張亞亞 閆國(guó)旺 吳海燕 譚志軍, 4 張志華 江 濤 李 玉

基于SPE與SPATT的水體中麻痹性貝類毒素檢測(cè)方法構(gòu)建與應(yīng)用*

張亞亞1, 2閆國(guó)旺1, 2吳海燕2譚志軍2, 4①?gòu)堉救A3江 濤2李 玉1①

(1. 江蘇海洋大學(xué)測(cè)繪與海洋信息學(xué)院 連云港 222005; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071; 3. 河北省水產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)站 石家莊 050011; 4. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 青島 266237)

為實(shí)現(xiàn)麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning, PSP)的實(shí)時(shí)監(jiān)控與提前預(yù)警, 本研究構(gòu)建了基于固相萃取技術(shù)(solid phase extraction, SPE)與固相吸附毒素跟蹤技術(shù)(solid phase adsorption toxin tracking, SPATT)的水體中PSP檢測(cè)方法, 重點(diǎn)優(yōu)化了吸附材料及前處理方法, 評(píng)價(jià)了回收率、檢出限等指標(biāo), 并將方法應(yīng)用于2019年春季秦皇島山海關(guān)海域PSP消長(zhǎng)過(guò)程的監(jiān)測(cè)中, 比較評(píng)估了兩種方法的監(jiān)控預(yù)警效果。結(jié)果表明: SPE方法選用ENVI-Carb 500mg/6mL固相萃取柱, 過(guò)樣體積為50mL, 13種PSP組分的平均回收率為82.2%±10.0%、檢出限為4.0—20.0ng/L; SPATT方法選用SP207大孔吸附樹(shù)脂, 洗脫時(shí)間為靜置1d最佳, 整體回收率約為9.2%; 在實(shí)際應(yīng)用中, 結(jié)合產(chǎn)毒藻密度及貽貝富集毒素含量的變化, 發(fā)現(xiàn)SPE方法的檢測(cè)結(jié)果可實(shí)時(shí)表征海域PSP風(fēng)險(xiǎn)狀況, 對(duì)于貽貝中PSP的預(yù)警效果也顯著優(yōu)于SAPTT方法, 后者不僅因監(jiān)控方式相對(duì)滯后一個(gè)監(jiān)測(cè)周期, 且靈敏度及準(zhǔn)確性均較差。對(duì)于秦皇島海域, 當(dāng)SPE方法檢測(cè)結(jié)果達(dá)到100ng STX eq/L時(shí), 該海域貽貝中PSP殘留將具有潛在的食用安全風(fēng)險(xiǎn), 跟蹤過(guò)程表明這一閾值可提前兩周預(yù)警貽貝富集毒素含量超出我國(guó)限量標(biāo)準(zhǔn)(800μg STX eq/kg), 這對(duì)于強(qiáng)化風(fēng)險(xiǎn)警示并制定防范措施具有積極作用。

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning, PSP); 固相萃取技術(shù)(solid phase extraction, SPE); 固相吸附毒素跟蹤技術(shù)(solid phase adsorption toxin tracking, SPATT); SP207大孔吸附樹(shù)脂; 監(jiān)控預(yù)警

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning, PSP)是由亞歷山大藻()、裸甲藻()及盾甲藻()等單細(xì)胞甲藻產(chǎn)生、能夠在海洋生物尤其是雙殼貝類中富集的一類小分子有毒化學(xué)物質(zhì)(Chang, 1997)。全球每年因PSP導(dǎo)致的中毒事件約2000起, 占貝類毒素中毒事件的64%, 該毒素是目前影響最大、危害最廣的一類生物毒素(Visciano, 2016)。我國(guó)因PSP造成的食品安全事故也頻頻發(fā)生, 如香港蝦夷扇貝中毒、福建貽貝中毒及秦皇島貽貝中毒等(梁玉波等, 2019), 尤其是秦皇島貽貝在2016—2019年連續(xù)出現(xiàn)PSP超標(biāo)現(xiàn)象, 其中2016年的最高含量更是超出限量標(biāo)準(zhǔn)800μg STX eq/kg的65倍, 安全風(fēng)險(xiǎn)極其嚴(yán)峻。因此, 建立行之有效的PSP監(jiān)控預(yù)警技術(shù), 對(duì)于保障區(qū)域性貝類產(chǎn)品安全和消費(fèi)者健康變得尤為重要。

美國(guó)、加拿大等多個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家已建立較為系統(tǒng)的PSP風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與預(yù)警體系, 一般同步結(jié)合浮游植物和貝類樣品兩種常規(guī)監(jiān)測(cè)手段(田娟娟等, 2019)。通過(guò)常年定期監(jiān)測(cè)浮游植物, 以摸清目標(biāo)區(qū)域中浮游植物的變化規(guī)律, 當(dāng)產(chǎn)毒藻密度大于預(yù)警值200cells/L時(shí), 強(qiáng)化對(duì)貝類樣品的監(jiān)測(cè); 如果貝類中PSP含量超過(guò)限量標(biāo)準(zhǔn), 則需要關(guān)閉海域并同時(shí)監(jiān)測(cè)浮游植物和貝類樣品; 直至貝類中PSP低于限量標(biāo)準(zhǔn)且產(chǎn)毒藻濃度低于預(yù)警值時(shí)方可開(kāi)放海域, 但仍需繼續(xù)監(jiān)測(cè)浮游植物直至風(fēng)險(xiǎn)完全解除。其中, 浮游植物監(jiān)測(cè)法雖能反映產(chǎn)毒藻的變化情況, 但由于產(chǎn)毒藻種間差異并不顯著且樣品處理時(shí)間較長(zhǎng), 因而對(duì)鑒別人員的技術(shù)要求較高且時(shí)效性較差(于仁成等, 1998; Moreno-Pino, 2018)。貝類樣品監(jiān)測(cè)法雖是監(jiān)控貝類毒素最直接可靠的方法, 但貝類基質(zhì)復(fù)雜、組織提取物中干擾成分較多, 因此在檢測(cè)前需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的凈化處理(Turner, 2015), 這也極大影響了監(jiān)控的時(shí)效性。

為了實(shí)現(xiàn)貝類毒素快速監(jiān)測(cè), MacKenzie等(2004)建立了固相吸附毒素跟蹤技術(shù)(solid phase adsorption toxin tracking, SPATT), 該技術(shù)主要通過(guò)樹(shù)脂吸附產(chǎn)毒藻釋放到水體中的毒素, 以期實(shí)現(xiàn)貝類毒素的提前預(yù)警。隨后, 眾多SPATT的應(yīng)用研究相繼展開(kāi), 但大多集中在腹瀉性貝毒(diarrhetic shellfish poisoning, DSP), 且已發(fā)現(xiàn)HP20大孔吸附樹(shù)脂是吸附DSP最為有效的樹(shù)脂(渠佩佩等, 2016)。相對(duì)而言, SPATT應(yīng)用于水溶性貝毒PSP的監(jiān)測(cè)還較少, 目前應(yīng)用最多的是SP700大孔吸附樹(shù)脂(Roué, 2018a), 但其吸附靈敏度及回收率并不理想。Hattenrath-Lehmann等(2018)優(yōu)化了樹(shù)脂的洗脫方法, 確定直接用含少量甲酸的乙腈水浸泡可快速有效洗脫樹(shù)脂中吸附的PSP。Rodríguez等(2011)證明樹(shù)脂吸附的PSP在無(wú)毒素水體中具有解吸現(xiàn)象, 這也是造成樹(shù)脂回收率較低的主要原因, 因此在實(shí)際海域的放置時(shí)間不宜超過(guò)一周。此外, 現(xiàn)有研究雖也同時(shí)監(jiān)測(cè)了產(chǎn)毒藻密度、貝類富集毒素含量, 但對(duì)于SPATT是否可用于貝類毒素提前預(yù)警的結(jié)論卻有分歧(Fux, 2009; Pizarro, 2013; Li, 2017; Roué, 2018b)。固相萃取技術(shù)(solid phase extraction, SPE)通常用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)貝類樣品毒素測(cè)定前的凈化與富集, 因此根據(jù)其吸附原理可有效檢測(cè)水體中的毒素含量(Rodil, 2009; Wille, 2010; Zhuo, 2013)。吳海燕等(2017)的研究表明石墨化碳黑固相萃取柱對(duì)貝類樣品中PSP的吸附效果明顯優(yōu)于C18、HLB, 同時(shí)確定將75%乙腈水(含0.25%甲酸)作為洗脫液可保證PSP目標(biāo)化合物的完全洗脫。隨后Riccardi等(2018)也證明石墨化碳黑固相萃取柱可有效吸附實(shí)際海水中的PSP, 但未見(jiàn)SPE用于PSP預(yù)警監(jiān)測(cè)的研究。

因此, 本研究首先在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)構(gòu)建了基于SPE與SPATT的水體中PSP監(jiān)測(cè)方法, 并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。隨后, 將兩種方法用于秦皇島山海關(guān)貽貝養(yǎng)殖區(qū)的監(jiān)測(cè)中, 該區(qū)域不僅為2016年秦皇島貽貝中毒事件的發(fā)生地, 而且其貽貝富集PSP含量連續(xù)四年均超出限量標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)同時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)毒藻密度及貽貝富集PSP含量, 以對(duì)比評(píng)估SPE與SPATT方法對(duì)目標(biāo)海域中PSP風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)控預(yù)警效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 AB-5500 QTRAP液相色譜-四極桿/離子阱復(fù)合質(zhì)譜(美國(guó)AB SCIEX公司), 配有電噴霧離子源(ESI); Himac CR 22GⅡ高速離心機(jī)(日本Hitachi公司); XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠); 恒溫水浴鍋(上海藍(lán)凱儀器儀表有限公司); 光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司); 新型T18高速分散機(jī)(德國(guó)IKA公司); JY92-ⅡN超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司); E300H超聲波清洗器(德國(guó)Elmasonic公司); Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司); 固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)。

1.1.2 化學(xué)試劑 乙腈(質(zhì)譜級(jí), 美國(guó)Merck公司); 甲酸、甲酸銨(色譜級(jí), 瑞士Fluka公司); 氨水(色譜級(jí), 美國(guó)Sigma公司); 乙酸(色譜級(jí), 美國(guó)Thermo公司); 超純水(18.2 MΩ.cm); 石墨化碳黑固相萃取柱(ENVI-CarbTM, 250mg/3mL、500mg/6mL, 美國(guó)Supelco公司); 石墨化碳黑(ENVI-Carb, 120—400目, 美國(guó)Sigma公司); 大孔吸附樹(shù)脂(DIAION HP20、SEPABEADS SP70、SEPABEADS SP207、SEPABEADS SP700, 日本三菱公司); 其他未作特殊說(shuō)明的試劑均為分析純。

1.1.3 PSP標(biāo)準(zhǔn)品 石房蛤毒素(Saxitoxin, STX)、新石房蛤毒素(Neosaxitoxin, NEO)、膝溝藻毒素(Gonyautoxins-2&-3, GTX2&3; Gonyautoxins-1&-4, GTX1&4)、N-磺酰氨甲?；惗舅?Gonyautoxin-5, GTX5; N-Sulfocarbamoylgonyautoxins-1&-2, C1&2)、脫氨甲?；惗舅?Decarbamoylsaxitoxin, dcSTX; Decarbamoylneosaxitoxin, dcNEO; Decarbamoylgon-yaut-oxins-2&-3, dcGTX2&3)購(gòu)自于加拿大國(guó)家海洋研究中心。用75%乙腈水(含0.25%甲酸)配置成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 其中13種組分的實(shí)際濃度分別為: GTX5、NEO、STX、dcNEO、dcSTX為500ng/mL; GTX3、GTX4、dcGTX3、C2為200ng/mL; GTX1為613ng/mL; GTX2為472ng/mL; C1為669ng/mL; dcGTX2為681ng/mL。

1.1.4 藻細(xì)胞提取液 塔瑪亞歷山大藻(, AT5-3株)由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供, 分離自我國(guó)南海海域, 培養(yǎng)條件參考邴曉菲等(2017)。將指數(shù)生長(zhǎng)期的AT5-3藻液置于冰浴中, 在全程時(shí)間5min、間隔時(shí)間2s、功率比30%的條件下進(jìn)行充分超聲細(xì)胞破碎, 隨后8000r/min離心5min, 取上清液混合均勻即制得藻細(xì)胞提取液。經(jīng)LC-MS/MS分析得: 藻細(xì)胞提取液PSP含量為12.9ng STX eq/mL, 共包括GTX1&4、GTX2&3、GTX5、dcGTX2&3、C1&2在內(nèi)的9種組分。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LC-MS/MS分析 液相色譜條件: 色譜柱: TSK-Amide-80 (3μm, 2mm×15cm); 柱溫: 40°C; 流速: 0.40mL/min; 進(jìn)樣量: 10μL; 流動(dòng)相: A: 水(含2mmol/L甲酸銨, 50mmol/L甲酸), B: 95%乙腈水溶液(含2mmol/L甲酸銨, 50mmol/L甲酸); 洗脫梯度: 0—3.0min, 80% B; 3.1—5.0min, 80%—40% B; 5.1—7.0min, 40% B; 7.1—8.0min, 40%—80% B; 8.1—10.0min, 80% B。質(zhì)譜條件: 電噴霧離子源(ESI), 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM), 正負(fù)離子切換模式; 噴霧電壓: 5.5kV,-4.5kV; 離子源溫度550°C; 碰撞氣壓力: Medium; 氣簾氣壓力: 30psi; 霧化氣壓力GS1: 50psi; 輔助加熱氣壓力GS2: 50psi。其他參數(shù)參考吳海燕等(2017)。

1.2.2 基于SPE的水體中PSP檢測(cè)方法 石墨化碳黑固相萃取柱預(yù)先用3mL乙腈、1mL超純水活化, 將待測(cè)水樣8000r/min離心5min去除雜質(zhì)后通過(guò)固相萃取柱, 自然流干后正壓擠干, 最后用1mL 75%乙腈水溶液(含0.25%甲酸)洗脫混勻, 過(guò)0.22μm濾膜于進(jìn)樣小瓶中, 待LC-MS/MS分析。

選用ENVI-Carb 250mg/3mL、ENVI-Carb 500mg/6mL兩商業(yè)化以及1g自制ENVI-Carb固相萃取柱, 均加入20mL藻細(xì)胞提取液, 篩選吸附效果較好的固相萃取柱; 分別向優(yōu)選固相萃取柱中加入5、10、20、50mL藻細(xì)胞提取液, 以確定過(guò)樣體積; 將500ng/mL PSP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用75%乙腈水(含0.25%甲酸)稀釋至200、100、50、20、10、5ng/mL, 并將以上七個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用空白海水再次稀釋500倍至50mL, 隨后加入到優(yōu)選固相萃取柱中, 以測(cè)定PSP各組分的回收率及檢出限。

1.2.3 基于SPATT的水體中PSP檢測(cè)方法 樹(shù)脂盤(圖1)的制備、活化及保存參考渠佩佩等(2016)。樹(shù)脂中PSP的洗脫: 將已在待測(cè)水體中放置7d的樹(shù)脂盤取出, 去除保護(hù)網(wǎng)與圓形固定器, 并用10mL超純水沖洗樹(shù)脂袋去除鹽分及其他雜質(zhì), 輕微甩干多余水分后將樹(shù)脂從樹(shù)脂袋中取出至50mL離心管中, 加入10mL 75%乙腈水溶液(含0.25%甲酸), 渦旋混勻5min, 超聲40min, 靜置浸泡一段時(shí)間后吸取1mL上清液過(guò)0.22μm濾膜于進(jìn)樣小瓶中, 待LC-MS/MS分析。

制備HP20、SP70、SP207、SP700樹(shù)脂盤, 分別置于500mL藻細(xì)胞提取液中, 放置7d后取出, 篩選吸附效果較好的樹(shù)脂; 將優(yōu)選樹(shù)脂的樹(shù)脂盤置于500mL藻細(xì)胞提取液中, 放置7d后取出, 在樹(shù)脂進(jìn)行PSP洗脫過(guò)程中, 分別在渦旋后、超聲后、靜置1d后、靜置2d后、靜置3d后、靜置4d后取洗脫液進(jìn)行PSP測(cè)定, 以確定最佳洗脫時(shí)間; 將藻細(xì)胞提取液與空白海水按照體積比配制成高(1︰0)、中(1︰1)、低(1︰3)、極低(1︰7)四個(gè)濃度梯度的水體各500mL, 將優(yōu)選樹(shù)脂的樹(shù)脂盤分別置于其中, 放置7d后取出, 以測(cè)定優(yōu)選樹(shù)脂的回收率。

圖1 SPATT樹(shù)脂盤

1.3 實(shí)際應(yīng)用

研究建立的SPATT和SPE方法均在秦皇島山海關(guān)貽貝養(yǎng)殖區(qū)展開(kāi)實(shí)際應(yīng)用, 實(shí)施時(shí)間為2019年3月25日—5月14日, 期間該海域發(fā)生了小規(guī)模亞歷山大藻赤潮。共設(shè)置兩個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)S1和S2 (圖2), 每隔7d采集貽貝()、海水及樹(shù)脂盤, 同時(shí)布放新的已活化樹(shù)脂盤。采集的貽貝用于PSP檢測(cè), 方法參考吳海燕等(2017); 海水500mL用于浮游植物中產(chǎn)毒藻的鑒定與計(jì)數(shù), 方法參考Uterm?hl(1958); 海水50mL用于 SPE方法的PSP檢測(cè); 樹(shù)脂盤用于SAPTT方法的PSP檢測(cè)。

圖2 秦皇島海域采樣點(diǎn)設(shè)置

1.4 數(shù)據(jù)分析

(1) PSP各組分毒性大小以TEF換算成STX eq進(jìn)行比較, 其中STX的TEF=1.00。具體計(jì)算公式如下:

式中,X為各PSP組分的含量;r為毒性因子(Turner, 2015)。

(2) 基于SPE的水體中PSP檢測(cè)方法對(duì)各PSP組分的回收率計(jì)算公式如下:

(3) 各PSP組分檢出限及定量限的確定: 以信噪比(signal to noise ratio,/≥3)的濃度確定檢出限(limit of detection, LOD), 以信噪比(/≥10)的濃度確定定量限(limit of quantitation, LOQ)。

(4) 本文采用Origin 8.5、SPSS 23及Excel 2018等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于SPE的水體中PSP檢測(cè)方法確定及評(píng)價(jià)

選用的ENVI-Carb填料包含高強(qiáng)度的大表面積球形粒子, 極易吸附強(qiáng)極性化合物(吳海燕等, 2017)。分別向三種ENVI-Carb固相萃取柱中添加相同體積的藻細(xì)胞提取液, 以篩選對(duì)水體中PSP吸附效果較好的固相萃取柱。如圖3所示, ENVI-Carb 250mg/3mL與ENVI-Carb 500mg/6mL商業(yè)化固相萃取柱均可有效吸附水體中所包含的9種PSP組分, 而1g自制 ENVI-Carb固相萃取柱僅檢測(cè)出5種組分。自制固相萃取柱由于粒徑分布不均勻而導(dǎo)致理論塔板數(shù)較低, 因此即使填料重量增加, 毒素也無(wú)法得到有效保留。另外, ENVI-Carb 500mg/6mL固相萃取柱對(duì)每種組分的吸附量均高于ENVI-Carb 250mg/3mL, 這可能與填料重量較小的固相萃取柱出現(xiàn)吸附飽和現(xiàn)象有關(guān)。綜上, 選取ENVI-Carb 500mg/6mL固相萃取柱作為優(yōu)選材料。

分別向ENVI-Carb 500mg/6mL固相萃取柱中加入不同體積的藻細(xì)胞提取液, 并折算其回收率, 以確定最佳過(guò)樣體積。結(jié)果表明: 在上樣體積5—50mL、毒素總量小于700ng STX eq時(shí), 固相萃取柱對(duì)PSP的吸附總量()與過(guò)樣體積()呈顯著正相關(guān), 擬合方程為=9.989-2.863, 相關(guān)系數(shù)2為0.998, 樣品回收率為77.6% ± 3.5%。綜合考慮前處理時(shí)間及方法靈敏度, 同時(shí)避免上樣量過(guò)大破壞固相萃取柱結(jié)構(gòu)的可能性, 因此選擇50mL作為上樣體積, 其前處理時(shí)間約0.5h, 即滿足快速精準(zhǔn)檢測(cè)的要求。

圖3 不同固相萃取柱對(duì)水體中PSP的吸附效果對(duì)比

注：a、b、c不同字母之間表示存在顯著性差異(<0.05)

采用加入不同濃度梯度PSP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式, 以檢測(cè)含量與理論含量的比值確定各組分的回收率, 以信噪比確定檢出限(LOD)及定量限(LOQ)。結(jié)果表明: ENVI-Carb 500mg/6mL固相萃取柱對(duì)13種PSP組分的平均回收率為82.2%±10.0%, 其中C1最高為92.9%、dcGTX3最低為72.4%。稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過(guò)固相萃取柱的被動(dòng)吸附再次得到富集, 因此10ng/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的11種PSP組分均滿足LOD要求, 而NEO、dcNEO由于離子通道雜質(zhì)峰響應(yīng)較強(qiáng), 在濃度為20ng/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中方才滿足LOD要求。各PSP組分經(jīng)其混合標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)際濃度換算得LOD及LOQ見(jiàn)表1。此外, 本方法的LDO及LOQ均低于現(xiàn)有研究結(jié)果(Riccardi, 2018), 且涉及的毒素組分也較多, 因此更適合實(shí)際海水的檢測(cè)。

2.2 基于SPATT的水體中PSP檢測(cè)方法確定及評(píng)價(jià)

PSP是一類非結(jié)晶、水溶性、高極性、不揮發(fā)的小分子物質(zhì), 常溫條件下穩(wěn)定性較好(李淑冰等, 2000), 因此在對(duì)比不同樹(shù)脂的吸附效果時(shí), 可直接將樹(shù)脂盤放入PSP陽(yáng)性水體中。由于水體毒素含量較低, 為避免吸附飽和現(xiàn)象, Rodríguez等(2011)在吸附樹(shù)脂對(duì)比實(shí)驗(yàn)中選用的樹(shù)脂填裝重量?jī)H為100mg, 而本研究采用的藻細(xì)胞提取液PSP含量遠(yuǎn)大于實(shí)際水體, 則可直接采用實(shí)際海域應(yīng)用的填裝重量10g。將四種類型的樹(shù)脂分別置于相同體積的藻細(xì)胞提取液中, 以篩選對(duì)水體中PSP吸附效果較好的樹(shù)脂。結(jié)果表明: 四種樹(shù)脂均可吸附水體所包含的9種PSP毒素組分且穩(wěn)定性較好, 按吸附毒素總量從大到小排列為: SP207>SP700>SP70>HP20(圖4)。除GTX2外, SP207對(duì)不同毒素組分的吸附量均明顯高于其他三種樹(shù)脂, 這是因?yàn)镠P20、SP70、SP700均為芳香族系大孔吸附樹(shù)脂, 而SP207是芳香族系衍生型大孔吸附樹(shù)脂, 其是在芳香族系的骨架上結(jié)合了溴, 從而強(qiáng)化了疏水吸附力, 即更適合水溶性PSP的吸附。綜上, 選取SP207作為優(yōu)選吸附樹(shù)脂。

表1 基于SPE的水體中PSP檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

Tab.1 Evaluation of the detection method to PSP in water based on SPE method

圖4 不同樹(shù)脂盤對(duì)水體中PSP的吸附效果對(duì)比

注：a、b、c不同字母之間表示存在顯著性差異(<0.05)

為避免LC-MS/MS分析由于定容溶液不同產(chǎn)生的誤差, 因此直接選用75%乙腈水(含0.25%甲酸)作為樹(shù)脂的洗脫溶劑, 并在Hattenrath-Lehmann等(2018)洗脫方法的基礎(chǔ)上適當(dāng)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間, 以對(duì)比不同處理步驟的洗脫效果。如圖5所示, 隨SP207樹(shù)脂洗脫過(guò)程的進(jìn)行, 洗脫的毒素總量呈持續(xù)增加趨勢(shì)。超聲處理不僅可使樹(shù)脂與洗脫溶劑充分接觸, 還使洗脫總量增加到未超聲的2.32倍。靜置1d后洗脫含量增加最為顯著, 毒素總量是超聲后的2.05倍, 即延長(zhǎng)樹(shù)脂浸泡時(shí)間可大幅度提高洗脫效果。此外, 在靜置2d、3d、4d后的洗脫總量雖也有所增加, 但效果并不明顯。因此, 在實(shí)際應(yīng)用中選擇浸泡1d較為合適, 既可縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間, 也可顯著提高洗脫效果, 更重要的是可避免由于浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而引起的樹(shù)脂變性等問(wèn)題。

圖5 SP207樹(shù)脂洗脫方法優(yōu)化

在有害赤潮暴發(fā)期間, 水體中的毒素含量一般呈先升后降的變化趨勢(shì)(MacKenzie, 2004), 為達(dá)到SPATT監(jiān)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確反映水體中毒素消長(zhǎng)規(guī)律的目的, 保證樹(shù)脂的吸附穩(wěn)定性是必要前提條件。用空白海水將藻細(xì)胞提取液稀釋成四個(gè)不同濃度梯度的水體, 分別將SP207樹(shù)脂盤放入其中。如圖6所示, SP207樹(shù)脂的洗脫毒素總量與水體毒素總量呈顯著正相關(guān)(2=0.989), 即樹(shù)脂吸附毒素能力十分穩(wěn)定。由擬合方程可得SP207樹(shù)脂的最終洗脫毒素總量約占水體毒素總量的9.20%, 而目前吸附PSP應(yīng)用最多的SP700樹(shù)脂的整體回收率僅為1% (Rodríguez, 2011)。然而, 實(shí)驗(yàn)所構(gòu)造的環(huán)境無(wú)水體交換, 因此SP207樹(shù)脂對(duì)于PSP的吸附靈敏度還需在實(shí)際海域中驗(yàn)證。

圖6 SP207樹(shù)脂盤對(duì)水體中PSP的吸附回收率測(cè)定

2.3 基于SPE與SPATT的水體中PSP檢測(cè)方法在秦皇島山海關(guān)海域的應(yīng)用

2019年秦皇島山海關(guān)海域于三月下旬至五月中旬暴發(fā)了小規(guī)模有害赤潮, 經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確定肇事藻為亞歷山大藻屬(未定種), 最高藻細(xì)胞密度為3850cells/L, 已達(dá)到我國(guó)國(guó)家海洋局規(guī)定的閉海濃度103—104cells/L (田娟娟等, 2019), 貽貝富集PSP含量最高達(dá)985μg STX eq/kg, 已超過(guò)我國(guó)安全限量800μg STX eq/kg。在常規(guī)監(jiān)測(cè)方法的基礎(chǔ)上, 應(yīng)用已優(yōu)化的SPE及SPATT方法對(duì)水體中PSP進(jìn)行監(jiān)測(cè)。從整體變化趨勢(shì)上來(lái)看, 4個(gè)監(jiān)測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)出基本一致的時(shí)空變化規(guī)律(圖7), S1站位較S2站位毒素分布更高, 即近岸的PSP污染情況較為嚴(yán)重。然而, SPE方法監(jiān)測(cè)的水體中PSP含量(圖7a)與貽貝富集PSP含量(圖7c)、產(chǎn)毒藻密度(圖7d)同期達(dá)到最高值, 而SPATT方法監(jiān)測(cè)的水體中PSP含量(圖7b)最高值卻相對(duì)延遲一個(gè)采樣周期。水體中的毒素含量隨產(chǎn)毒藻密度的增加而增加(Lefebvre, 2008), 而樹(shù)脂盤需經(jīng)過(guò)7d的動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程, 因此造成SPATT方法的時(shí)效性較差, 這與相關(guān)研究表明SPATT可實(shí)現(xiàn)PSP提前預(yù)警不符(Rodríguez, 2011), 但不可否認(rèn)其結(jié)果可表征上一監(jiān)測(cè)周期貝類中毒素富集狀況的作用(Li, 2017)。從毒素組分上看, SPE與SPATT方法都檢測(cè)出貽貝中主要的4種膝溝藻毒素, 且毒素含量占比也均呈現(xiàn)出GTX1>GTX4>GTX3>GTX2的規(guī)律。另外, 在監(jiān)測(cè)初期, 貽貝蓄積PSP含量和產(chǎn)毒藻密度均較低時(shí), SPE與SPATT方法也可檢測(cè)到PSP的存在, 即所構(gòu)建的兩種方法均可滿足實(shí)際海域監(jiān)測(cè)要求。

為了達(dá)到貝類毒素有效預(yù)警的目的, 方法的時(shí)效性和靈敏度是最為重要的評(píng)價(jià)參數(shù)(王丹等, 2013)。通過(guò)自然暴露結(jié)果可見(jiàn), 在有害赤潮初期(藻細(xì)胞密度>200cells/L), 貽貝富集PSP速率較緩慢; 當(dāng)藻細(xì)胞密度>1000cells/L時(shí), 貽貝富集PSP速率顯著提升, 且兩者同期達(dá)到最高值, 周期僅為14d, 這說(shuō)明貽貝能在PSP赤潮爆發(fā)的短時(shí)間內(nèi)迅速累積大量毒素(Qiu, 2018)。然而, 貝類毒素早期預(yù)警需至少提前一周進(jìn)行監(jiān)測(cè)結(jié)果的上報(bào), 通過(guò)比較4月9日監(jiān)測(cè)值可見(jiàn), SPATT方法檢測(cè)的PSP含量較低, 僅為18ng STX eq/SPATT bag, 而SPE方法檢測(cè)的含量為254ng STX eq/L, 是其方法檢出限的3.5倍。綜上可得, SPE方法的時(shí)效性及靈敏度均顯著優(yōu)于SPATT, 因此該方法更適合作為PSP實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與提前預(yù)警的有效工具。從現(xiàn)有結(jié)果擬合得出: 對(duì)于秦皇島海域, 當(dāng)SPE方法監(jiān)測(cè)的水體中毒素含量達(dá)到100ng STX eq/L時(shí), 兩周后貽貝富集PSP含量將超出我國(guó)限量標(biāo)準(zhǔn)。然而, SPE方法應(yīng)用于其他海域PSP監(jiān)控預(yù)警的閾值還需根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)結(jié)果設(shè)定。

圖7 亞歷山大藻赤潮過(guò)程中水體中毒素檢測(cè)方法與常規(guī)監(jiān)測(cè)方法的比較

注：曲線表示各要素隨時(shí)間的變化, 餅狀圖表示PSP的毒素組分及其占比

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了基于SPE與SPATT的水體中PSP檢測(cè)方法, 并在2016年秦皇島貽貝中毒事件發(fā)生地的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中比較了兩種方法的監(jiān)控預(yù)警效果。其中, SPE方法選用ENVI-Carb 500mg/6mL固相萃取柱, 過(guò)樣體積為50mL, 13種PSP組分的平均回收率為82.2%±10.0%、檢出限為4.0—20.0ng/L; SPATT方法選用SP207大孔吸附樹(shù)脂, 洗脫時(shí)間為靜置1d最佳, 整體回收率約為9.2%?，F(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明, SPE方法的時(shí)效性及靈敏度均顯著優(yōu)于SPATT, 該方法可作為PSP監(jiān)控預(yù)警的有效工具。對(duì)于秦皇島海域, 當(dāng)SPE方法檢測(cè)的水體中PSP含量達(dá)到100ng STX eq/L時(shí), 兩周后該海域貽貝毒素富集含量將超出我國(guó)限量標(biāo)準(zhǔn), 因此此時(shí)應(yīng)提高監(jiān)管頻率并做好防控措施, 從而有效遏制貝類中毒事件的發(fā)生。

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ESTABLISHMENT AND APPLICATION OF DETECTION METHODS TO PARALYTIC SHELLFISH POISONING IN WATER BASED ON SPE AND SPATT METHODS

ZHANG Ya-Ya1, 2, YAN Guo-Wang1, 2, WU Hai-Yan2, TAN Zhi-Jun2, 4, ZHANG Zhi-Hua3, JIANG Tao2, LI Yu1

(1. School of Geomatics and Marine Information, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Hebei Province Station for Quality Inspection and Test of Aquatic Products, Shijiazhuang 050011, China; 4. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China)

To realize the real-time monitoring and early warning of paralytic shellfish toxin (PSP), two detection methods to PSP in water based on solid phase extraction (SPE) and solid phase adsorption toxin tracking (SPATT) were established. In laboratory, the two methods were optimized by screening adsorption materials and improving pretreatment methods. Furthermore, the indexes of methods such as recovery rate and detection limit were evaluated. Afterwards, the two methods were applied in the coastal area of Qinhuangdao sea area in the spring of 2019 to evaluate their performance of monitoring PSP. Results show that for the SPE method, it was applicable to select ENVI-Carb 500mg/6mL solid phase extraction column with the sample volume of 50mL. For 13 PSP components, the average recovery of the SPE method reached 82.2%±10.0% and the detection limit ranged from 4.0 to 20.0ng/L. In addition, the SPATT method was optimized using SP207 macroporous adsorption resin with the best elution time of standing for 1d, and its overall recovery rate increased to 9.2%. In practice, the sensitivity and accuracy of the SPE method was obviously better than SPATT by comparing the changes ofabundances and toxins in mussels. The SPE method could demonstrate the PSP risk status in real time, whereas the SPATT method had a time lag of a monitor cycle and poorer sensitivity and accuracy. It was found that when the result of detection by SPE method reached 100ng STX eq/L for the study area, the accumulated PSP in mussels could exceed the limit standard (800μg STX eq/kg) in two weeks, which provided important and helpful information for the risk warning and preventive measures taking.

paralytic shellfish poisoning (PSP); solid phase extraction (SPE); solid phase adsorption toxin tracking (SPATT); SP207 macroporous adsorption resin; monitoring and early warning

* 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目, 2017YFC1600701號(hào); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 31772075號(hào); 江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目, BK20171262號(hào); 江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目, KYCX18_2576號(hào)。張亞亞, 碩士研究生, E-mail:zhangyaya5321@163.com

譚志軍, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail:tanzj@ysfri.ac.cn; 李 玉, 碩士生導(dǎo)師, 教授, E-mail: liyu241@sina. com

2019-09-26,

2019-11-26

R155

10.11693/hyhz20190900182