4、8、12、16周每組各處死3只大鼠，嚴(yán)格無菌消毒。充分暴露腰椎，取出腰椎標(biāo)本，以腰椎骨骼結(jié)痂為中心，進(jìn)行掃描(DPX2L 型雙能X線骨密度儀)。將標(biāo)本繼續(xù)封閉保存于冷凍冰箱內(nèi)(-20 ℃)，進(jìn)一步進(jìn)行力學(xué)實驗測定。

1.2.5力學(xué)性能測試 于骨缺損建模后第4、8、12、16周每組各處死3只大鼠，嚴(yán)格無菌消毒。充分暴露腰椎，取出椎體，保護(hù)椎體及其外殼皮質(zhì)，剔除周邊脂肪組織及筋膜，磨平椎體表面，制成柱形標(biāo)本，使其接力面積約為9 mm2(長、寬、高分別為 5 mm、3 mm、2 mm)，進(jìn)行椎體緊壓測試，以2 mm/min速度進(jìn)行緊壓。記錄生物力學(xué)相關(guān)指標(biāo)，包括最大負(fù)載荷量、最大應(yīng)變量和彈性模量。

2 結(jié) 果

2.1實驗入組情況 84只大鼠中，6只因感染和過度進(jìn)食而死亡未進(jìn)入實驗分析，其余78只均進(jìn)入結(jié)果分析。并于實驗結(jié)束后，補(bǔ)充相應(yīng)組別的實驗鼠進(jìn)行對應(yīng)相同處理，獲取相應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)。實驗大鼠姿勢、步態(tài)、精神、食欲正常、營養(yǎng)良好、被毛光澤、體溫、呼吸、反射、二便未見明顯異常。

2.2Ⅰ型骨膠原蛋白含量變化 A組和C組Ⅰ型骨膠原蛋白含量于第2周開始逐漸升高，在第4周時達(dá)峰值，之后維持較高水平；B組和D組在第2周即達(dá)到峰值，4周后Ⅰ型骨膠原蛋白含量逐漸下降，呈現(xiàn)時間依賴性。在第1周時，A組和B組、C組和D組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，C組和D組Ⅰ型骨膠原蛋白含量均低于A組和B組(P<0.05)；在第2周時，A組和C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),B組和D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但B組和D組均顯著高于A組，C組低于B組，D組高于C組(P<0.05)；在4、5、8、12周時，B組和D組低于A組，C組均高于B組，D組低于C組(P<0.05)，A組與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，D組高于B組(P<0.05)。見圖1、表1。

2.3骨痂組織的骨密度變化 4組骨密度值均在第8組時達(dá)到高峰，8周后骨密度值隨著時間延長逐漸下降，呈時間依賴性。在第4周時，B組和C組骨密度值低于A組(P<0.05)，D組均高于B組和C組(P<0.05)，B組與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，D組低于A組(P<0.05)；第8周、12周、16周時，B組和D組低于A組，C組高于B組，D組低于C組(P<0.05)，A組與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，D組高于B組(P<0.05)。見表2。

Mr：分子量；A組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+(BMP-4/7 24 μg+纖維蛋白20 mg)；B組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+胎牛血清；C組：正常骨質(zhì)骨缺損+(BMP-4/7 24 μg +纖維蛋白20 mg)；D組：正常骨質(zhì)骨缺損+胎牛血清

圖1 Ⅰ型膠原蛋白的含量

2.4檢測骨缺損椎體生物力學(xué)性狀 第4周時，最大載荷量：B組和D組低于A組，C組高于B組，D組低于C組(P<0.05)，A組與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，D組高于B組(P<0.05)；最大應(yīng)變力：D組大于A組、B組、C組(P<0.05)，C組均高于B組，B組低于A組，A組和C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；彈性模量：C組高于A組、B組，D組低于C組(P<0.05)，A組、B組、D組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第8周、12周、16周時，最大載荷量、最大應(yīng)變力、彈性模量：B組和D組低于A組，C組均高于B組，D組低于C組(P<0.05)，A組與C組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，D組高于B組(P<0.05)。見表3。

2.5骨痂組織中Ⅰ型骨膠原蛋白含量與骨痂組織生物力學(xué)指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析 A組Ⅰ型骨膠原蛋白含量與最大載荷量、最大應(yīng)變量、彈性模量呈正相關(guān)(r=0.684，P=0.004；r=0.715，P=0.005；r=0.869，P=0.009；B組Ⅰ型骨膠原蛋白含量與最大負(fù)載荷量、最大應(yīng)變量、彈性模量呈正相關(guān)(r=0.613，P=0.021；r=0.752，P=0.032；r=0.674，P=0.029)；C組Ⅰ型骨膠原蛋白含量與最大載荷、最大應(yīng)變量、彈性模量呈正相關(guān)(r=0.592，P=0.005；r=0.727，P=0.008；r=0.806，P=0.006)；D組Ⅰ型骨膠原蛋白含量與最大載荷、最大應(yīng)變量、彈性模量呈正相關(guān)(r=0.684，P=0.004；r=0.882，P=0.007；r=0.712，P=0.003)。

組別第1周第2周第4周第5周第8周第12周A組13.8±0.328.7±1.958.2±5.751.9±3.533.6±2.625.8±3.9B組13.5±0.743.6±2.6a32.3±3.1a18.6±2.8a16.7±4.3a10.2±3.5aC組11.8±0.8ab22.8±1.6b56.7±5.3b48.7±4.9b26.8±3.8b21.1±1.6bD組12.5±0.9ab48.4±3.2ac38.9±2.7abc23.5±3.2abc22.4±3.8abc13.9±2.6abcF值21.440851.000216.9001047.000197.100141.300P值0.043<0.0010.005<0.0010.0050.007

A組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+(BMP-4/7 24 μg+纖維蛋白20 mg)；B組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+胎牛血清；C組：正常骨質(zhì)骨缺損+(BMP-4/7 24 μg+纖維蛋白20 mg)；D組：正常骨質(zhì)骨缺損+胎牛血清；a與A組比較，P<0.05；b與B組比較，P<0.05；c與C組比較，P<0.05

組別第4周第8周第12周第16周A組0.43±0.110.58±0.170.53±0.110.49±0.15B組0.38±0.08a0.46±0.19a0.31±0.12a0.18±0.06aC組0.39±0.09a0.55±0.13b0.47±0.16b0.35±0.13bD組0.41±0.09abc0.49±0.16abc0.41±0.09abc0.27±0.12abcF值29.31654.400105.32095.840P值0.0430.0330.0090.010

A組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+(BMP-4/7 24 μg+纖維蛋白 20 mg)；B組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+胎牛血清；C組：正常骨質(zhì)骨缺損+(BMP-4/7 24 μg +纖維蛋白20 mg)；D組：正常骨質(zhì)骨缺損+胎牛血清；a與A組比較，P<0.05；b與B組比較，P<0.05；c與C組比較，P<0.05

3 討 論

隨著我國人口的老齡化，在臨床上由骨質(zhì)疏松引起的椎體病理性骨缺損越來越常見[11]。但目前除手術(shù)治療外，尚無其他明確而有效的治療措施。故尋找有效減緩骨質(zhì)疏松進(jìn)程，早期預(yù)防和根本治療骨質(zhì)疏松性骨缺損的方法迫在眉睫。研究證實，BMP可以促進(jìn)骨膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，骨骼形成[12]。同時，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[13]，纖維粘連蛋白(fibronectin,FN)對體外培養(yǎng)骨纖維細(xì)胞的胞外基質(zhì)的表達(dá)具有明確的調(diào)節(jié)傾向，參與骨細(xì)胞分化，在維持組織形態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附性、生長及分化、增殖周期、基因表達(dá)中有重要作用。同時FN也是一種重要的連接元素，可有效促進(jìn)骨細(xì)胞與材料之間的黏合。

組別最大載荷量第4周第8周第12周第16周A組35.45±4.3267.54±4.35106.38±11.02126.63±8.75B組21.36±1.82a35.63±2.69a51.78±3.50a63.21±2.71aC組33.52±3.92b65.12±3.28b116.45±9.63b124.47±5.76bD組29.76±1.55abc43.76±2.01abc58.35±4.87abc71.29±3.82abcF值57.960758.100246.000490.400P值0.017<0.0010.0400.002組別最大應(yīng)變量第4周第8周第12周第16周A組15.27±2.1529.63±3.0931.91±2.2343.87±2.81B組11.36±1.62a16.47±0.92a18.92±2.53a24.83±3.08aC組16.84±3.25b28.73±2.99b42.15±2.54b46.36±2.87bD組28.73±2.99abc19.37±1.72abc23.31±3.58abc27.59±4.25abcF值296.600214.8001448.000700.600P值0.0030.005<0.001<0.001組別彈性模量第4周第8周第12周第16周A組47.85±2.6158.67±4.7269.24±2.5875.84±2.31B組46.52±3.5251.57±2.55a57.28±2.34a61.84±3.88aC組52.53±3.20ab56.48±2.64b68.53±3.03b73.18±3.26bD組48.81±4.27c54.37±4.33abc61.76±5.62abc64.66±4.35abcF值41.69016.79042.850172.900P值0.0230.0300.0230.006

A組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+(BMP-4/7 24 μg+纖維蛋白 20 mg)；B組：骨質(zhì)疏松性骨缺損+胎牛血清；C組：正常骨質(zhì)骨缺損+(BMP-4/7 24 μg +纖維蛋白20 mg)；D組：正常骨質(zhì)骨缺損+胎牛血清；a與A組比較，P<0.05；b與B組比較，P<0.05；c與C組比較，P<0.05

本研究結(jié)果顯示，A組與C組Ⅰ型骨膠原蛋白含量趨勢基本相同，B組和D組Ⅰ型骨膠原蛋白含量均明顯低于A組和C組，并于第4周即開始下降。提示FN可作為BMP-4/7的良好黏附和緩釋載體，可維持較長時間的BMP水平，使BMP-4/7更好地發(fā)揮成骨效應(yīng)[14]。同時，通過纖維蛋白為載體，BMP可在骨質(zhì)疏松環(huán)境下充分發(fā)揮促進(jìn)骨愈合的功能。本研究D組略高于B組，也符合骨質(zhì)疏松影響病理性骨缺損的愈合力能力的理論。

有研究報道，Ⅰ型骨膠原蛋白的合成峰過早和提前衰落可刺激機(jī)體破骨細(xì)胞的功能亢進(jìn)，促進(jìn)由成骨細(xì)胞引發(fā)的破骨細(xì)胞前體分化與融合，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，抑制成骨作用[15]。因BMP-4/7與FN復(fù)合物在骨質(zhì)疏松性骨缺損愈合過程中可長時有效維持骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡，因此具有更好的成骨功效，本實驗結(jié)果也驗證了這一點[16]。本研究結(jié)果顯示，A組骨密度在各時點間與C組比較其峰值和下降幅度未出現(xiàn)明顯差異，而B組骨密度值明顯下降，在傷后16周時最低。說明BMP4/7與FN復(fù)合物可有效改善骨質(zhì)疏松性骨缺損骨密度狀態(tài)。這與文獻(xiàn)中報道的BMP可抑制骨缺損骨纖維骨小梁間隙的增大，增加骨量，促進(jìn)骨形成的原理相一致[17-18]。

本研究中，A組最大載荷、最大應(yīng)變量、彈性模量較同時期(8、12、16周)和C組等同，B組和D組顯著低于A組。表明BMP4/7與FN復(fù)合物可明顯改善小鼠局部骨痂生物學(xué)性能。骨質(zhì)疏松性椎體骨骨小梁厚度及連續(xù)性增加，骨缺損愈合質(zhì)量明顯提高，致骨缺損區(qū)張力增強(qiáng)，椎體的力學(xué)性能增加，骨小梁抗載荷能力提高，不易骨折，可明確改善骨質(zhì)疏松性骨缺損愈合的骨強(qiáng)度和骨痂形狀，抗張力明顯增強(qiáng)[19]。本研究加入BMP-4/7與FN復(fù)合物后，Ⅰ型膠原蛋白的含量與骨痂組織的最大載荷、最大應(yīng)變量、彈性模量均呈高度直線相關(guān)，其相關(guān)性明顯高于未加入BMP-4/7與FN復(fù)合物組。提示融合基因BMP-4/7可以通過纖維蛋白作為有效載體，在一定程度上逆轉(zhuǎn)Ⅰ型膠原在骨質(zhì)疏松性骨缺損骨愈合過程骨礦化能力的下降，并提供良好的生物支架，減少BMP基因蛋白的丟失。這可能與纖維蛋白能夠充分作用于骨缺損的愈合骨痂表面，而加速鈣鹽等無機(jī)質(zhì)的沉積，增加骨缺損愈合的骨痂的抗張力、提升骨缺損愈合質(zhì)量等性能相關(guān)[20]。

綜上所述，以纖維蛋白為載體的BMP-4/7對大鼠椎體骨質(zhì)疏松性骨缺損愈合過程具有較強(qiáng)的促進(jìn)骨愈合作用。