李盧國(guó) 駱云慧 徐善良, 2

循環(huán)水養(yǎng)殖黑鯛()水體中循環(huán)率對(duì)水質(zhì)因子和細(xì)菌群落多樣性的影響*

李盧國(guó)1駱云慧1徐善良1, 2①

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2. 寧波大學(xué)海洋生物工程浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211)

為探討循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中循環(huán)率對(duì)水質(zhì)因子和細(xì)菌群落多樣性的影響, 以黑鯛()為研究對(duì)象, 研究了4次/天(低循環(huán)率)、8次/天(中循環(huán)率)、12次/天(高循環(huán)率)三個(gè)流量下, 養(yǎng)殖桶和生物過(guò)濾桶兩部分細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性以及細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性。高通量測(cè)序結(jié)果表明: 黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和厚壁菌門(Firmicutes)。流量的升高可增加系統(tǒng)的細(xì)菌多樣性, 且高循環(huán)率過(guò)濾桶中具有凈化水質(zhì)降低營(yíng)養(yǎng)鹽功能的有益菌屬更為多樣化及豐度更高, 同時(shí), 其系統(tǒng)去氨氮和總氮效果更好, 去除率分別是49.5%和22.3%, 氨氮去除率是低循環(huán)率組的2.9倍和中循環(huán)率的3.6倍, 總氮去除率是低循環(huán)率組的8.2倍和中循環(huán)率組的20.5倍。PCoA分析和聚類分析結(jié)果表明, 各實(shí)驗(yàn)組養(yǎng)殖桶與生物過(guò)濾桶中細(xì)菌群落組成有著明顯的差異, 中、高循環(huán)率組過(guò)濾桶菌落結(jié)構(gòu)與低循環(huán)率的有明顯的差異。環(huán)境因子與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析結(jié)果表明, 總磷、活性磷酸鹽、亞硝酸鹽和總氮等指標(biāo)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響相對(duì)較大, 但未發(fā)現(xiàn)兩者間有很顯著的相關(guān)性。

黑鯛(); 循環(huán)水養(yǎng)殖; 細(xì)菌群落; 高通量測(cè)序; 循環(huán)率

黑鯛(), 屬硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、鯛科(Sparidae), 系暖溫性近海底層魚(yú)類, 分布于北太平洋西部、中國(guó)沿海, 以黃、渤海產(chǎn)量較多(朱德芬, 1993), 現(xiàn)有黑鯛養(yǎng)殖以網(wǎng)箱和池塘為主(蔣萬(wàn)釗, 2011)。循環(huán)水養(yǎng)殖提供了一種高效利用水資源的養(yǎng)殖方式, 可大大降低養(yǎng)殖業(yè)對(duì)環(huán)境的污染程度, 且又具有養(yǎng)殖系統(tǒng)自身水質(zhì)穩(wěn)定、防病能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)(王威等, 2012; 王峰等, 2013; Wold, 2014)。循環(huán)率作為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中一個(gè)重要的技術(shù)參數(shù), 其可有效地影響循環(huán)水系統(tǒng)細(xì)菌多樣性和去氨氮和亞硝態(tài)氮等營(yíng)養(yǎng)鹽的能力, 為很多研究者所重視, 如李雪晴(2018)、Fivelstad等(1994)、姚延丹等(2011)等。而對(duì)黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖模式的研究尚未見(jiàn)報(bào)道, 探究黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖中適合的循環(huán)率不僅可以提高黑鯛循環(huán)水飼養(yǎng)的效率, 同時(shí)還可避免能源浪費(fèi)。

水產(chǎn)動(dòng)物生活的水環(huán)境中有著豐富的微生物群落, 其對(duì)去除有害營(yíng)養(yǎng)鹽, 維持水環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用。當(dāng)養(yǎng)殖環(huán)境水體理化性質(zhì)改變時(shí), 微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)相應(yīng)產(chǎn)生變化(Moriarty, 1997; Sugita, 2005; Balcázar, 2006)?；?6S rRNA的高通量測(cè)序技術(shù), 主要基于細(xì)菌16S rRNA基因在功能上的高度保守性以及對(duì)應(yīng)序列不同位點(diǎn)的高變性, 能夠真實(shí)全面地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的基本特征, 檢測(cè)到純培養(yǎng)和其他非培養(yǎng)技術(shù)未能發(fā)現(xiàn)的低豐度微生物種類(湯學(xué)敏等, 2012; Chen, 2018; Xu, 2019)。這方面的相關(guān)研究已有報(bào)道, 并發(fā)現(xiàn)不同循環(huán)率與養(yǎng)殖系統(tǒng)中的細(xì)菌群落及多樣性具有相關(guān)性(Leonard, 2000; 姚延丹等, 2011; 張翔等, 2016)。

本文比較了不同循環(huán)率下黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中水質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性, 旨在為黑鯛的循環(huán)水養(yǎng)殖模式推廣及健康養(yǎng)殖系統(tǒng)的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 循環(huán)水系統(tǒng)構(gòu)建與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)在象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司進(jìn)行, 黑鯛()幼魚(yú)平均體重35±10g, 購(gòu)自該公司。每個(gè)黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)由500L養(yǎng)殖圓桶和一個(gè)生物過(guò)濾桶通過(guò)出入水管組裝而成。實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)3個(gè)循環(huán)率實(shí)驗(yàn)組, 每組3個(gè)重復(fù)共9個(gè)系統(tǒng)。每個(gè)養(yǎng)殖系統(tǒng)水體300L, 黑鯛幼魚(yú)放養(yǎng)密度為6.5kg/m3。低循環(huán)率組(A), 4次/天; 中循環(huán)率組(B), 8次/天; 高循環(huán)率組, 12次/天(C)。

實(shí)驗(yàn)魚(yú)在各自調(diào)節(jié)好流速的實(shí)驗(yàn)桶中暫養(yǎng)5d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)周期為6周。實(shí)驗(yàn)期間, 水溫18°C±0.5°C, 連續(xù)充氣, DO≥5.9mg/L, 鹽度25±1, pH 7.3±0.2, 自然光照。投喂海龍牌海水魚(yú)飼料(粗蛋白≥44%, 粗脂肪≥5%)。每天上午9:00和下午16:00各投喂1次, 日投喂量為魚(yú)體重的1 %。每天上午投喂前進(jìn)行吸污, 并補(bǔ)水10%左右。

1.2 樣品采集

1.2.1 水樣采集 分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第2、7、14、21、28、35、42天采集水樣。在上午投喂后4h, 分別用500mL水樣瓶從每個(gè)系統(tǒng)的養(yǎng)殖桶和過(guò)濾桶出水口采集水樣, 及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室用于分析氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)。

1.2.2 微生物樣品采集 在實(shí)驗(yàn)中期的第3周(第21天), 分別采集三個(gè)實(shí)驗(yàn)組養(yǎng)殖桶水樣中微生物(A1、B1、C1)和生物過(guò)濾桶中的微生物(A2、B2、C2)樣品。分別在每個(gè)養(yǎng)殖桶采集1L水樣, 同時(shí)在每個(gè)過(guò)濾桶中取濾料上的微生物樣品, 每個(gè)濾桶樣品約20g, 將濾料剪碎放入50mL離心管, 注入PBS緩沖液震蕩, 使微生物脫離濾料表面, 收集水樣。然后將養(yǎng)殖桶水樣和過(guò)濾桶樣品, 用0.22μm的無(wú)菌纖維素濾膜真空抽濾, 將抽濾后的濾膜取出放置于10mL的無(wú)菌離心管中, –80°C冰箱保存待送測(cè)。

1.3 氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽檢測(cè)

水質(zhì)指標(biāo)氨氮(NH3)、亞硝酸鹽(NO2)、硝酸鹽(NO3)、磷酸鹽(PO4)、總氮(TN)、總磷(TP)。按照GB/T 12763.4-2007 海洋調(diào)查規(guī)范測(cè)定各水樣營(yíng)養(yǎng)鹽含量(中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局等, 2008)。經(jīng)0.45μm纖維濾膜抽濾取25mL水樣濾清液進(jìn)行分析, 每個(gè)水樣三個(gè)重復(fù)。

1.4 DNA提取及擴(kuò)增測(cè)序

利用水體環(huán)境基因組提取試劑盒Water DNA kit (Omega)對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。以獲取的DNA為模板, 用16S rRNA V3—V4區(qū)保守區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并剪切純化回收產(chǎn)物后建庫(kù)并測(cè)序。測(cè)序由諾和致源生物信息公司完成。

1.5 生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理: (1) 通過(guò)Cutadapt低質(zhì)量部分剪切reads, 比對(duì)Barcode區(qū)分出樣品分類數(shù)據(jù), 經(jīng)簡(jiǎn)化得到原始數(shù)據(jù)(raw reads); (2) 為了得到有效數(shù)據(jù)(clean reads), 還需根據(jù)物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)Reads序列去除其中的嵌合體序列; (3) 各樣品OTUs (Operational Taxonomic Units)是通過(guò)Uparse軟件以97%的一致性將clean reads聚類, 其后而成。

統(tǒng)計(jì)分析: (1) 對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋分析得到各樣本在各分類水平上的群落組成。(2) 最后以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)均一化處理, 所得的數(shù)據(jù)通過(guò)Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算各樣品數(shù)據(jù)的多樣性指數(shù)和Unifrac距離、構(gòu)建UPGMA樣本聚類樹(shù)。使用R軟件(Version 2.15.3)繪制PCoA圖。(3) 對(duì)于環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析, 使用vegan包對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行CCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同循環(huán)率對(duì)水質(zhì)指標(biāo)的影響

三個(gè)循環(huán)率組的水質(zhì)因子變化如圖1所示, 活性磷酸鹽濃度的變化范圍在0.7—4.61mg/L, 其濃度隨著循環(huán)率的增大有上升趨勢(shì), 隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng), 三個(gè)流量組的變化規(guī)律一致, 呈逐漸上升的趨勢(shì)。亞硝酸鹽濃度的變化范圍在0.08—0.95mg/L, 在實(shí)驗(yàn)期間三個(gè)流量組之間亞硝酸濃度并沒(méi)有顯著性差異(>0.05), 3組的變化規(guī)律也相似, 都先上升后下降的趨勢(shì), 在21d時(shí)達(dá)峰值; 硝酸鹽濃度的變化范圍在0.31—35.05mg/L, 在實(shí)驗(yàn)早期濃度波動(dòng)較大, 在實(shí)驗(yàn)?zāi)└吡髁拷M顯著低于低中流量組(<0.05); 氨氮濃度的變化范圍在1.22—7.65mg/L, 在實(shí)驗(yàn)第14天和第21天時(shí), 高流量組氨氮濃度大于其他兩組, 而在第28天后, 高流速組氨氮濃度均在中低流速組之下, 其中第35天時(shí), 差異顯著(<0.05)。總氮的變化范圍在30.69—56.32mg/L, 高流速組總氮含量在第21天后開(kāi)始下降, 低、中流速組則呈逐漸上升趨勢(shì); 總磷的變化范圍在5.34—14.92mg/L, 3組變化趨勢(shì)相同, 呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 在第7天達(dá)到最大值。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組營(yíng)養(yǎng)鹽濃度

注： 數(shù)據(jù)上標(biāo)不同表示組間存在顯著差異(<0.05)

2.2 細(xì)菌群落α多樣性分析

通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果整理分析, 經(jīng)過(guò)均一化的處理后, 如表1所示, 6個(gè)樣品最后得到有效序列在52418—80137條之間, 序列平均長(zhǎng)度在402—408bp之間, 各組獲得的有效OTU數(shù)量平均值為357.16, 其中各流量組養(yǎng)殖桶中的水環(huán)境OTU少于平均值, 生物桶中濾料上的OTU則多于平均值, 說(shuō)明生物過(guò)濾桶中細(xì)菌豐富度更高。物種豐富度指數(shù)chao1、ACE、shannon指數(shù)顯示, 生物過(guò)濾桶中的細(xì)菌群落豐富度和多樣性均高于養(yǎng)殖桶, 其中, 高流量組和中流量組的生物過(guò)濾桶中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性要低于低流量組的。而在高流量組和中流量組的養(yǎng)殖桶中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性卻高于低流量組的。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品的測(cè)序覆蓋率都超過(guò)了0.99, 說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋了大部分OTU, 能很好地反映物種多樣性。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

選取每個(gè)樣本門水平(Phylum)上最大豐度排名前10的物種, 生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖, 6個(gè)樣品中的物種注釋結(jié)果如圖2所示, 可以看出各樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成比較相似, 但同一類群的相對(duì)豐度存在較大區(qū)別。各樣品中細(xì)菌種群主要分布在變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes), 在6個(gè)樣品中所占的比例分別為58%—86%和8%—19%, 其他幾個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門分別是放線菌門(Actinobacteria, 0.8%—14%)、疣微菌門(Verrucomicrobia, 0.5%—3%)、厚壁菌門(Firmicutes, 0.2%—2%)等。

在屬水平上, 選取最大相對(duì)豐度排名前30的物種, 生成如圖2所示柱型累加圖。在6個(gè)樣品中(0.3%—19%)、(0.09%—17%)、(0.1%—15%)、(1%—12%)、(0.09%—11%)5個(gè)屬的相對(duì)豐度最高, 其中來(lái)自紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)的ter和a在養(yǎng)殖桶中占比(8%—19%, 3%—17%)明顯高于過(guò)濾桶中的(0.3%—1%, 0.09%—0.7%)。

表1 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

Tab.1 The diversity index of bacterial communities

圖2 門水平(a)和屬水平(b)上各樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息, 選取豐度排名前35的屬, 根據(jù)其在每個(gè)樣本中的豐度信息進(jìn)行聚類。聚類熱圖如圖3所示, 可以看出3組系統(tǒng)環(huán)境微生物中, 隨著流量的上升, 斯氏弓形菌屬(, 0.51%)、小紡錘狀菌屬(, 2.2%)、(2.1%)、弧菌屬(, 1.3%)、硫酸鹽桿菌屬(, 14%)、(15.3%)相對(duì)豐度明顯下降。而中、高流速組系統(tǒng)分別在系統(tǒng)內(nèi)部環(huán)境微生物中少數(shù)幾種屬豐度明顯升高, 中流量中包括陸丹氏菌屬(, 1.2%)、(1.7%)、(1.1%)、乙醇速生桿菌屬(, 2%)、(2.1%); 高流量組中包括(6.7%)、(2.5%)、(17.7%)。另外, 篩選出若干豐度不高, 但對(duì)水環(huán)境凈化以及對(duì)水生物病害防控起到重要作用的功能性細(xì)菌以及對(duì)魚(yú)體存在潛在致病性的細(xì)菌, 如圖4所示?？梢钥闯? 樣品中可檢測(cè)到的條件致病菌為鏈球菌屬()。參與氮循環(huán)及與硝化功能相關(guān)的屬包括亞硝化單胞菌屬()、黃桿菌屬和藍(lán)細(xì)菌()。具有還原硫酸鹽功能的屬假單胞菌屬()。具有調(diào)控水體微生物及病害防控功能的屬乳桿菌屬()。其中, 鏈球菌屬的相對(duì)豐度隨流量的升高而上升, 由0.075%上升至0.41%。亞硝化單胞菌屬的相對(duì)豐度隨流量的升高先下降后上升, 變化范圍在0.003%—0.023%。黃桿菌屬和藍(lán)細(xì)菌的相對(duì)豐度都隨流量的升高而上升, 分別由0.09%上升至0.3%和由0.07%上升至0.16%。假單胞菌屬的相對(duì)豐度隨流量的上升先上升后下降, 變化范圍在0.08%—0.2%。乳桿菌屬的相對(duì)豐度則隨流量的上升先下降后上升, 變化范圍在0.19%—0.5%。

圖3 各樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌物種豐度熱圖

圖4 各組細(xì)菌特定屬相對(duì)豐度變化

2.4 細(xì)菌群落相似性分析

主坐標(biāo)分析(PCoA, Principal Co-ordinates Analysis),是通過(guò)一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu), 是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法。本研究中, PC1貢獻(xiàn)率為70.25%, PC2貢獻(xiàn)率為18.06%, 累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了88.31%。由圖5a顯示, 三個(gè)流量組的養(yǎng)殖水環(huán)境和生物過(guò)濾桶中的細(xì)菌群落存在明顯差異。隨著流速的升高, 其養(yǎng)殖桶中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不發(fā)生明顯的改變, 而生物過(guò)濾桶中的細(xì)菌群落隨著流速的上升, 中、高流速組相較于低流速組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較明顯的變化。

對(duì)6個(gè)樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類分析, 構(gòu)建如圖5b所示的聚類樹(shù)。結(jié)果顯示, 三個(gè)流速組的養(yǎng)殖桶菌群結(jié)構(gòu)聚為一類, 與3個(gè)流速組的生物過(guò)濾桶菌群有較大差異。在三組養(yǎng)殖桶菌群結(jié)構(gòu)中, 中流量組又與低、高流量組有所不同; 而在各組生物過(guò)濾桶中, 低流速組則與中和高流速組有所差異。

圖5 細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析圖(a)和聚類分析圖(b)

2.5 細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性結(jié)果可由多元直接梯度分析(CCA分析)所得, 該分析方法可反映整體菌群數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)環(huán)境因子的關(guān)系, 并進(jìn)一步得到影響樣本分布的重要環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子。從表2可以看到細(xì)菌與環(huán)境之間的關(guān)系累積變化值達(dá)到了65.31%(第一排序軸CCA1和第二排序軸CCA2貢獻(xiàn)率之和), 表中2代表了環(huán)境因子對(duì)物種分布的決定系數(shù), 其值與環(huán)境因子對(duì)物種分布影程度呈正相關(guān)。Pr表示相關(guān)性的顯著性檢驗(yàn)。6個(gè)環(huán)境因子中, 總磷、活性磷酸鹽、亞硝酸鹽和總氮含量與細(xì)菌群落豐富度和多樣性密切相關(guān)。其中TN、TP與第一排序軸呈正相關(guān), 其他營(yíng)養(yǎng)鹽與其呈負(fù)相關(guān)。但是總體而言, 這6個(gè)營(yíng)養(yǎng)鹽因子與菌群的分布無(wú)顯著性影響(>0.05)。

表2 環(huán)境因子與細(xì)菌群落相關(guān)性

Tab.2 Correlation between environmental factors and bacterial communities

3 討論

循環(huán)率是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中一個(gè)重要的技術(shù)參數(shù), 適合的流量不僅有助于生物濾桶內(nèi)基質(zhì)的擴(kuò)散和接觸, 還可促進(jìn)氨氧化菌的生長(zhǎng)。Franco-Nava等(2004)和曹涵(2008)認(rèn)為一定的流速會(huì)提高生物濾器的去除能力從而改善水質(zhì)。本研究中, 三個(gè)實(shí)驗(yàn)組水質(zhì)營(yíng)養(yǎng)鹽濃度檢測(cè)結(jié)果顯示, 在實(shí)驗(yàn)后期高流量組對(duì)氨氮和總氮的去除能力明顯比其他兩組強(qiáng), 氨氮屬于有害營(yíng)養(yǎng)鹽, 而總氮與水體有機(jī)物含量密切相關(guān)(Klausmeier, 2004; 文世勇等, 2009)。這表明, 在系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定后, 高流量組對(duì)氨氮的去除能力及對(duì)水質(zhì)的凈化效果較其他兩組更佳。在第21天的生物膜菌群也顯示出中、高流量組中優(yōu)勢(shì)菌種氨氧化菌屬相對(duì)豐度(21%, 12%)要明顯高于低流速組(1.09%),是α-Proteobacteria綱中Rhodobacteraceae紅桿菌科中的一種紫色非硫菌, 可通過(guò)氨化作用降低水中化學(xué)需氧量(COD)(欽穎英等, 2007; 黃志濤等, 2016)。但在實(shí)驗(yàn)中期(21d), 高流速組的氨氮含量卻顯著高于其他兩組, 這可能跟高流速組黑鯛攝食能力更強(qiáng), 日投餌量和代謝能力要高于其他兩組, 加之功能菌群的滯后行使凈化功能有關(guān)。另外, 在分析實(shí)驗(yàn)中期的3組系統(tǒng)環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)高流速組中具有固氮作用功能菌屬藍(lán)細(xì)菌()的豐度升高以及具有硝化作用功能的亞硝化單胞菌屬()豐度下降, 也造成了該時(shí)期高流量養(yǎng)殖系統(tǒng)中的氨氮更嚴(yán)重得積累。有研究表明循環(huán)水系統(tǒng)中溶解氧濃度會(huì)隨流量的升高而升高(李雪晴, 2018), 在低流量下, 更易形成區(qū)域缺氧環(huán)境, 可能發(fā)生活躍的脫氮作用, 使環(huán)境硝酸鹽含量降低, 并有利于具有脫氮作用的兼性厭氧菌的生長(zhǎng)。本研究中低流速組的硝酸鹽含量在第21天時(shí)顯著低于其他兩組, 可能原因就在于此, 并發(fā)現(xiàn)了低流量組優(yōu)勢(shì)菌種中具有反硝化功能的兼性厭氧菌的相對(duì)豐度要明顯高于其他兩組, 包括了斯氏弓形菌屬()、和。結(jié)合三組氨氮及亞硝酸鹽濃度都在第21天開(kāi)始下降, 推斷三個(gè)流量組的生物過(guò)濾桶循在此時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始建立穩(wěn)態(tài)的細(xì)菌生物膜并能有效地凈化水質(zhì)。隨后, 對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行環(huán)境菌群取樣, 分析三組之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異以及其與環(huán)境因子相互關(guān)聯(lián)分析。

鑒于微生物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要性, 微生物生態(tài)學(xué)的關(guān)鍵問(wèn)題之一是微生物群落如何響應(yīng)環(huán)境的變化。周洪玉等(2017)研究指出, 養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌群落的高多樣性更有利于水體穩(wěn)態(tài), 減少病害的暴發(fā)。姚延丹等(2011)對(duì)比人工濕地-池塘養(yǎng)殖系統(tǒng)和傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘的水體生物特征, 發(fā)現(xiàn)隨著循環(huán)水的流量增大, 水環(huán)境中的細(xì)菌多樣性也隨之提高(姚延丹等, 2011)。本研究中, Alpha多樣性分析結(jié)果顯示, 隨著流量的增加, 養(yǎng)殖桶中的OTU數(shù)量隨之增加, 這與細(xì)菌多樣性指數(shù)ACE、Chao1和Shannon指數(shù)的變化相同。而生物過(guò)濾桶中的OTU隨著流量的升高呈下降趨勢(shì), 且高流量組的細(xì)菌多樣性指數(shù)也比其他兩組的要低。以上結(jié)果表明, 高流量雖然提高了養(yǎng)殖水環(huán)境細(xì)菌的多樣性和豐度, 但卻降低了生物過(guò)濾桶中細(xì)菌多樣性和豐度。分析原因可能是: 已有相關(guān)報(bào)道表明生物池過(guò)濾后的水樣中細(xì)菌OTU總數(shù)較過(guò)濾前會(huì)有所提高(Leonard, 2000; 張翔等, 2016), 這說(shuō)明附著在濾料上的細(xì)菌會(huì)脫落進(jìn)入水環(huán)境中, 而流量的提高會(huì)時(shí)細(xì)菌更容易脫落(姚延丹等, 2011)。但總體而言, 高流量組養(yǎng)殖水環(huán)境和生物濾桶中OTU數(shù)量之和(496)大于低流量組的OTU總數(shù)(486)和中流量組的OTU總數(shù)(460)。說(shuō)明高流量更有利于水體穩(wěn)態(tài), 使水環(huán)境中的高濃度有害營(yíng)養(yǎng)鹽更快通過(guò)硝化作用回歸正常值, 這與在第21天后的水質(zhì)結(jié)果基本相似。另外, 本實(shí)驗(yàn)中, 對(duì)比了3組系統(tǒng)養(yǎng)殖桶和循環(huán)桶中優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度發(fā)現(xiàn), 屬上相對(duì)豐度最高且無(wú)運(yùn)動(dòng)能力的4個(gè)屬、、、在養(yǎng)殖桶中占比(最高分別是19%, 17%, 15%, 12%)要明顯高于循環(huán)桶(最高分別是1%, 0.7%, 0.4%, 1%), 這是否與無(wú)運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌遇到水流的作用更易脫落進(jìn)入養(yǎng)殖桶中有關(guān)還需要進(jìn)一步研究。

對(duì)海洋微生物群落的研究表明, Proteobacteria和Bacteroidetes是世界各地不同季節(jié)海水中的主要微生物群體(Gilbert, 2009; Tinta, 2015)。在淡水生境中, 許多關(guān)于河流, 湖泊和水庫(kù)沉積物中細(xì)菌群落的報(bào)道已經(jīng)顯示出來(lái)類似的結(jié)果(Cheng, 2014)。在本研究中, 3個(gè)流量組中不管是養(yǎng)殖桶還是生物過(guò)濾桶中, Proteobacteria(58%—86%)豐度都是最高的。伴隨著流量的提高, 3個(gè)組總體γ-Proteobacteria豐度也隨之升高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, γ-Proteobacteria類群廣泛存在于是循環(huán)水健康養(yǎng)殖池及一些魚(yú)類的皮膚、腮、腸道中(Roeselers, 2011), 且養(yǎng)殖水體好壞的與其豐度存在正相關(guān), 豐度越高越有利于養(yǎng)殖動(dòng)物的健康生長(zhǎng)(Hu, 2007; Schreier, 2010; 吳越等, 2017)。

有研究表明, 環(huán)境微生物的分布存在顯著的區(qū)域差異, 具有類似功能的微生物往往聚集在一起(Xu, 2019)。本研究中, 三組流量組系統(tǒng)中豐度相似的優(yōu)勢(shì)屬有9個(gè)。包括、、等功能性有益菌。另外14個(gè)優(yōu)勢(shì)屬在三組系統(tǒng)中差異較大。其中, 低流量組優(yōu)勢(shì)屬有6個(gè), 包括條件致病菌斯氏弓形菌()和弧菌屬(), 弧菌可引起大規(guī)模水產(chǎn)疾病發(fā)生并造成嚴(yán)重死亡(Higgins, 2007; Zhang, 2013); 中流量組優(yōu)勢(shì)屬有5個(gè), 包括可降解多環(huán)芳烴的乙醇速生桿菌()、; 高流量組優(yōu)勢(shì)屬有3個(gè), 包括可生產(chǎn)細(xì)菌葉綠素的。說(shuō)明流量的變化會(huì)使環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一些差異。通過(guò)聚類分析也可看出這一現(xiàn)象, 三組生物過(guò)濾桶細(xì)菌群落相似性要高于過(guò)濾桶和養(yǎng)殖桶之間的相似性, 說(shuō)明在過(guò)濾桶這樣更為復(fù)雜的環(huán)境中, 由于溶氧、光照、有無(wú)附著濾料等條件制約下, 會(huì)形成與養(yǎng)殖桶截然不同的細(xì)菌結(jié)構(gòu), 這與吳越等(2017)的研究發(fā)現(xiàn)相一致。在過(guò)濾桶中, 中、高流量組細(xì)菌群落聚為一類。暗示了流量的升高會(huì)使生物濾膜趨向于選擇和形成相似的細(xì)菌結(jié)構(gòu)。而在低豐度菌群中, 黃桿菌屬()、和有益菌在高流量組系統(tǒng)中占比相較于其他兩組更高, 假單胞菌屬()則在中流量組更高。有研究表明能在某些條件下將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為各種還原性產(chǎn)物, 可降低養(yǎng)殖水體含氮量(Ma, 2013; Mcbride, 2014; 張海耿等, 2017);屬于綠彎菌門, 其可通過(guò)自身生產(chǎn)的細(xì)菌葉綠素進(jìn)行光合作用(黃志濤等, 2016);代謝可以產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫、雙乙酞等多種天然抑菌物質(zhì), 具有調(diào)節(jié)水體菌群平衡, 并可提高魚(yú)體免疫力等多種功能(韓俊華, 2003)。假單胞菌屬()可通過(guò)還原的硫酸鹽來(lái)降低水體硫的含量。通過(guò)CCA分析, 發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子和微生物種群之間相關(guān)性并沒(méi)有顯著相關(guān)性, 分析其原因可能是實(shí)驗(yàn)期間只探究了其實(shí)驗(yàn)中期一個(gè)時(shí)間點(diǎn)水質(zhì)與環(huán)境微生物的相關(guān)性(>0.05), 會(huì)因?yàn)闃颖玖窟^(guò)少造成相應(yīng)的誤差。

4 結(jié)論

綜上所述, 在本實(shí)驗(yàn)循環(huán)水條件運(yùn)行過(guò)程中, 3個(gè)循環(huán)率組養(yǎng)殖桶中氨氮和亞硝態(tài)氮濃度均在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第21天開(kāi)始下降, 說(shuō)明3個(gè)組生物膜在第21天都已經(jīng)掛膜穩(wěn)定。3個(gè)循環(huán)率組養(yǎng)殖桶中菌群結(jié)構(gòu)差異不明顯, 而與3組過(guò)濾桶生物膜中菌群結(jié)構(gòu)有較大差異, 且隨著循環(huán)率增大, 生物膜中細(xì)菌結(jié)構(gòu)也發(fā)生較明顯的改變。其中有益菌屬、黃桿菌屬()、和等在高循環(huán)率組中占比變高, 而潛在致病菌斯氏弓形菌()和弧菌屬()在中、高循環(huán)率組中占比變低。通過(guò)分析水樣中營(yíng)養(yǎng)鹽與群落分布的相關(guān)性發(fā)現(xiàn), 總磷、總氮、活性磷酸鹽和亞硝酸鹽含量雖然與細(xì)菌群落豐富度和多樣性密切相關(guān), 但沒(méi)有顯著性差異。本研究全面了解了不同循環(huán)率下養(yǎng)殖桶和循環(huán)桶中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。但由于微生物掛膜應(yīng)該是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程, 而此次試驗(yàn)僅在實(shí)驗(yàn)中期一個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣, 今后應(yīng)該研究增大采樣時(shí)間點(diǎn)(比如實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)運(yùn)行后的前、中、后期)來(lái)改進(jìn), 全面了解水體各功能群體動(dòng)態(tài)變化。

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EFFECTS OF FLOW RATE ON WATER QUALITY FACTORS AND MICROBIAL COMMUNITY IN RECIRCULATING AQUACULTURE SYSTEM FOR

LI Lu-Guo1, LUO Yun-Hui1, XU Shan-Liang1, 2

(1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Zhejiang Key Laboratory of Marine Bioengineering, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In order to investigate the effects of flow rate on water quality factors and bacterial community diversity in recirculating aquaculture systems, black cockroach () was taken as the research object, on which the bacterial community structure, diversity, and the correlation between bacterial communities and environmental factors of the culture barrel and biological filter barrel were studied in three flow rates of 4 (low), 8 (medium), and 12 times/d (high). High-throughput sequencing was used. Results showed that the dominant bacterial groups in the circulatory aquaculture were Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobia and Firmicutes. The increase of flow rate enhanced the bacterial diversity of the system. The beneficial bacteria capable of purifying water and reducing nutrient salt in high-flow filter bucket were more diverse and richer, with which the system had better effects on removing ammonia nitrogen and total nitrogen and the removal rates were 49.5% and 22.3%, respectively. The ammonia nitrogen removal rate was 2.9 times of the low rate group and 3.6 times of the medium rate group, and the total nitrogen removal rate was 8.2 times of low rate group. Double and 20.5 times of the medium rate group. Results of PCoA analysis and cluster analysis revealed significant differences in bacterial community composition between the culture barrels and the biological filter barrels. In addition, a significant difference was observed in colony structure of the biological filter barrel between the medium-high rate groups and the low rate group. Correlation analysis showed that total phosphorus, active phosphate, nitrite, and total nitrogen had relatively significant effects on bacterial community structure, but no significant correlation was found between the environmental factors and the bacterial community structure.

; recirculating aquaculture; bacterial community; high-throughput sequencing; flow rate

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 31872586號(hào); 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目, LY18C190008號(hào); 寧波市科技攻關(guān)項(xiàng)目, 2017C110003號(hào)。李盧國(guó), 碩士研究生, E-mail: 1059154834@qq.com

徐善良, 教授, 博士生導(dǎo)師, E-mail: xushanliang@nbu.edg.cn

2019-11-08,

2019-12-11

S965

10.11693/hyhz20191100209