周家明 ，歐景春 ，趙 愛 ，馬 妮 ，馮光泉

（1.文山學(xué)院三七研究院，文山663099；2.文山學(xué)院三七學(xué)院，文山663099）

三七是馳名中外的名貴藥材，其主要成分有三七皂苷、三七素、多糖、黃酮、蛋白質(zhì)等，以主根、根莖（三七剪口）入藥，生用可止血化瘀、消腫止痛，活血散瘀、抗衰老、降脂功效[1]。將三七作為此次化妝品配方中的主要藥材主要利用三七活血化瘀、抗衰老的功效?？鄥槎箍浦参锘睂倏鄥⒌母稍锔?，在本草綱目、神農(nóng)本草經(jīng)、本草匯言等著作中都有描述。苦參的有效成分主要是苦參堿，苦參具有清熱燥濕、殺蟲、利尿、消炎等功效，可用于熱痢、便血、黃疸、尿閉、赤白帶下，同時根據(jù)其殺蟲止癢的功效可用于陰腫瘙癢，各種皮膚病，根據(jù)其消炎的作用，將其放入化妝品中研究。白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬的多年生草本植物，在神農(nóng)本草中有描述，苦、溫、無毒，具有補(bǔ)氣健脾，燥濕利水、止汗、安胎、抗氧化、除熱、消食等功效；根據(jù)其功效，白術(shù)可用于健脾益氣、燥濕利水，脾虛食少、泄瀉便溏、胎動不安等，用于化妝品的研究主要是其具有抗氧化的作用。白及為蘭科植物白及干燥的塊莖為一種多年生草本植物，白及的有效部位主要是假鱗莖，有效成分主要是揮發(fā)油、多糖、具有豐富黏液質(zhì)的白芨膠等，白芨具有收斂止血，消腫生肌等功效。白蘞為葡萄科植物白蘞的干燥塊莖，主要是春秋二季采收，白蘞中的有效成分有酚酸類、黃酮類、蒽醌類[2]，同時還含有粘質(zhì)和淀粉、酒石酸、延胡索酸等有效成分，白蘞具有清熱解毒，散結(jié)止痛、斂瘡生肌的功效。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料及試劑

三七（文山三七市場）、白術(shù)（文山百姓超市）、白芨（文山百姓超市）、白蘞（云南穗民生物科技開發(fā)有限公司）、苦參（昆明道地中藥飲片廠）；磷酸二氫鉀（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、氫氧化鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、L-酪氨酸（上海新興化工試劑研究所）。

1.2 儀器與設(shè)備

759s型紫外/可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）DLSB低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司）FA2004電子天平 （上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵（鞏義市子華有限責(zé)任公司）HH-600數(shù)顯恒溫水箱（金壇市大地自動化儀器廠）DZF-6020真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）XL5A型湘立離心機(jī) （湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 中藥樣品浸膏的制備

1.3.1 藥材前處理與溶液的配制

分別取150g三七、白術(shù)、白及、白蘞、苦參打粉，過20目篩，備用。pH6.8的磷酸緩沖液：精密稱取磷酸二氫鉀25g，加入125ml的蒸餾水即得0.2ml/l的磷酸二氫鉀溶液，再稱取11.6g的NaOH加入58ml的蒸餾水即得0.2mol/l的NaOH溶液，將兩種混合用500ml的蒸餾水稀釋，搖勻，即得。

1.3.2 三七的提取物的制備

將從三七市場購買來的60頭干燥三七粉碎，過10目篩，取150g藥粉，精密稱定，置于2000ml蒸餾燒瓶中，以70%的乙醇為有機(jī)溶劑提取液[3]，回流提取3次，每次 2h，溫度為 85℃，第一次按照料液比 1∶10，第二次、第三次用料液比1∶8，合并乙醇提取液，合并的乙醇提取液按20倍的比例濃縮，將藥液放于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中70℃的條件下濃縮（2800ml的濃縮成140ml的），回收溶劑。將濃縮液分別置于三個鐵瓷盤中，于66℃的真空干燥箱中干燥，每小時對真空干燥箱進(jìn)行排氣一次，同時不斷地觀察干燥的程度，隨后即得浸膏。

1.3.3 白芨的提取物的制備

干燥白芨于粉碎機(jī)中粉碎并過10目篩，取150g藥粉，精確稱定，置于2000ml蒸餾燒瓶中，浸泡30min后，用蒸餾水回流提取90min[4]，共提取3次，第一次按照料液比為1∶10加入1500ml的蒸餾水，第二次、第三次按照料液比1∶8分別加入蒸餾水，然后把蒸餾燒瓶置于水浴鍋中回流加熱提取，加熱溫度為100℃，提取液合并抽濾，濾液在溫度為85℃的條件下按照20倍的比例濃縮。把濃縮液分別放入鐵瓷盤中置于真空干燥箱中干燥，溫度為65℃。每小時對真空干燥箱進(jìn)行排氣一次，同時不斷地觀察干燥的程度，即得白芨浸膏。

1.3.4 白蘞的提取物的制備

干燥白蘞于粉碎機(jī)中粉碎并過10目篩，取150g藥粉，精確稱定，置于2000ml蒸餾燒瓶中，浸泡30min后，用蒸餾水回流提取90min，共提取3次，第一次按照料液比為1∶10加入1500ml的蒸餾水，第二次、第三次按照料液比1∶8分別加入蒸餾水，然后把蒸餾燒瓶置于水浴鍋中回流加熱提取，加熱溫度為100℃，提取液合并抽濾，濾液在溫度為85℃的條件下按照20倍的比例濃縮。把濃縮液分別放入鐵瓷盤中置于真空干燥箱中干燥，溫度為65℃。每小時對真空干燥箱進(jìn)行排氣一次，同時不斷地觀察干燥的程度，即得白蘞浸膏。

1.3.5 白術(shù)的提取物的制備

干燥白術(shù)于粉碎機(jī)中粉碎過10目篩，取150g藥粉，精確稱定，藥材粉末放到2000ml蒸餾燒瓶中，回流提取3次，每次2h，溫度為55℃，第一次按照料液比為1∶10加入 1500ml的 80%的乙醇，用 0.2mol/l的 NaOH將溶液的PH調(diào)為7[5]，同樣的條件下，第二次、第三次的料液比調(diào)為1∶8，然后把蒸餾燒瓶置于水浴鍋中回流加熱，把提取液合并抽濾，濾液以20倍的比例，在50℃的條件下濃縮，最后將濃縮液分別置于三個鐵瓷盤中，放于真空干燥箱中45℃的條件下干燥，即得浸膏。

1.3.6 苦參的提取物的制備

干燥苦參于粉碎機(jī)中粉碎過10目篩，取150g藥粉，精確稱定。把過篩的藥材粉末放到2000ml蒸餾燒瓶中，以60%乙醇回流提取3次，每次2h，第一次料液比為 1：10，第二次料液比為 1：8，溫度為 85℃[6]。 將提取液用真空抽濾瓶抽濾，抽濾液以75℃的溫度濃縮，然后在將濃縮液抽濾（因?yàn)榭鄥儆诓荼?，濾渣較多），最后將濃縮液平分于鐵瓷盤中，在真空干燥箱中70℃的條件下干燥，苦參浸膏的制備即完成。

1.4 酪氨酸酶活性的測定

0.15 %ml/l的L-酪氨酸溶液的配置：取0.0015gL-酪氨酸，精密稱定，緩慢、多次、少量的加入100ml的蒸餾水，搖勻即可。

1.4.1 酪氨酸酶的制備

將馬鈴薯洗凈，去皮，切成邊長約1cm的塊狀，于-20℃冷凍過夜，稱重按 1∶1（w：v）的比例加入 4℃預(yù)冷的磷酸緩沖液（20g的土豆加入20ml的緩沖液），快速勻漿，用3成紗布過濾，濾液于3500r/min離心15min，上清液即為所得的酪氨酸酶粗酶液，用移液管移取10ml上清液裝在25ml棕色容量瓶中，用（Ph6.8）的磷酸緩沖液定容，冰水浴備用，2h內(nèi)用完。

1.4.2 吸光度的測定方法

測定含有酪氨酸試液樣的吸光度。在酪氨酸酶反應(yīng)生成黑色素的過程中，酪氨酸酶的催化作用主要發(fā)生在酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴以及多巴轉(zhuǎn)化為多巴醌這兩個反應(yīng)中，多巴醌是一有色物質(zhì)，可以用分光光度計(jì)（475nm）測定[7]。先將膏狀中藥提取物用蒸餾水稀釋至濃度為1mg/ml的溶液，在試管中把稀釋的藥品按照一定的比例配方（三七∶白術(shù)∶白芨∶白蘞∶苦參=3∶2∶2∶2∶1）混合，搖勻，備用。

按表1準(zhǔn)確吸取中藥樣品，pH6.8磷酸鹽緩沖液和0.15%L-酪氨酸溶液，充分混勻，在室溫條件下靜置10min后，加入0.6ml土豆上清液，搖勻，再在室溫下靜置10min，PBS為參比，迅速轉(zhuǎn)移至比色皿中，在475nm處測吸光度，做3個平行樣。

表1 -1待測液的組成

利用各組吸光度，通過計(jì)算得出酪氨酸酶抑制率，其計(jì)算公式如下（1-1）：

（1-1）

A組：未加中藥樣品的加酶混合液；B組：未加中藥樣品亦未加酶的混合液；C組：加中藥樣品和酶的混合液；D組：加中藥樣品未加酶的混合液。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用紫外分光光度法測定中藥樣品對酪氨酸酶的抑制率，包括最大值、最小值、平均值等，通過采用求平均值對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的進(jìn)行比較、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)處理

表2 -1藥品所測的吸光度數(shù)值

表2 -2樣品所測的吸光度

表2 -3樣品所測的吸光度

表2 -4中藥提取物對酪氨酸酶活性抑制率測定（%）

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

采用紫外分光光度計(jì)測定中藥樣品對酪氨酸酶活性的抑制率，每個樣品測定三次，每次做三個平行試樣，根據(jù)表5所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，表明三七、白術(shù)、白芨、白蘞、苦參（3∶2∶2∶2∶1）比例配方的中藥樣品的混合物對酪氨酸酶具有一定的抑制率，平均抑制率的數(shù)據(jù)為34.6%。該數(shù)據(jù)為化妝品的研究及開發(fā)提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)支持，對酪氨酸酶具有一定的抑制率，說明此次實(shí)驗(yàn)的研究配方的初步結(jié)果表明了文山道地藥材三七，七白膏中選取的三白，加上具有消炎作用的苦參具備一定的美白祛斑功效。

3 結(jié)論

3.1 對于現(xiàn)在人們存在的皮膚問題越來越嚴(yán)重，同時人們的生活水平的層次也在不斷的提高，化妝品行業(yè)暴露的問題也越來越嚴(yán)重，特別是美白祛斑的化學(xué)物質(zhì)的副作用的程度也在擴(kuò)大的過程中，加上我國在運(yùn)用中藥治療和護(hù)理各種皮膚病上已有幾千年的歷史[8]，這些為科學(xué)研究者尋找天然的美白活性物質(zhì)提供了一定的基礎(chǔ)。

3.2 本文在藥材的提取方面有些損失，特別是白芨、白蘞的提取液屬于黏液質(zhì)，在過濾的時候，白芨、白蘞損失特別嚴(yán)重，同時苦參的過濾由于粉末較多，也導(dǎo)致?lián)p失嚴(yán)重。

3.3 另一方面使用的酪氨酸酶不是酪氨酸酶制劑，而是用馬鈴薯提取制備的酪氨酸酶，這方面對于檢測的結(jié)果略有些影響，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定條件都是一定的，所以得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也是相對的，在沒有酪氨酸酶制劑的情況下，本次試驗(yàn)也可以作為化妝品在研究開發(fā)方面初步選擇藥材的方法。