王能，王志宇，張奉學(xué)，廖勉勉，何豫，張曉彤

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心，b.第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510006；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心，廣州 510060)

近年來，腫瘤干細胞相繼在乳腺癌、淋巴瘤、肝癌、食管癌等腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。這類細胞具有自我更新、多向分化的特點和強大的體內(nèi)致瘤性，被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的根本原因[1-3]。Al-Hajj等[4]通過表面分子標志CD44+/CD24-/Low/乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)1+分離并鑒定了人類乳腺癌干細胞，發(fā)現(xiàn)這群僅占癌細胞總數(shù)0.2%～0.8%的細胞具有極高的體內(nèi)致瘤能力，約是普通腫瘤細胞的100倍。研究顯示，乳腺癌干細胞與微RNA(microRNA，miRNA)調(diào)控密切相關(guān)[5]。miRNA是一類內(nèi)源性、保守性的非編碼小分子RNA，其主要通過與靶標信使RNA特異性的堿基配對，引起靶標信使RNA降解或抑制其翻譯過程而發(fā)揮調(diào)控作用，廣泛參與各種生理及病理生物學(xué)過程[6]。自噬是將細胞自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)包被入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹內(nèi)容物的過程[7]。目前研究表明，自噬活性可能對腫瘤干細胞功能有重要影響[8]。本研究以乳腺癌干細胞為研究對象，通過miRNA芯片篩選并鑒定與藥物敏感性相關(guān)的miRNA，通過實時自噬活性監(jiān)測、流式檢測及干細胞成球?qū)嶒灻鞔_miR-25介導(dǎo)自噬影響乳腺干細胞自我更新能力的作用。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng) MDA-MB-231乳腺癌細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，培養(yǎng)體系使用美國Gibco公司的高糖改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(批號：C11995500BT)，并添加10%南美胎牛血清(美國Gibco公司生產(chǎn)，批號：10270-106)和1%雙抗(美國Gibco公司生產(chǎn)，批號：PB180160)；前期已將MDA-MB-231乳腺癌細胞利用分子標記CD44+/CD24-/ESA+流式分選獲得其相應(yīng)干細胞，即MDA-MB-231乳腺癌干細胞[9]。本研究使用干細胞培養(yǎng)體系進行擴增培養(yǎng)，即高糖改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司生產(chǎn)，批號：C1330500BT)、5 μg/mL胰島素(武漢普諾賽生命科技有限公司生產(chǎn)，批號：PB180434)、20 μg/L人表皮生長因子(上海近岸科技有限公司生產(chǎn)，批號：P01133)、1%雙抗(美國Gibco公司生產(chǎn)，批號：PB180160)、0.4%牛血清蛋白(美國Sigma公司生產(chǎn)，批號：B2064)和B27(美國Gibco公司生產(chǎn)，批號：17504044)。非乳腺癌干細胞和MDA-MB-231乳腺癌干細胞(簡稱乳腺癌干細胞)均放置在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，根據(jù)細胞生長情況1～3 d換液。

1.2干細胞成球?qū)嶒?將103個數(shù)/孔的細胞用干細胞培養(yǎng)液重懸后，接種于低吸附培養(yǎng)板中培養(yǎng)至干細胞微球形成后，在倒置生物顯微鏡(福建麥克奧迪實業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，型號：AE2000)下觀察拍照。之后可將第一代干細胞微球通過機械吹打重新制備成單細胞懸液，重新形成第二代微球處理并進行拍照觀察。

1.3miRNA芯片及生物信息學(xué)分析 常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌干細胞和非乳腺癌干細胞后，采用miRNA微陣列芯片檢測miRNA的表達并對其表達譜進行差異性分析。具體方法為采用魯棒多芯片平均算法進行芯片標準化后，隨即對乳腺癌干細胞與非乳腺癌干細胞進行差異miRNA分析。由于乳腺癌干細胞組和非乳腺癌干細胞組分別為2個樣本，因此采用差異倍數(shù)的方法進行篩選，乳腺癌干細胞的均值/非乳腺癌干細胞的均值>3或≤0.333 3為差異miRNA。將獲得的差異miRNA按照5個數(shù)據(jù)庫(miRWalk、miRanda、miRDB、RNA22和Targetscan)預(yù)測其靶基因，并選擇5個數(shù)據(jù)庫同時支持的結(jié)果，隨后對獲得的靶基因進行基因本體論(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。GO富集分析利用Fisher精確檢驗和多重比較檢驗計算每個功能的顯著性水平(P)和誤判率，對靶基因進行基因功能注釋。顯著性篩選的標準為P≤0.05，誤判率≤0.05。通路富集分析基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對靶基因利用Fisher精確檢驗和χ2檢驗，將目標基因參與通路進行顯著性分析，按照P≤0.05進行篩選。

1.4miR-25檢測 ①miR-25的表達水平檢測：采用北京天根生化科技有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒(批號：DP501)對miRNA進行富集和提取?；パaDNA合成和定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測采用廣州易錦生物技術(shù)有限公司的miRNA定量試劑盒(批號：QP015)，其中miR-25引物(批號：HmiRQP0352)和內(nèi)參U6(批號：HmiRQP9001)均由該公司合成并提供。②miR-25的細胞轉(zhuǎn)染：分別將上海漢恒生物科技有限公司合成的miR-25類似物Mimics(批號：HH20190703GYQ-MIR01)及其陰性對照(Nc)(批號：HH20190703GYQ-MIR03)、miR-25抑制劑Inhibitor(批號：HH20190703GYQ-MIR02)及其陰性對照(Anti-Nc)(批號：HH20190703GYQ-MIR04)用無血清培養(yǎng)液稀釋，與稀釋后的RNAFit轉(zhuǎn)染試劑(上海漢恒生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：HB-RF-1000)室溫混合20 min后，加入接種對數(shù)生長期乳腺癌干細胞的6孔板中，37 ℃培養(yǎng)48 h后檢測。

1.5ALDH流式檢測 使用ALDEFLUOR試劑盒(加拿大Stemcell公司生產(chǎn)，批號：QCSH024)檢測ALDH干細胞比例變化。實驗分為miR-25類似物Mimics及其陰性對照(Nc)兩組，利用RNAFit轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染目的細胞后，將細胞重懸調(diào)整濃度為107個數(shù)/mL，與ALDH底物在37 ℃條件下共同孵育，每個檢測管均需設(shè)置對照管，即加入ALDH特異性抑制劑二乙氨基苯甲醛。反應(yīng)45 min后利用流式細胞儀(美國BD Biosciences公司生產(chǎn)，型號：FACSAria SORP)上機檢測。每組實際ALDH干細胞比例(%)=檢測管ALDH干細胞比例(%)-對照管ALDH干細胞比例(%)。

1.6實時自噬活性監(jiān)測 使用上海漢恒生物科技有限公司的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)自噬雙標腺病毒紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)-綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3(批號：HB-AP210 0001)感染目的細胞，48 h后觀察細胞自噬變化[7]。具體步驟為將105個數(shù)/孔的細胞用500 μL培養(yǎng)液重懸后接種至24孔板中，37 ℃過夜培養(yǎng)，使第2天細胞的生長匯合率為50%～70%。第2天進行病毒感染，根據(jù)感染復(fù)數(shù)加入相應(yīng)病毒量，24～48 h后利用共聚焦顯微鏡(德國卡爾蔡司公司生產(chǎn)，型號：Axio-Imager_LSM-800)對GFP和RFP的表達進行觀察。

1.7自噬相關(guān)蛋白表達的檢測 通過施加紫杉醇激活自噬，再向乳腺癌干細胞體系中施加miR-25 Mimics增加miR-25的表達或施加miR-25 Inhibitor降低其表達，使用蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中自噬相關(guān)蛋白的表達，分為空白對照組、紫杉醇組、Nc+紫杉醇組、Mimics+紫杉醇組、Anti-Nc+紫杉醇組和Inhibitor+紫杉醇組。主要步驟包括細胞總蛋白抽提、二喹啉甲酸法測定總蛋白含量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳制備和上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育及電化學(xué)發(fā)光顯影。其中，使用的一抗包括LC3(美國Proteintech公司生產(chǎn))、p62(美國Proteintech公司生產(chǎn))、UNC-51樣激酶1(UNC-51-like kinase 1，ULK1)(美國Proteintech公司生產(chǎn))和β-actin(美國CST公司生產(chǎn))，以及二抗兔或抗小鼠抗體(美國CST公司生產(chǎn))。所得結(jié)果采用Image J軟件(https://imagej.nih.gov/ij/)進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌干細胞的培養(yǎng)和觀察 與非乳腺癌干細胞相比，乳腺癌干細胞能在低吸附培養(yǎng)板的無血清培養(yǎng)液中持續(xù)傳代培養(yǎng)，表現(xiàn)為懸浮、生長的干細胞微球。將乳腺癌干細胞接種于無血清培養(yǎng)液(添加各種生長因子)中，細胞懸浮并形成松散細胞球團，2～8 d時形成進一步增殖的干細胞微球，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)微球呈圓球體，球內(nèi)細胞連接緊密，具有折光性，微球間具黏附性。與第2天(剛開始成球的時間)相比，第4 天和第8天的成球直徑明顯增加，分別是第2天的1.67倍和3.10倍，見圖1。

圖1 MDA-MB-231乳腺癌干細胞成球?qū)嶒?

2.2乳腺癌干細胞差異miRNA的篩選與驗證 通過miRNA微陣列芯片共篩選出131個差異miRNA，其中有56個上調(diào)miRNA，57個下調(diào)miRNA。圖中橫行為每個miRNA，縱列為每個樣本，顏色從綠到紅表示基因表達水平從低到高，并對基因進行了聚類(圖2A)。與非乳腺癌干細胞相比，一部分miRNA在乳腺癌干細胞上低表達，其中miR-25的表達在乳腺癌干細胞內(nèi)顯著下調(diào)約41%。為驗證miR-25對乳腺癌干細胞的影響，在向乳腺癌干細胞培養(yǎng)體系施加miR-25 Mimics提高其表達后，檢測ALDH干細胞比例。流式代表性結(jié)果顯示，Mimics組的乳腺癌干細胞水平顯著低于Nc組，表現(xiàn)為ALDH干細胞比例從5.90%跌至0.807%，Mimics組ALDH干細胞比例下調(diào)86.32%(圖2B)；同時，miR-25可以抑制乳腺癌干細胞的自我更新能力(圖2C)。相對于Nc組細胞，無論是哪一代干細胞球，施加miR-25 Mimics后細胞成球能力均顯著增強，表現(xiàn)為成球直徑明顯縮小。具體為：施加miR-25類似物Mimics后，第一代成球直徑從Nc組的(356±47)μm縮小至(174±25)μm；將第一代成球通過機械吹打形成單細胞懸液，形成第二代微球施加miR-25類似物Mimics后也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，成球直徑從(364±16)μm縮小至(200±4)μm。而施加miR-25抑制劑Inhibitor的結(jié)果與此相反，Anti-Nc組的第一代和第二代成球直徑分別為(330±4)μm和(318±23)μm，施加miR-25抑制劑Inhibitor后成球直徑分別變?yōu)?472±9)μm和(507±21)μm，Inhibitor組較Anti-Nc組分別增加約42.66%(t=20.246，P=0.002)和59.18%(t=8.453，P=0.014)。

2.3靶基因預(yù)測 差異的miRNA按照5個數(shù)據(jù)庫(miRWalk、miRanda、miRDB、RNA22和Targetscan)來預(yù)測其靶基因，并選擇5個數(shù)據(jù)庫同時支持的結(jié)果，去掉重復(fù)的共獲得4 565個靶基因。

2.4靶基因的GO富集分析 根據(jù)分析結(jié)果中靶基因顯著性功能、所含的基因數(shù)目及其在數(shù)據(jù)庫中的富集程度，按照P值排序構(gòu)建顯著性靶基因功能的柱狀分布圖，包括生物過程、分子功能和細胞組分三類。-LgP值越大表明P值越小，即該靶基因功能顯著性水平越高(圖中僅顯示按照-LgP排序最大的各前10項)。見圖3。

2.5靶基因的KEGG富集分析 本研究得到的顯著性通路包括腫瘤中的miRNAs、腫瘤通路、促分裂原活化的蛋白激酶信號通路、乳腺癌、細胞衰老、調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路、細胞周期、FoxO信號通路、Wnt信號通路、Hippo信號通路、Ras信號通路、p53信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路、自噬、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路、AMP活化的蛋白激酶信號通路、溶酶體、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白、Hedgehog信號通路(圖4)。其中，乳腺癌、細胞衰老、調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路、Wnt信號通路、Hippo信號通路、Hedgehog信號通路是乳腺癌干細胞中經(jīng)典通路；此外，自噬、促分裂原活化的蛋白激酶信號通路、FoxO信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路、AMP活化的蛋白激酶信號通路、溶酶體通路與自噬的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2.6自噬對乳腺癌干細胞的作用 乳腺癌干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得懸浮微球狀乳腺癌干細胞后，轉(zhuǎn)染2A：miRNA微陣列芯片；2B：施加miR-25類似物Mimics及其陰性對照Nc后，檢測MDA-MB-231乳腺癌干細胞中ALDH干細胞比例；2C：向MDA-MB-231乳腺癌干細胞體系中施加miR-25類似物Mimics增加miR-25的表達或施加miR-25抑制劑Inhibitor減少其表達后，檢測MDA-MB-231乳腺癌干細胞成球能力的變化；Nc：miR-25類似物對照組；Mimics：miR-25類似物組；DEAB：二乙氨基苯甲醛；SSC：側(cè)向角散射；FITC：異硫氰酸熒光素標記；Anti-Nc：miR-25抑制劑對照組；Inhibitor：miR-25抑制劑組LC3串聯(lián)熒光蛋白腺病毒，其中綠(GFP)和紅(RFP)用于標記及追蹤LC3，顯微鏡成像后紅綠熒光疊加后出現(xiàn)的黃色斑點即自噬小體，游離的紅色斑點即自噬溶酶體。乳腺癌貼壁細胞、乳腺癌干細胞及重新分化后乳腺癌干細胞的自噬活性程度為乳腺癌干細胞>重新誘導(dǎo)分化貼壁后乳腺癌干細胞>乳腺癌貼壁細胞(圖5A)。同時，紫杉醇可明顯增強乳腺癌干細胞上自噬流的強度；紫杉醇聯(lián)用自噬體抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)后乳腺癌干細胞中紅、綠熒光均減弱；而紫杉醇聯(lián)用自噬溶酶體抑制劑氯喹可阻斷自噬體與溶酶體融合，僅表現(xiàn)為紅熒光減弱，見圖5B。觀察成球能力發(fā)現(xiàn)，對照組、紫杉醇組、紫杉醇+3-MA組和紫杉醇+氯喹組成球直徑分別為(338±20)μm、(494±44)μm、(254±16)μm、(226±38)μm。與紫杉醇單藥組相比，紫杉醇聯(lián)用3-MA(t=7.274，P=0.018)或氯喹(t=6.519，P=0.023)均導(dǎo)致成球直徑縮小近1/2。

圖2 MDA-MB-231乳腺癌干細胞差異miRNA的尋找與驗證

2.7miR-25對乳腺癌干細胞自噬的作用 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，紫杉醇可以增加乳腺癌干細胞自噬活性，與空白對照組相比，紫杉醇組的LC3-Ⅱ表達水平升高且p62表達水平降低，見圖5C。施加miR-25 Mimics后可引起細胞內(nèi)自噬水平的降低，表現(xiàn)為LC3-Ⅱ表達水平顯著降低，p62表達水平升高。施加miR-25 抑制劑使miR-25表達下調(diào)后，乳腺癌干細胞自噬水平明顯提高。因TargetScan軟件預(yù)測miR-25與自噬早期調(diào)控基因ULK1之間存在結(jié)合互補序列，故通過觀察miR-25對ULK1表達的影響發(fā)現(xiàn)，與Nc+紫杉醇組相比，Mimics+紫杉醇組的ULK1蛋白表達明顯減少，即miR-25可減少因化療增加的ULK1表達。

3 討 論

腫瘤干細胞通過自我更新和分化能力維持著腫瘤的無限增殖，從而影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移[2]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌干細胞對化療或放療具有原發(fā)耐藥性[10]。miRNA在多種病理生理過程中(細胞增殖、干細胞分化、腫瘤形成)具有重要意義[5-6]。因此，高通量芯片鑒定乳腺癌干細胞相關(guān)的miRNA將為腫瘤治療提供新思路。本研究中，利用miRNA微陣列芯片共篩選出了131個與乳腺癌干細胞活性密切相關(guān)的差異miRNA。同時，利用多個數(shù)據(jù)庫對差異miRNA進行靶基因預(yù)測，將獲得的靶基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。GO數(shù)據(jù)庫又稱基因本體學(xué)數(shù)據(jù)庫，GO富集分析是通過樹狀分層的方式對基因及蛋白功能進行詳細描述，可篩選出目標基因群的顯著性功能[2，10]。KEGGmiRNA：微RNA；KEGG：京都基因與基因組百科全書；Gene number：基因個數(shù)；Rich factor：富集因子是系統(tǒng)分析基因(及其編碼產(chǎn)物)間關(guān)系、基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，可將基因及表達信息作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進行研究[11-12]。本研究結(jié)果顯示，基于GO和KEGG分別從基因功能和通路分析對差異靶基因生物學(xué)功能的解讀，提示miRNA影響乳腺癌干細胞活性的重要機制與自噬調(diào)控密切相關(guān)；同時發(fā)現(xiàn)多個顯著性信號通路(P≤0.05)，如促分裂原活化的蛋白激酶信號通路、FoxO信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路、AMP活化的蛋白激酶信號通路、溶酶體通路等均與自噬調(diào)控密切相關(guān)。前期研究表明，自噬可能是miRNA介導(dǎo)腫瘤耐藥的重要機制[8]。多條miRNAs，如miR-183、miR-376b、miR-106a、miR-31、miR-34c、miR-30a、miR-23b、miR-375等相繼被證明參與了調(diào)節(jié)腫瘤細胞自噬過程，其中miR-30a、miR-23b和miR-375可通過調(diào)節(jié)細胞自噬影響化療藥物或放療敏感性[13-14]。然而，目前自噬對腫瘤干細胞的調(diào)節(jié)作用及分子機制尚不清楚。有研究表明，自噬抑制可能破壞腫瘤干細胞的相對休眠狀態(tài)，促使其向腫瘤細胞分化，從而增強腫瘤化療敏感性[15]。本研究中，乳腺癌干細胞的自噬活性明顯高于重新分化后乳腺癌干細胞和乳腺癌貼壁細胞，且施加自噬抑制劑3-MA或氯喹均可削弱乳腺癌干細胞自我更新能力。因此，研究miRNA對乳腺癌干細胞內(nèi)自噬水平的調(diào)控，將為開發(fā)乳腺癌干細胞靶向策略提供理想靶標，也對提高乳腺癌的化療療效、降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險及改善預(yù)后和生活質(zhì)量具有積極意義。

miRNA：微RNA；GO：基因本體論

圖4 MDA-MB-231乳腺癌干細胞差異miRNA靶基因的KEGG通路富集分析

目前研究指出，miRNA的異常表達可能與miRNA基因的擴增、缺失、突變或表觀遺傳調(diào)控以及生物合成異常等密切相關(guān)[16-18]。本研究中，與非乳腺癌干細胞相比，部分miRNA在乳腺癌干細胞上低表達，其中miR-25是下調(diào)最明顯的miRNA之一。同時，miR-25可降低乳腺癌干細胞的比例及干細胞成球能力，且與細胞自噬活動密切相關(guān)。然而，miR-25的低表達是影響自噬進而影響乳腺癌干細胞自噬的機制還需進一步研究。首先，miR-25與自噬早期調(diào)控基因ULK1之間存在結(jié)合互補序列，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果揭示miR-25可以明顯降低ULK1的蛋白表達。因ULK1激活后可磷酸化BECN1激活含自噬相關(guān)蛋白14的Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶復(fù)合物，從而誘導(dǎo)自噬早期膜結(jié)構(gòu)的形成[19-21]。故推斷，miR-25低表達可通過激活ULK1介導(dǎo)早期自噬，從而影響乳腺癌干細胞干性(如化療耐藥)。其次，利用表遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)miR-25啟動子區(qū)存在明顯CpG島，推斷其異常表達可能與啟動子區(qū)域DNA甲基化調(diào)控有關(guān)。miR-25位于易發(fā)生miRNA甲基化的熱點染色體7q22.1上，在蛋白質(zhì)編碼基因MCM7初級轉(zhuǎn)錄本的第13個內(nèi)含子區(qū)，并與另外兩種成熟miRNA(miR-106b和miR-93)高度成簇存在于基因組內(nèi)[17]。Kunej等[17]指出，胃癌中miR-25的表達受其啟動子區(qū)域DNA甲基化的調(diào)控。Tsai等[18]研究發(fā)現(xiàn)，使用DNA去甲基化制劑處理AGS胃癌細胞后，miR-25表達水平升高了6.3倍。但對miR-25啟動子區(qū)甲基化位點分布以及miR-25甲基化對乳腺癌干細胞的作用仍需進一步探索。

綜上所述，乳腺癌干細胞與非乳腺癌干細胞之間miRNA存在明顯差異表達，其中miR-25的異常表達可能與自噬信號通路密切相關(guān)，進而影響乳腺癌耐藥進程。