陳凱鋒 董迎輝 姚韓韓 林志華 孫長森

縊蟶()氨氮脅迫應(yīng)答miR- 8245a-5p靶基因驗(yàn)證及其表達(dá)特征分析*

陳凱鋒1董迎輝1姚韓韓1林志華1孫長森2①

(1. 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315100; 2. 浙江萬里學(xué)院 寧海海洋生物種業(yè)研究院 寧波 315604)

為鑒定縊蟶()氨氮脅迫應(yīng)答相關(guān)miRNA靶基因及其表達(dá)特征, 選擇氨氮脅迫下縊蟶肝胰腺組織中表達(dá)水平差異顯著的miR-8245a-5p進(jìn)行研究。靶基因驗(yàn)證結(jié)果顯示, 縊蟶基因表達(dá)量極顯著高于未脅迫組(<0.01), 表明是miR-8245a-5p的靶基因?？O蟶基因的ORF長1227bp, 編碼408個(gè)氨基酸; 氨基酸多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn), 縊蟶等貝類同源性較高, 與其他物種同源性較低?；驎r(shí)空特征表達(dá)分析結(jié)果顯示,基因在縊蟶肝胰腺中的表達(dá)量明顯高于其余6個(gè)組織(<0.01); 140mg/L氨氮脅迫下縊蟶基因在肝胰腺中的表達(dá)量1h內(nèi)急劇上調(diào), 此后上調(diào)逐步減弱, 60mg/L氨氮水平下第12h上調(diào)才達(dá)峰值; 不同氨氮水平暴露下縊蟶肝胰腺中GOT活力整體均呈現(xiàn)先升后降趨勢, 但在較高氨氮濃度水平下同樣表現(xiàn)出更快速的應(yīng)答特征。這些結(jié)果為后續(xù)深入研究縊蟶miR-8245a-5p及基因調(diào)控氨氮解毒機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

縊蟶(); miRNA; 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT); 氨氮脅迫

縊蟶()是浙江、福建等地重要的養(yǎng)殖貝類之一, 在我國海水養(yǎng)殖中占有重要的位置, 其生活在灘涂或池塘的泥灘洞穴中, 對污染物具有較高的耐受性(徐鳳山等, 2008; Wu, 2018)。近年來, 由于環(huán)境污染, 導(dǎo)致水體氨氮濃度偏高, 此外, 隨著混養(yǎng)模式的推廣及飼料的過量投喂, 養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化越來越普遍, 使?fàn)I穴居生活的縊蟶面臨更高濃度氨氮的威脅(王巖, 1999)。有研究表明氨氮過高會造成水生生物組織氧化損傷、細(xì)胞凋亡或壞死、抑制免疫系統(tǒng)、增加病原敏感性, 甚至導(dǎo)致高死亡率(Cheng, 2015; Zhang, 2018)。

microRNA (miRNA)是一類長度約為21個(gè)核苷酸的非編碼內(nèi)源性單鏈RNA, 具有高度保守性、組織特異性和時(shí)序性, 其通過與靶mRNA裂解或優(yōu)先與蛋白質(zhì)編碼基因的非編碼區(qū)結(jié)合, 使得靶mRNA降解或者抑制靶mRNA翻譯(Ambros, 2004; Bartel, 2004)。miRNA參與調(diào)控多個(gè)細(xì)胞功能, 包括細(xì)胞分化、生長、凋亡、代謝以及應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程(Modlin, 2005; Houshmand, 2018; Raghuwanshi, 2018)。近年來, 越來越多的研究表明, miRNA與環(huán)境脅迫的響應(yīng)有關(guān)。Sun等(2016)用氨暴露刺激團(tuán)頭魴()時(shí), 發(fā)現(xiàn)大量miRNAs被誘導(dǎo)或抑制; Ou等(2012)檢測了感染絨螯螺旋體時(shí)中華絨螯蟹()血液中miRNA的變化, 發(fā)現(xiàn)228個(gè)特異性miRNAs在正常血細(xì)胞和感染血細(xì)胞中有顯著差異; Zeng等(2015)通過WSSV刺激凡納濱對蝦()時(shí), 鑒定出8個(gè)miRNAs在病毒感染后差異表達(dá); Schmidt(2010)通過深度測序美洲鱟()miRNA在短期鋅和銅脅迫下的總體表達(dá)和miRNA群體的變化。

最近幾年, 有關(guān)貝類miRNA生物學(xué)作用的研究逐漸成為熱點(diǎn), Zhao等(2016)鑒別出8個(gè)與滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的太平洋牡蠣()和香港巨牡蠣() miRNA; Zhou等(2014)用溫度和燦爛弧菌刺激太平洋牡蠣()時(shí), 發(fā)現(xiàn)大量miRNAs被誘導(dǎo)或抑制; Bao等(2014)篩選到5個(gè)與鎘脅迫應(yīng)答相關(guān)且表達(dá)顯著差異的泥蚶() miRNAs; 此外, Jiao等(2015)從馬氏珠母貝()生物礦化相關(guān)的miRNA庫中鑒別出一個(gè)與珍珠層形成相關(guān)的miRNA; 謝淑媚(2018)從縊蟶()8個(gè)發(fā)育時(shí)期中中鑒別出了7個(gè)與類胰島素生長因子系統(tǒng)信號途徑相關(guān)的miRNA; 宋浩(2018)研究了脈紅螺()變態(tài)過程中的miRNA, 鑒定了195條差異顯著的miRNA。

本研究對氨氮脅迫下縊蟶肝胰腺組織中表達(dá)水平差異顯著的miR-8245a-5p靶基因進(jìn)行預(yù)測和驗(yàn)證, 并對其靶基因GOT的序列和表達(dá)特征進(jìn)行了分析, 為揭示和探討縊蟶在氨氮環(huán)境脅迫下的解毒代謝機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用縊蟶材料取自寧波市鄞州區(qū)丹艷水產(chǎn)養(yǎng)殖基地, 殼長(56.96±3.13)mm、體重(13.38±2.40)g, 于實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水養(yǎng)殖箱內(nèi)暫養(yǎng)7d后待用(養(yǎng)殖條件為: 連續(xù)充氣, 水溫25°C左右, 鹽度20左右, 每天投喂單胞藻餌料一次)。

1.2 miR-8245a-5p靶基因的預(yù)測與驗(yàn)證

基于Illumina Hiseq 2500高通量測序, 篩選氨氮脅迫下縊蟶肝胰腺組織表達(dá)水平差異顯著的miR-8245a-5p進(jìn)行分析。使用miRBase、miRanda和RNAhybrid數(shù)據(jù)庫軟件預(yù)測miR-8245a-5p的靶基因, 并利用qRT-PCR篩選miR-8245a-5p與氨氮脅迫相關(guān)的靶基因。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所需特異性激動(dòng)劑agomir-8245a-5p和拮抗劑antagomir-8245a-5p由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成, agomir-NC和antagomir-NC為對照組(與miRBase數(shù)據(jù)庫中所有的miRNA具有最小的同源性)。通過閉殼肌對縊蟶分別注射特異性和對照組激動(dòng)劑和拮抗劑, 注射濃度2μg/μL, 時(shí)間間隔12h。注射后的縊蟶分組放入正常海水中養(yǎng)殖, 3d后每組取6粒縊蟶解剖取肝胰腺, 提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 為qRT-PCR模板, 用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物q-GOT-F和q-GOT-R, 用Vazyme miRNA設(shè)計(jì)miRNA引物q-miR8245a5p-F和q-miR8245a5p-R, 內(nèi)參基因分別選擇和, 使用Light Cycler 480ⅡPCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。各組另取肝胰腺, 按照重量(g) : 體積(mL) = 1 : 9的比例加入PBS (4°C, 0.01mol/L, pH 7.4), 勻漿(10000r/min, 30s), 離心(10000×, 10min), 取上清, GOT酶活采用谷草轉(zhuǎn)氨酶比色法測試盒測定。采用相對值2-??Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 使用SPSS 19.0及Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析, 以<0.05作為差異顯著性的標(biāo)志。

1.3 Sc-GOT基因生物信息學(xué)分析

利用縊蟶轉(zhuǎn)錄組文庫獲得基因EST片段, 設(shè)計(jì)RACE引物GOT-F和GOT-R, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物切膠回收、連接轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中, 培養(yǎng)12h, 挑選白色單菌落, 菌液PCR后將陽性克隆進(jìn)行測序。為驗(yàn)證基因的cDNA全長, 設(shè)計(jì)引物GOT-F1和GOT-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 產(chǎn)物切膠回收、連接轉(zhuǎn)化步驟同上。

通過ORF Finder軟件預(yù)測基因的開放閱讀框; 使用ProtParam軟件預(yù)測氨基酸序列以及理化性質(zhì); 利用ExPASy軟件推測蛋白質(zhì)理化性質(zhì); 使用NetNGlyc預(yù)測糖基化位點(diǎn); 使用NetPhos預(yù)測磷酸化位點(diǎn); 使用SMART軟件預(yù)測蛋白質(zhì)功能域; 利用TMHMM分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū); 用Signal P分析蛋白質(zhì)信號肽區(qū)域; 用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 Sc-GOT基因的差異表達(dá)分析

1.4.1 不同組織中差異表達(dá)分析 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行, 每個(gè)平行取6粒縊蟶分別活體解剖其水管、足、鰓、腎臟、外套膜、肝胰腺和閉殼肌7個(gè)組織用于時(shí)空表達(dá)特征分析, RNA提取方法及qRT-PCR和酶活測定方法參照1.2進(jìn)行。

1.4.2基因氨氮脅迫后的表達(dá)分析 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)處理, 分別是對照組(養(yǎng)殖用海水, 0.01mg/L), 60mg/L氨氮脅迫組, 140mg/L氨氮脅迫組, 每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行組。在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水養(yǎng)殖箱內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn), 每12h全換水一次, 換水后實(shí)驗(yàn)組用氨氮質(zhì)量濃度為1000g/L的NH4Cl(優(yōu)級純)溶液調(diào)節(jié)氨氮水平。試驗(yàn)期間不充氣, 每次換水前2h投喂角毛藻, 溫度保持在25°C, 鹽度保持在20, pH值保持在8.00左右。各組取6?？O蟶(實(shí)驗(yàn)后1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h取樣), 解剖其肝胰腺組織凍存于液氮中, 一部分用于RNA提取, 另一部分用于酶活測定, RNA提取及qRT-PCR和酶活測定方法仍參照1.2進(jìn)行。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列

Tab.1 Primers and sequences used in the experiments

2 結(jié)果

2.1 miR-8245a-5p靶基因的預(yù)測與驗(yàn)證

使用miRBase、miRanda和RNAhybrid軟件預(yù)測miR-8245a-5p靶基因(,,,,), 利用qRT-PCR篩選出極顯著差異的靶基因(圖1)。再利用miRBase取得miR-8245a-5p成熟序列(圖2), 從測序結(jié)果中選取的mRNA序列。

圖1 miR-8245a-5p靶基因的預(yù)測(n=3)

注：*代表顯著差異(<0.05); **代表極顯著差異(<0.01)

經(jīng)過qRT-PCR檢測, agomir-8245a-5p和antagomir- 8245a-5p的相對表達(dá)量顯著升高(<0.01)(圖3a)。注射agomir-8245a-5p,基因相對表達(dá)量及酶活顯著降低(<0.01); 相反, 注射antagomir-8245a-5p,基因相對表達(dá)量及酶活顯著升高(<0.01)(圖3b, c)。

2.2 Sc-GOT基因序列分析

基因cDNA全長2594 bp,基因開放閱讀框(ORF)長度1227bp。ExPASy軟件推導(dǎo)出ORF編碼408個(gè)氨基酸, 包含55個(gè)堿性氨基酸(K, R, H), 43個(gè)酸性氨基酸(D, E), 178個(gè)疏水性氨基酸(A, L, I, F, P, V, W, M)以及132個(gè)親水性氨基酸(S, G, T, Y, N, C, Q), 該蛋白質(zhì)含有很大比例的疏水性氨基酸, 表現(xiàn)為疏水性; 該蛋白的分子量為45.38ku, 等電點(diǎn)pI=8.37。該序列包含3個(gè)N-糖基化位點(diǎn), 30個(gè)磷酸化位點(diǎn)(其中絲氨酸位點(diǎn)13個(gè), 蘇氨酸位點(diǎn)13個(gè), 酪氨酸位點(diǎn)4個(gè)); TMHMM和SignalP軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)無跨膜區(qū)和信號肽。SMART軟件進(jìn)行功能域預(yù)測顯示,存在1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域: Aminotran_1_2 (29—397aa)。

圖2 預(yù)測的縊蟶miR-8245a-5p的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)

注：紅色部分為成熟miRNA的主要形式

圖3 miR-8245a-5p靶基因的驗(yàn)證

注：a. agomir-8245a-5p和antagomir-8245a-5p注射后miR-8245a-5p相對含量分析(=3); b. agomir-8245a-5p和antagomir-8245a-5p注射后基因表達(dá)分析(=3); c. agomir-8245a-5p和antagomir-8245a-5p注射后Sc-GOT蛋白含量分析(=3); **代表極顯著差異(<0.01)

利用MEGA6.0軟件對縊蟶和其他16個(gè)物種的GOT氨基酸序列進(jìn)行了序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(見圖4)。結(jié)果顯示,基因與蝦夷扇貝(, OWF49471.1)、太平洋牡蠣(, EKC40669.1)和美洲牡蠣(, XP_ 022339935.1)同源性較高, 分別為70.2%、70.4%和69.9%, 與智人(, AAA35563.1)、小鼠(, AAA37263.1)、原雞(, NP_990652.1)、鵪鶉(, XP_ 015722585.1)、非洲爪蟾(, NP_ 998829.1)、伯氏溪樹蛙(, BAM10994.1)、斑馬魚(, NP_998222.1)、半滑舌鰨(, XP_008320093.1)、內(nèi)華達(dá)古白蟻(, KDR10996.1)、菜葉蜂(, XP_012267682.1)、中國對蝦(, AID18683.1)和斑節(jié)對蝦(, KP984794.1)等動(dòng)物的同源性為50.5%—66.7%。進(jìn)化樹分析表明, 縊蟶與其他幾種貝類動(dòng)物的親緣性較近, 與鳥類、兩棲類、哺乳類、魚類等脊椎動(dòng)物的親緣性較遠(yuǎn)。

圖4 采用MEGA6.0軟件NJ法構(gòu)建GOT基因的進(jìn)化樹

2.3 Sc-GOT基因的表達(dá)分析

不同組織的qRT-PCR結(jié)果顯示,基因在縊蟶成體的水管、足、鰓、腎臟、外套膜、肝胰腺和閉殼肌中均有表達(dá), 該基因在縊蟶肝胰腺中表達(dá)量相對其他6個(gè)組織最高(<0.01), 其次是鰓, 在唇瓣組織中的表達(dá)量最低(圖5)。

圖5 Sc-GOT基因在縊蟶不同組織的表達(dá)分析(n=3)

注：1. 足, 2. 肝胰腺, 3. 鰓, 4. 腎臟, 5. 外套膜, 6. 水管, 7. 唇瓣。*代表顯著差異(<0.05); **代表極顯著差異(<0.01) (與足組織的顯著性比較)

氨氮脅迫對縊蟶基因在肝胰腺中的表達(dá)特征見圖6, 從圖中結(jié)果可以看出不同濃度氨氮脅迫基因表達(dá)趨勢不同。140mg/L組中基因表達(dá)在脅迫初始階段迅速上調(diào), 顯著高于對照組(<0.01), 之后在脅迫過程中不斷下降。60mg/L組中基因表達(dá)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢, 上調(diào)水平在脅迫后12h達(dá)到峰值。

圖6 氨氮暴露下肝胰腺中Sc-GOT基因表達(dá)水平變化(n=3)

注：*代表顯著差異(<0.05); **代表極顯著差異(<0.01)

圖7顯示了氨氮脅迫后縊蟶肝胰腺組織中GOT酶活力的變化趨勢, 60mg/L和140mg/L兩個(gè)脅迫組均呈現(xiàn)先上升后下降的特征, 但140mg/L氨氮脅迫組較60mg/L組GOT酶活力上升更為快速, 前者峰值出現(xiàn)在脅迫后第6h, 后者峰值出現(xiàn)在第24h。

3 討論

本研究確定了基因?yàn)閙iR-8245a-5p的靶基因, 且獲得基因cDNA全長2594bp, 開放閱讀框(ORF)長度1227bp, 編碼408個(gè)氨基酸, 經(jīng)過多重序列比對發(fā)現(xiàn), 該氨基酸序列很保守, 屬于天冬氨酸超家族(Mehta, 1993)。該氨基酸與無脊椎動(dòng)物中太平洋牡蠣、美洲牡蠣和蝦夷扇貝同源性較高, 推測其功能較為相似, 而與脊椎動(dòng)物同源性較低。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明縊蟶與太平洋牡蠣歸為一支, 同源性為70.4%。

圖7 氨氮暴露下縊蟶肝胰腺中GOT酶活力變化(n=3)

注：*代表顯著差異(<0.05); **代表極顯著差異(<0.01)

谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)主要通過輔酶在磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)和磷酸吡哆胺(pyrodoxamine photophate, PMP)之間的轉(zhuǎn)換來完成氨基的轉(zhuǎn)運(yùn)(王鏡巖等, 2002)。本研究表明,基因在縊蟶各組織中均有表達(dá), 其中肝胰腺的表達(dá)量最高, 且鰓和腎臟的表達(dá)量處于較高水平, 其中肝胰腺相對于其他組織為極顯著差異(<0.01), 該結(jié)果與中國對蝦和斑節(jié)對蝦基因的組織表達(dá)規(guī)律(李少飛, 2014; 陳勁松等, 2016)相似, 可以推測基因參與縊蟶氨基酸分解和氨氮代謝的過程。

GOT通過催化草酰乙酸和谷氨酸生成天冬氨酸, 天冬氨酸參與鳥氨酸循環(huán)形成尿素(李少飛, 2014), 而尿素是雙殼類貝類排泄氨的方式之一(Hammen, 1968; Weihrauch, 2004)。為研究在縊蟶氨氮解毒代謝中的作用, 通過低濃度組與高濃度組對縊蟶進(jìn)行氨氮脅迫實(shí)驗(yàn), 分析了在不同濃度氨氮脅迫過程中縊蟶基因在肝胰腺中表達(dá)變化趨勢。在低濃度組中,基因表現(xiàn)出先升后降直至平衡的趨勢?；驊?yīng)對氨氮初始刺激時(shí)表達(dá)量升高, 表明基因?qū)Π钡{迫反應(yīng)迅速, 跟斑節(jié)對蝦結(jié)果一致(陳勁松等, 2016)。有研究發(fā)現(xiàn)在6h表達(dá)量下降的原因是體內(nèi)氨增加, 抑制了天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶參與的嘌呤核苷酸聯(lián)合脫氨基作用, 從而減少體內(nèi)氨的產(chǎn)生(李少飛, 2014)。隨著氨氮實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,基因表達(dá)量再次上升, 原因是谷草轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成天冬氨酸參與尿素的形成。三疣梭子蟹暴露在氨氮環(huán)境時(shí), 通過鰓和肝胰腺中的尿素循環(huán), 將體內(nèi)氨轉(zhuǎn)變成尿素, 再經(jīng)鰓將其排出體外(岳峰, 2010)。尿素的形成需要大量的能量, 甲殼動(dòng)物以合成谷氨酰胺作為主要的排氨途徑, 因此48h后基因的表達(dá)量下降并趨于平衡。而在高濃度組中的情況有所不同, 整體呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。中國對蝦應(yīng)對氨氮脅迫時(shí), 肝胰腺中的吸收細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉置诩?xì)胞, 原來的肝管部位充滿大量的溶酶體以及細(xì)胞碎片(姜會民, 2012), 因此致使本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)這種情況的原因可能也是水體中氨氮濃度過大, 肝細(xì)胞遭到破壞, 阻礙了肝細(xì)胞正常的解毒代謝功能。

谷草轉(zhuǎn)氨酶在氨的產(chǎn)生和排泄過程中具有重要的作用, 其活性反應(yīng)機(jī)體氨基酸代謝情況, 是反應(yīng)肝功能的重要指標(biāo)(Weihrauch, 2004)。兩組表現(xiàn)出先升后降趨勢, 區(qū)別在于達(dá)到最大酶活力的時(shí)間以及活力大小。脅迫初始階段, 實(shí)驗(yàn)組GOT活力上升, 表明氨氮對GOT活性有誘導(dǎo)作用, 加快氨氮的代謝, 減少代謝產(chǎn)物對機(jī)體的影響(McKenna, 2006)。低濃度組24h后GOT活性逐漸下降, 高濃度組6h后GOT活性逐漸下降, 出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是在隨著氨氮實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行, 肝胰腺被破壞, 與上述結(jié)論相呼應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究篩選并驗(yàn)證了表達(dá)差異顯著的miR-8245a-5p及其靶基因, 并對靶基因GOT進(jìn)行生物學(xué)信息分析得到其cDNA全長2594bp, 該基因與貝類同源性較高, 表明該基因比較保守。通過測定在氨氮脅迫下轉(zhuǎn)錄水平和酶活力水平的變化情況, 表明該基因參與縊蟶氨基酸分解和氨氮代謝的過程, 也表明天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶受氨氮暴露時(shí)間和氨氮?jiǎng)┝康挠绊? 初步探討了縊蟶在氨氮脅迫下的miRNA及分析機(jī)制, 以期更好地理解氨氮在機(jī)體內(nèi)的毒性作用以及機(jī)體對氨氮的解毒代謝機(jī)制。

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Identification And Characteristic Expression analysis of miR-8245a-5p target gene related to ammonia nitrogen stress in

CHEN Kai-Feng1, DONG Ying-Hui1, YAO Han-Han1, LIN Zhi-Hua1, SUN Chang-Sen2

(1. Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resource of Zhejiang Province, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China; 2. Ninghai Institute of Marine Biology Seed Industry, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315604, China)

To identify the miRNA target genes and their expression characteristics ofunder ammonia nitrogen stress, miR-8245a-5p with significant expression difference in hepatopancreas, was studied in detail. The Result of qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) in target gene verification showed thatgene expression changed most significantly (<0.01), indicating thatgene was the target gene of mir-8245a-5p. Bioinformatic analysis showed that the length ofgene was 1227bp, encoding 408 amino acids. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis indicatedhad higher homology to scallop and oyster, but lower homology to other species on thegene sequences. The results of qRT-PCR in different tissues presented that expression level ofgene in hepatopancreas was very significantly higher than in other tissues (<0.01). Under 140mg/L ammonia nitrogen stress, the expression level ofgene in hepatopancreas increased abruptly after 1h, and then the upregulated level gradually decreased; and under 60mg/L ammonia nitrogen stress, the upregulated level reached peak value after 12h. Under different ammonia nitrogen levels, theenzyme activity in hepatopancreas presented early increase and later decrease trend, but higher ammonia nitrogen level prompted a faster response. These results provide a theoretical basis for further study on the regulation mechanism of miR-8245a-5p andgene.

; miRNA; glutamic oxaloacetic transaminase (GOT); ammonia nitrogen stress

* 國家現(xiàn)代貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目, CARS-49號; 浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng), 2016C02055-9號; 寧波市“科技創(chuàng)新2025”重大專項(xiàng)項(xiàng)目, 2019B10005號;寧波市“環(huán)境科學(xué)與工程”一流學(xué)科項(xiàng)目。陳凱鋒, 碩士研究生, E-mail: 15728009063@163.com

孫長森, 博士, 副教授, E-mail: changsen_1977@hotmail.com

2019-12-23,

2020-01-26

Q789; S968.3

10.11693/hyhz20191200271