李延利 張海琪 呂孫建 林 鋒 劉 莉 袁雪梅 蘇勝齊

一株引起清溪烏鱉()“搖頭病”致病菌的分離鑒定與藥敏分析*

李延利1, 2張海琪1①呂孫建1林 鋒1劉 莉1袁雪梅1蘇勝齊2

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 湖州 313001; 2. 西南大學(xué)動物科技學(xué)院 重慶 400715)

從患“搖頭病”清溪烏鱉()的肝臟、脾臟、腎臟、肺組織中分離得到1株細菌。菌落為圓形乳白色凸起, 融蠟狀, 表面光滑, 邊緣清晰整齊; 對該菌進行染色鏡檢可見其為革蘭氏陽性桿菌, 呈單個或鏈狀排列。結(jié)合生理生化檢測結(jié)果、16S rDNA基因和基因和基因序列分析以及系統(tǒng)進化樹結(jié)果, 該菌株為蠟樣芽孢桿菌群(group)內(nèi)新種。用不同濃度的分離菌腹腔注射感染健康的清溪烏鱉, 觀察發(fā)現(xiàn)死亡的清溪烏鱉出現(xiàn)與自然發(fā)病鱉相似的癥狀且從病鱉內(nèi)臟中可分離得到同樣的菌; 經(jīng)統(tǒng)計和計算, 其LD50為2.42×105CFU/kg體重。應(yīng)用紙片擴散法對14種常用抗菌藥物進行藥敏試驗, 結(jié)果顯示, 分離菌對頭孢氨芐、氟苯尼考、強力霉素、恩諾沙星、氧氟沙星五種藥物敏感; 對利福平、頭孢他啶則耐藥。本研究為清溪烏鱉細菌性病原的報道, 旨在為該病的確診與防治提供科學(xué)依據(jù)和參考。

清溪烏鱉(); 蠟樣芽孢桿菌(); 分離鑒定; 藥敏分析

清溪烏鱉()為全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定的中華鱉國家水產(chǎn)新品種, 品種登記號為GS01-003-2008 (何中央, 2015; Gui, 2018)。該品種的育種基礎(chǔ)群體為1992年在浙江德清野外采集到個別中華鱉腹部呈深淺不一的灰黑色個體, 經(jīng)多年收集、培育形成一定數(shù)量的群體。1998年項目單位開始挑選360只腹部灰黑色的中華鱉構(gòu)建基礎(chǔ)群體, 應(yīng)用個體選擇、家系選擇, 并輔以分子標記基因型選擇等技術(shù)進行選育。經(jīng)5代選育腹部灰黑色性狀穩(wěn)定遺傳, 體色不再分化, 育成腹部灰黑色、營養(yǎng)豐富的清溪烏鱉(Gui, 2018)。清溪烏鱉的典型特征包括以下方面: 一是腹部烏黑色, 富含黑色素; 二是含血量多, 同等規(guī)格時大約是普通中華鱉血量的2倍, 因而其血液載氧能力提高了1倍多, 生產(chǎn)上表現(xiàn)出好動及好斗的特性; 三是肉質(zhì)堅實, 口感佳, 味道鮮美, 必需氨基酸和不飽和脂肪酸成分含量高, 尤其是二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)總量比常見養(yǎng)殖種高20%以上(張海琪等, 2008)。自2008年國家水產(chǎn)新品種審定以來, 清溪烏鱉憑著其較高的營養(yǎng)價值, 深受消費市場認可, 已成為中華鱉養(yǎng)殖業(yè)品種結(jié)構(gòu)優(yōu)化的一種重要品種, 在全國各地推廣(張海琪等, 2008)。清溪烏鱉生性兇猛好斗, 適合于低密度稀養(yǎng), 目前的主要養(yǎng)殖方式為池塘低密度養(yǎng)殖、兩段法養(yǎng)殖、蝦鱉混養(yǎng)和鱉稻綜合種養(yǎng)(何中央, 2015)。鑒于清溪烏鱉特殊的腹部黑色性狀, 清溪烏鱉成為中華鱉遺傳育種研究的良好材料, 并被用作國家水產(chǎn)新品種中華鱉“浙新花鱉”的選育親本(何中央等, 2017; Zhang, 2017a, b)。

目前有關(guān)清溪烏鱉的研究主要集中在養(yǎng)殖性能(薛輝利等, 2009), 營養(yǎng)成分(張海琪等, 2008; 黃福勇等, 2011), 群體遺傳多樣性(張海琪等, 2011; 孟慶輝等, 2013; 徐建, 2015; Zhang, 2017a, b), 線粒體基因如線粒體細胞色素基因、12S rRNA基因、16S rRNA基因、COⅠ基因序列(張永正等, 2008; 許曉軍等, 2012; 張超等, 2014; Zhang, 2015; 唐偉等, 2017), 生長與繁育特性(張海琪等, 2011, 2014; 何中央, 2015; Zhang, 2017a, b; 嚴維輝等, 2018), 色素、免疫及生長等相關(guān)基因研究(張永正等, 2009; Zhang, 2017a, b; 田儒品等, 2018)。由于養(yǎng)殖推廣歷史較短, 清溪烏鱉的病害研究至今未見有報道。但2018年以來, 清溪烏鱉的病害開始陸續(xù)出現(xiàn), 其中以“搖頭病”(head-shaking syndrome)最為典型, 其主要特征為浮于水面、反應(yīng)遲鈍、四肢無力、不斷搖頭而死亡。該病具有發(fā)病快、危害大的特點, 死亡率最高可達100%, 給養(yǎng)殖戶帶來了較大的經(jīng)濟損失。針對清溪烏鱉養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的這種病癥, 本研究2018年7月從浙江省湖州市某清溪烏鱉養(yǎng)殖場采集到了典型性的病鱉樣品, 從患病清溪烏鱉的肝臟、脾臟和腎臟等組織分離到同一種優(yōu)勢細菌, 通過對該菌株進行分離純化、生理生化分析、基因擴增測序Blast比對、人工攻毒回感試驗及病原菌藥敏試驗等一系列生物學(xué)特性研究, 旨在闡明該病原菌的致病機制, 為該病的臨床診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

患病清溪烏鱉()來源于浙江省湖州市某清溪烏鱉養(yǎng)殖場, 體質(zhì)量0.5— 0.8kg。健康清溪烏鱉來源于同一養(yǎng)殖場, 體質(zhì)量0.5—0.75kg, 在水溫24—28°C、溶氧7.18mg/L 的塑料桶內(nèi)暫養(yǎng)10d, 觀察期間無發(fā)病和死亡后用于感染試驗。胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司; 恒溫培養(yǎng)箱購自日本三洋公司; 臺式恒溫振蕩器購自上海精宏公司; 革蘭氏染色液試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司; 細菌基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶均購自TIANGEN公司; 藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司; 實驗中所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

用接種環(huán)無菌采集病鱉的肝、脾、肺、腎等病變臟器組織, 于TSA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。30°C培養(yǎng)12h后接種的培養(yǎng)基上可見多個菌落。觀察菌落形態(tài), 挑取優(yōu)勢菌落革蘭氏染色后鏡檢, 并對單菌落進行分離、純化、增菌培養(yǎng), 保存, 備用。

1.3 病原菌16S rRNA、gyrB和rpoB序列的PCR擴增和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

挑取單菌落接種到20mL液體培養(yǎng)基中, 30°C、200 r/min振蕩培養(yǎng)12h后12000r/min離心5min收集菌體。參照試劑盒說明書提取其基因組DNA。擴增16S rDNA、和基因序列所用的引物(Massol-Deya, 1995; Larsen, 2014)見表1。PCR反應(yīng)體系為100μL, 包含10×PCR Buffer緩沖液10μL, 2.5mmol/L dNTPs 8μL, 10μmol/L引物對各2μL, 模板DNA 2.5ng, Taq酶4U, 用ddH2O補足到100μL。

表1 擴增所用引物

Tab.1 Primers for amplification

*注: R為G or A; Y為C or T; W為A or T; D為G or A or T; H為A or C or T; B為G or Tor C; V為G or C or A; N為A or C or G or T

16S rDNA PCR反應(yīng)條件為: 95°C預(yù)變性5min, 95°C變性60s, 57°C退火60s, 72°C延伸80s, 30個循環(huán), 72°C延伸5min?；蛐蛄蟹磻?yīng)條件: 95°C預(yù)變性5min, 95°C變性60s, 48°C退火60s, 72°C延伸90s, 33個循環(huán), 72°C延伸10min?；蛐蛄蟹磻?yīng)條件: 95°C預(yù)變性5min, 95°C變性45s, 46°C退火45s, 72°C延伸80s, 33個循環(huán), 72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后對目標條帶回收純化, 送由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行基因序列測定。利用MEGA7軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建其與相近種基因的系統(tǒng)進化樹, 進行1000次的Bootstrap檢驗置信度。

1.4 生理生化鑒定

對菌株進行革蘭氏染色, 隨即用油鏡觀察, 進行革蘭氏鑒定。同時委托北京麥克羅科技有限公司利用Biolog全自動細菌鑒定儀對分離菌進行生理生化鑒定。

1.5 人工感染試驗及半致死濃度的測定

為確定該細菌對清溪烏鱉的半數(shù)致死量, 選取40只同一養(yǎng)殖場的健康清溪烏鱉作為感染對象, 分為4組, 每組10只。分別對3組實驗組烏鱉腹腔注射0.2mL濃度為7.86×107、7.86×105、7.86×103CFU/mL的菌懸液; 同時對照組注射相同劑量的無菌PBS。每天觀察其是否發(fā)病癥狀, 并記錄死亡情況, 連續(xù)觀察15d。在清溪烏鱉出現(xiàn)癥狀時取其肝臟、脾臟、腎臟、肺等組織進行病原菌的分離培養(yǎng)與鑒定, 以確定是該細菌致病引起死亡。

1.6 藥敏試驗

采用紙片擴散法對14種常用抗菌藥物進行藥敏試驗(中華人民共和國衛(wèi)生部, 2000; 馬緒榮等, 2001), 培養(yǎng)10—12h測量各藥物的抑菌圈大小。每種藥物均設(shè)定3個平行試驗組, 根據(jù)其抑菌圈大小判定各藥物對該細菌的作用。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離及形態(tài)觀察

觀察發(fā)現(xiàn)從患病清溪烏鱉肝臟、脾臟、腎臟、肺中分離到的菌為同一菌株, 命名為XS0724。該菌在TSA培養(yǎng)基上生長良好, 經(jīng)過12h培養(yǎng)后, 出現(xiàn)菌落為圓形乳白色凸起, 融蠟狀, 表面光滑, 邊緣清晰整齊(見圖1a)。革蘭氏染色結(jié)果表明, 該細菌為革蘭氏陽性菌, 有芽孢, 呈桿狀, 單個或鏈狀排列(見圖1b)。

圖 1 分離菌形態(tài)觀察(a)及革蘭氏染色鏡檢(b)

2.2 功能基因序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

2.2.1 16S rDNA基因分析 對該分離菌的16S rDNA基因進行PCR擴增, 測序獲得大小為1407bp DNA序列(見圖2)。用MEGA 7軟件對該序列與22種相似菌的16S rDNA序列進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建, 結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示, 該細菌與N24T聚在同一分支。

2.2.2B基因分析 對該分離菌的基因進行PCR擴增, 測序獲得大小為833bp DNA序列(見圖4)。用MEGA 7軟件對該序列與7種相似菌的基因序列進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建(見圖 5)。結(jié)果顯示, 該細菌先與BCT-7112T和IAM 12077T聚在一起, 然后與ATCC 6462T相聚。

2.2.3B基因分析 對該分離菌的B基因進行PCR擴增, 測序獲得大小為983bp DNA序列(見圖6)。用MEGA 7軟件對該序列與7種相似菌的B基因序列進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建(見圖 7)。結(jié)果顯示, 該細菌先與ATCC 10792T和ATCC 14579T聚在一起, 然后與str. VollumT相聚。

2.3 生理生化鑒定結(jié)果

細菌生理生化鑒定結(jié)果顯示, 該細菌接觸酶反應(yīng)陽性, 氧化酶反應(yīng)陽性。其他生化譜見表2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 菌株XS0724能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、果糖、纖維二糖, 不發(fā)酵甘露糖、龍膽二糖、蔗糖、巖藻糖、半乳糖。綜合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性分析發(fā)現(xiàn), 分離菌株與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》蠟樣芽孢桿菌描述基本一致, 結(jié)果進一步表明該細菌為芽孢桿菌類。

圖2 分離菌16S rDNA基因擴增測序結(jié)果

圖3 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)進化樹(Neighbor-Joining法)

圖4 分離菌gyrB基因擴增測序結(jié)果

圖5 基于gyrB基因序列的系統(tǒng)進化樹(Neighbor-Joining法)

2.4 人工感染試驗

實驗組清溪烏鱉在腹腔注射感染后, 7.86×107CFU/mL組4d內(nèi)全部死亡。15d觀察結(jié)束后, 7.86×105CFU/mL組50%死亡, 7.86×103CFU/mL組20%死亡; 而PBS對照組試驗期間未出現(xiàn)死亡。根據(jù)上述結(jié)果, 此株細菌對清溪烏鱉的LD50為2.42×105CFU/kg體重。瀕死烏鱉出現(xiàn)浮出水面、脖頸伸長、不斷搖頭現(xiàn)象, 剖檢發(fā)現(xiàn)其脾臟充血腫脹, 腸管壁充血, 與自然發(fā)病癥狀相似。同時, 從病鱉的肝臟、脾臟、腎臟、肺等組織均可再次分離到該細菌。表明該細菌為清溪烏鱉患“搖頭病”的致病菌。

圖6 分離菌rpoB基因擴增測序結(jié)果

圖7 基于rpoB基因序列的系統(tǒng)進化樹(Neighbor-Joining法)

表2 細菌生理生化鑒定結(jié)果

Tab.2 Physiological and biochemical identification of bacteria

續(xù)表

注：+表示陽性, -表示陰性, w表示弱陽性

2.5 藥敏試驗

14種藥物的藥敏試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn), 該菌對頭孢氨芐、氟苯尼考、強力霉素、恩諾沙星、氧氟沙星高度敏感, 對于麥迪霉素、呋喃妥因、妥布霉素、卡那霉素、呋喃唑酮、慶大霉素、萬古霉素中度敏感, 對于利福平、頭孢他啶耐藥(表3)。

表3 細菌分離株的藥物敏感性

Tab.3 Antimicrobial susceptibility of the bacteria

注：S表示敏感, I表示中敏, R表示耐藥

3 討論

3.1 蠟樣芽孢桿菌的致病性

蠟樣芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性桿菌, 常見于土壤、灰塵、污水、飼料、植物和各類生熟食品中(Stiles, 2014)。分為無毒菌株和有毒菌株。無毒菌株作為益生菌, 在進入動物腸道后, 可影響腸道免疫細胞對細胞因子的分泌, 并且可產(chǎn)生抗菌肽等抗菌物質(zhì)來增強機體的免疫能力, 是我國批準生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種之一, 已在水產(chǎn)養(yǎng)殖上廣泛應(yīng)用(張惠云, 2000; 劉秀花, 2005; 李研東等, 2008; 張洪玉等, 2018)。有毒菌株作為條件致病菌, 含有溶血性腸毒素基因基因、非溶血性腸毒素基因基因、腸毒素基因基因和基因(劉芳等, 2016)。有毒菌株主要通過毒力基因產(chǎn)生腹瀉毒素和嘔吐毒素導(dǎo)致食物中毒, 也可通過菌體感染引起人的眼部疾病、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和敗血癥等疾病(李鳳鳴, 1996; Schoeni, 2005; 高景枝等, 2008; 陸湘華等, 2015)。此外, 還會引起養(yǎng)殖牛、豬、羅非魚、中華鱉、刺參等動物感染致病, 給養(yǎng)殖業(yè)和食品安全帶來嚴重危害(曹伯宏等, 2004; 駱藝文等, 2009; 趙振宇等, 2014; 楊移斌等, 2017; 孟慶珍等, 2019)。本研究也從患病的清溪烏鱉內(nèi)臟組織分離到優(yōu)勢致病菌, 與中華鱉、刺參等所報道的一致。鑒于蠟樣芽孢桿菌包含有毒菌株和無毒菌株, 作為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用前應(yīng)首先確定菌株的安全性, 同時, 由于蠟樣芽孢桿菌可引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動物感染致病, 應(yīng)引起研究者、養(yǎng)殖者的高度重視。

3.2 清溪烏鱉“搖頭病”的發(fā)病原因及防控技術(shù)

清溪烏鱉原產(chǎn)于太湖流域, 典型特征是腹部烏黑, 富含黑色素, 為浙江省特有地方品種, 其營養(yǎng)豐富, 肌肉氨基酸總量、必需氨基酸、呈味氨基酸和蛋氨酸含量較高(張海琪等, 2008)。清溪烏鱉數(shù)量少, 苗種售價比普通鱉苗高出1倍以上, 商品鱉售價則高達200元/kg以上, 因此近年來備受廣大養(yǎng)殖戶的關(guān)注, 成為養(yǎng)鱉業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的重要養(yǎng)殖品種。清溪烏鱉養(yǎng)殖剛剛興起, 還未見有其感染細菌病的報道, 但隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 其病例可能呈不斷上升趨勢。本研究從患病清溪烏鱉內(nèi)臟組織中分離到一株優(yōu)勢菌, 可復(fù)制與其自然發(fā)病相似的癥狀, 證實其為導(dǎo)致清溪烏鱉“搖頭病”的病原菌。經(jīng)過細胞形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征、16S rDNA序列、和功能基因序列等鑒定分析, 確定該菌株為蠟樣芽胞桿菌群(group)內(nèi)新種。如需進一步確定, 還需測定該菌株的全基因組序列來比較DNA-DNA同源性和ANI數(shù)值。研究者結(jié)合多年的養(yǎng)殖實踐認為, 清溪烏鱉“搖頭病”的發(fā)病原因可能存在以下兩個方面: (1) 蠟樣芽胞桿菌作為條件致病菌, 廣泛存在于養(yǎng)殖環(huán)境中。清溪烏鱉因某些因素(如飼料來源和水源污染、環(huán)境溫度、應(yīng)激及其他病原感染等)導(dǎo)致鱉機體免疫力下降, 引發(fā)該菌繼發(fā)性感染, 使鱉體發(fā)病。(2) 由于養(yǎng)鱉場沒有精準用藥, 可能存在濫用抗生素及給藥方式不當, 導(dǎo)致臨床治療失敗。本研究藥敏試驗表明, 該菌對頭孢氨芐、氟苯尼考高度敏感, 在生產(chǎn)上采用二氧化氯消毒水體, 口服氟苯尼考和頭孢氨芐, 連用5d后病害得到有效控制, 這些為清溪烏鱉“搖頭病”的防治及其健康養(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究鑒定并證明蠟樣芽孢桿菌可導(dǎo)致清溪烏鱉“搖頭病”的發(fā)生, 因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中蠟樣芽孢桿菌作為益生菌使用前應(yīng)首先確定菌株的安全性, 以免引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動物感染致病; 若感染該菌, 可采用二氧化氯消毒水體, 口服氟苯尼考和頭孢氨芐進行疾病的控制。本研究為清溪烏鱉“搖頭病”的病因及治療提供了理論依據(jù)。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PATHOGEN CAUSING “HEAD-SHAKING SYNDROME” OFAND DRUG SUSCEPTIBILITY ANALYSIS

LI Yan-Li1, 2, ZHANG Hai-Qi1, Lü Sun-Jian1, LIN Feng1, LIU Li1, YUAN Xue-Mei1, SU Sheng-Qi2

(1. Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China; 2. College of Animal Science and Technology, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A strain of bacteria was isolated from the liver, spleen, kidney, lung of diseasedwith “head-shaking syndrome”. The bacterial colonies were round milky white bulge, waxy, smooth, and the edge was clear and neat. The bacteria was Gram-positive in single or chain arrangement in staining microscopy. Combined with the results of physiological and biochemical test, sequence analysis of the 16S rDNA gene,gene andgene, and phylogenetic grouping, the strain was confirmed as a new species ofgroup. Different concentrations of isolated bacteria were used to intraperitoneally inject into healthy, and it was observed that the deadshowed symptoms similar to those naturally diseased ones in the farming, and the same bacteria were isolated from the viscera of the diseased. According to statistics and calculation, the LD50was 2.42×105CFU/kg. Results show that the isolates were sensitive to cefalexin, florfenicol, doxycycline, enrofloxacin, and ofloxacin, and resistant to rifampicin and ceftazidime. This study is a report on the bacterial pathogen of, and may provide a scientific basis and reference for the diagnosis and treatment of the disease.

;; separation and identification; antimicrobial susceptibility test

* 浙江省水產(chǎn)新品種選育重大專項項目, 2016C02055-4號; 浙江省公益類科研院所扶持專項, 2019YSZX004號。李延利, 碩士研究生, E-mail: yanlili93@163.com

張海琪, 博士, 正高級工程師, E-mail:zmk407@126.com

2019-12-27,

2020-01-26

S974.1

10.11693/hyhz20191200281