徐耀銘，周文靜，2，趙林，山花，趙文博，吉訓(xùn)明

腦缺血再灌注損傷（i s c h e m i c -reperfusion injury，I-RI）可以導(dǎo)致局灶性神經(jīng)功能缺損和血管性認(rèn)知障礙，對(duì)患者危害較大。血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）病理生理機(jī)制異常復(fù)雜，臨床上發(fā)現(xiàn)多數(shù)卒中患者都出現(xiàn)了不同程度的VCI癥狀，約30%發(fā)展為癡呆[1]，目前仍缺乏有效的治療措施。遠(yuǎn)隔缺血處理（remote ischemic conditioning，RIC）通過使器官短暫非損傷性的適度缺血刺激，達(dá)到缺血-再灌注進(jìn)而激活機(jī)體內(nèi)部的保護(hù)機(jī)制，使遠(yuǎn)隔臟器可以耐受較長(zhǎng)時(shí)間的缺血性損傷，減輕腦組織損傷[2]，但能否減輕腦I-RI所致的認(rèn)知障礙仍結(jié)果未知。本研究通過建立血管認(rèn)知功能障礙動(dòng)物模型，研究RIC是否在腦組織缺血再灌注VCI中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重220～260 g。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均為在入組前進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)并測(cè)定為反應(yīng)正常的大鼠。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)通遼市醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 應(yīng)用雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞（bilateral common carotid arteries occlusion，BCCAO）方法制備腦缺血再灌注致VCI模型。將SD大鼠分為假手術(shù)組、對(duì)照組（VCI組）及RIC組（VCI+RIC組），每組8只SD大鼠，對(duì)照組為VCI成功建模的大鼠，RIC組為對(duì)VCI模型實(shí)施RIC的大鼠。三組分別進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)定以評(píng)估認(rèn)知功能，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)選取5只取腦組織進(jìn)行HE染色，電鏡下觀察各組大鼠腦白質(zhì)及海馬病理改變及神經(jīng)元凋亡情況。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?采用BCCAO方法制備SD大鼠VCI模型[3]，具體方法：各組大鼠經(jīng)肛門注入10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉。麻醉后大鼠仰臥位并固定，消毒后行頸部縱向正中切口，依次分離皮下各組織，充分暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈鞘。采用4-0號(hào)手術(shù)縫合線做線扣阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流先進(jìn)行缺血20 min，然后恢復(fù)再灌注10 min；如此重復(fù)3次。在第一次結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min內(nèi)，在大鼠尾尖約1 cm處斷尾，放血約0.3 mL。3次腦缺血-再灌注結(jié)束后觀察大鼠30 min，狀態(tài)平穩(wěn)后逐層縫合手術(shù)切口。假手術(shù)組大鼠手術(shù)步驟同上，不進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎及斷尾放血。

1.2.2 遠(yuǎn)隔缺血處理 術(shù)后24 h，對(duì)RIC組大鼠行雙側(cè)后肢同時(shí)RIC處理。彈力繩線加壓捆綁鼠雙后肢根部，阻斷血流，以皮膚發(fā)紫、遠(yuǎn)端肢體皮溫下降、脈搏消失為缺血標(biāo)志，持續(xù)5 min；松開線繩，以皮膚潮紅、遠(yuǎn)端溫度回升、脈搏再現(xiàn)為再灌注標(biāo)志，持續(xù)5 min，4次/日，連續(xù)干預(yù)21 d[4]。

1.2.3 Morris水迷宮的行為學(xué)評(píng)定 三組大鼠均于RCI結(jié)束后立即進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)估。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，包括逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)由設(shè)計(jì)圓形水池、圖像自動(dòng)采集處理系統(tǒng)、水下平臺(tái)組成。記錄大鼠運(yùn)動(dòng)曲線軌跡及分析處理信息，通過記錄觀察大鼠在目標(biāo)象限中停留的相關(guān)軌跡曲線圖判斷其探索運(yùn)動(dòng)的規(guī)律性。水池直徑110 cm，高40 cm，水溫（22±2）℃。水下圓形站臺(tái)直徑10 cm，高22 cm，距池壁28 cm。將水池人為劃分為4個(gè)象限，目標(biāo)象限為第3象限，記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，將120 s內(nèi)未找到平臺(tái)的大鼠引導(dǎo)至平臺(tái)停留10 s。定位航行試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5 d，第6天在水迷宮中沒有平臺(tái)的情況下進(jìn)行空間探索試驗(yàn)。

（1）定位航行試驗(yàn)：歷時(shí)5 d，觀察大鼠120 s時(shí)限在迷宮內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間。大鼠面壁從第3象限置入池內(nèi)開始計(jì)時(shí)，到登上站臺(tái)終止記錄。記錄各組大鼠第1天、第3天、第5天上臺(tái)所需的逃避潛伏期，計(jì)算平均時(shí)間。

（2）空間探索試驗(yàn)：檢測(cè)大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后對(duì)平臺(tái)空間位置的記憶能力，包括目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越原平臺(tái)位置次數(shù)。在第6天移除水下平臺(tái)，第3象限大鼠面壁入池，記錄120 s內(nèi)的運(yùn)動(dòng)曲線軌跡、目標(biāo)象限停留時(shí)間以及穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.2.4 HE染色 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后切取大鼠腦部白質(zhì)和海馬組織用于檢測(cè)，經(jīng)包埋切片、脫蠟、染色等步驟，顯微鏡下觀察，200×鏡下拍照。每個(gè)部位選擇5張切片，對(duì)每張玻片視野內(nèi)的海馬CA1和CA3區(qū)，計(jì)數(shù)神經(jīng)元數(shù)量，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析及重復(fù)測(cè)量方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 假手術(shù)組大鼠術(shù)后反應(yīng)及活動(dòng)基本正常，在術(shù)后24 h開始進(jìn)食水。對(duì)照組大鼠術(shù)后精神狀態(tài)較差，反應(yīng)相對(duì)遲鈍，進(jìn)食進(jìn)水較少，5 d后開始逐漸好轉(zhuǎn)。RIC組大鼠術(shù)后2 d后狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)，介于假手術(shù)組和對(duì)照組之間。至術(shù)后4周，對(duì)照組大鼠死亡2只；RIC組大鼠死亡1只；假手術(shù)組無死亡。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 第1天、第3天、第5天對(duì)照組及RIC組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組均有延長(zhǎng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除假手術(shù)組外，其他兩組大鼠逃避潛伏期時(shí)間隨著訓(xùn)練次數(shù)增加逐漸縮短。第1天、第3天兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第5天RIC組成績(jī)好于對(duì)照組，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第6天空間探索實(shí)驗(yàn)中，目標(biāo)象限停留時(shí)間假手術(shù)組與RIC組相近（47.2±10.2 s vs 41.2±9.7 s，P＞0.05），均優(yōu)于對(duì)照組（33.5±11.3 s），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；穿越平臺(tái)次數(shù)假手術(shù)組與RIC組相近（5.3±1.6 vs 4.7±1.2，P＞0.05），均多于對(duì)照組（2.8±1.3），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，對(duì)照組大鼠的運(yùn)動(dòng)曲線軌跡缺乏目的性而呈現(xiàn)出雜亂無章的平臺(tái)搜索軌跡，RIC組較對(duì)照組具有明確的目的性呈現(xiàn)出較規(guī)則曲線（圖1）。

2.3 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腦皮層組織神經(jīng)細(xì)胞無明顯病理改變。對(duì)照組可見皮層中錐體細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核固縮、深染，細(xì)胞間質(zhì)疏松，神經(jīng)纖維稀疏。RIC組較對(duì)照組相比，皮層細(xì)胞間質(zhì)疏松，神經(jīng)纖維變細(xì)，破碎細(xì)胞較少，細(xì)胞略皺縮。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列均勻緊密，核仁著色清晰，無明顯病理改變（圖2）。在對(duì)照組中，可見部分海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞有明顯的空泡樣變性，著色較淺，細(xì)胞體積皺縮。而RIC組較對(duì)照組，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞可見少量空泡樣變性，細(xì)胞體積輕度皺縮（圖3）。

定量計(jì)數(shù)各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元存活數(shù)目，與假手術(shù)組（CA1：93.53±5.01；CA3：104.63±8.26）相比，對(duì)照組CA1區(qū)和CA3區(qū)存活的錐體神經(jīng)元數(shù)目（CA1：51.03±4.95；CA3：78.53±5.31）明顯減少（均P＜0.05）；而與對(duì)照組相比，RIC組大鼠CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元存活數(shù)目（CA1：80.57±7.30；CA3：92.43±8.16）明顯增加（均P＜0.05）。

3 討論

腦I-RI是腦組織缺血區(qū)再灌注導(dǎo)致的二次損傷，其機(jī)制復(fù)雜涉及能量代謝障礙、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、興奮毒性氨基酸、細(xì)胞凋亡等[3]不同機(jī)制，多種機(jī)制共同參了神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損傷，特別是涉及線粒體結(jié)構(gòu)[5]，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡而出現(xiàn)VCI。目前治療VCI尚缺乏有效的方法，在防治領(lǐng)域探索新機(jī)制新方法是本研究的目的所在。

表1 三組大鼠行為學(xué)評(píng)定

圖1 各組空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)的游泳軌跡

圖2 各組大鼠腦皮層病理變化（HE染色，×200）

圖3 各組大鼠海馬區(qū)病理變化（HE染色，×200）

建立一個(gè)穩(wěn)定的VCI動(dòng)物模型至關(guān)重要，目前最常用于復(fù)制VCI患者神經(jīng)病理和行為學(xué)改變的是BCCAO模型。夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈會(huì)引起腦血流量的急劇下降，造成急性腦缺血。鑒于大鼠腦部側(cè)支循環(huán)較豐富，通過剪尾放血降低血壓可以增加模型的穩(wěn)定性。BCCAO法建立的動(dòng)物模型死亡率低，術(shù)后會(huì)出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)和記憶功能減退等臨床表現(xiàn)，組織病理學(xué)研究顯示腦I-RI可以引起海馬神經(jīng)元數(shù)量的減少。這些與人類VCI的臨床表現(xiàn)和病理特點(diǎn)相似，因此BCCAO模型可以作為研究VCI發(fā)病機(jī)制及相應(yīng)治療的可靠模型。術(shù)后大鼠表現(xiàn)出顯著的認(rèn)知功能障礙，已經(jīng)被證實(shí)可以作為研究VCI治療較為理想的動(dòng)物模型[6-7]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)常用于測(cè)試嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶功能情況的裝置之一。反復(fù)訓(xùn)練動(dòng)物學(xué)習(xí)利用附近的位標(biāo)尋找到水下隱匿的平臺(tái)，并測(cè)試尋找原來的平臺(tái)位置時(shí)穿越平臺(tái)的次數(shù)以及在平臺(tái)所在象限的時(shí)長(zhǎng)來判斷其記憶力[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，BCCAO術(shù)后的對(duì)照組大鼠其逃避潛伏期延長(zhǎng)，并出現(xiàn)穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)明顯減少及目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短的情況，提示腦I-RI可以引起大鼠的記憶力減退，建立了可靠的VCI模型。

RIC對(duì)缺血再灌注后遠(yuǎn)隔器官的保護(hù)機(jī)制尚不明確，而且不同形式的缺血處理使腦組織對(duì)嚴(yán)重缺血發(fā)生保護(hù)性耐受。目前認(rèn)為RIC的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制是多維度的。首先，RIC后可激活細(xì)胞因子、改變基因表達(dá)等多個(gè)環(huán)節(jié)產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用；另外，RIC可以減輕血腦屏障的破壞，減輕腦I-RI。國內(nèi)外學(xué)者證實(shí)，RIC的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制在發(fā)病3 h內(nèi)為第一階段（即時(shí)相），此階段內(nèi)源性物質(zhì)釋放去甲腎上腺素、緩激肽、腺苷等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；第二階段（延遲相），釋放后的內(nèi)源性物質(zhì)通過調(diào)控基因蛋白表達(dá)或介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)新蛋白合成實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用，此階段可持續(xù)48～96 h，甚至數(shù)周[11-12]。

本研究結(jié)果提示RIC可以明顯改善VCI大鼠的認(rèn)知功能障礙。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，RIC后腦I-RI大鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)增加，在目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)；組織病理學(xué)上RIC減輕了VCI大鼠海馬部位CA1區(qū)和CA3區(qū)結(jié)構(gòu)損傷和海馬神經(jīng)元丟失減少。以上結(jié)果說明RIC可以改善VCI模型大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力，可以減輕腦I-RI引起的海馬神經(jīng)元損傷，這提示了RIC具有神經(jīng)保護(hù)作用。

腦組織特別是海馬組織對(duì)血流量的依賴性強(qiáng)，對(duì)缺血缺氧性損傷較為敏感。研究發(fā)現(xiàn)腦I-RI會(huì)損傷神經(jīng)元，以海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷最為顯著，因此可導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙[13-15]。腦I-RI導(dǎo)致海馬部位發(fā)生的病理學(xué)損傷，在第2周、第4周以及第6周其神經(jīng)元的排列和數(shù)目發(fā)生明顯改變，以腦I-RI后第4周的神經(jīng)元損傷最為嚴(yán)重[6]。在本研究中，SD大鼠I-RI后海馬組織發(fā)生了類似的改變，與以往的研究結(jié)果一致。

Dave等[2]在2006年首次報(bào)道了遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理可減輕腦組織損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)大鼠心臟驟停前48 h，對(duì)大鼠實(shí)施雙下肢缺血預(yù)處理，組織學(xué)結(jié)果提示處理后腦部損失的神經(jīng)元數(shù)顯著減少。另一研究顯示，RIC可以減少線粒體內(nèi)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵物質(zhì)向細(xì)胞質(zhì)的釋放，阻斷了細(xì)胞凋亡從而減輕腦細(xì)胞損傷[16]。研究還發(fā)現(xiàn)，RIC治療腦缺血-再灌注大鼠后，醌氧化還原酶-1、組織核因子E2相關(guān)因子2、血紅素加氧酶-1表達(dá)上調(diào)，腦組織水腫和梗死體積減小，SOD活性增強(qiáng)。這些結(jié)果顯示RIC通過激活組織核因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件通路以及通過減少氧化應(yīng)激減輕腦缺血再灌注損傷[17]。缺血處理可以使蛋白激酶B大量活化，蛋白激酶B通路被激活發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。再灌注后海馬CA1區(qū)檢測(cè)到磷酸化蛋白激酶B及磷酸化一氧化氮的表達(dá)，推測(cè)為RIC通過磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B通路上調(diào)了一氧化氮水平，減輕了神經(jīng)元損傷[18]。

本研究顯示RIC可以改善VCI動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶功能，減輕神經(jīng)細(xì)胞的變性壞死，減輕腦白質(zhì)脫髓鞘。但目前RIC對(duì)VCI的臨床療效及其具體機(jī)制尚不十分明確。在本實(shí)驗(yàn)中顯示出RIC后腦I-RI大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元損傷減輕，存活的錐體神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，這表明RIC可以減輕VCI大鼠海馬部位的神經(jīng)元損傷。

綜上所述，RIC可以明顯改善腦I-RI后VCI大鼠的認(rèn)知功能障礙，可以減輕相應(yīng)腦區(qū)或海馬部位的神經(jīng)元損傷。提示RIC具神經(jīng)保護(hù)作用，有望成為VCI有效的治療方法。本實(shí)驗(yàn)不足之處為樣本量較少，其結(jié)果可能存在一定程度的偏倚。另外，本研究只觀察了RIC改善VCI大鼠模型的認(rèn)知功能障礙及腦組織病理變化，未對(duì)具體機(jī)制進(jìn)行研究。下一步應(yīng)從加大樣本量及具體機(jī)制方面開展更加深入的研究工作。

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【點(diǎn)睛】遠(yuǎn)隔缺血處理可改善腦缺血再灌注損傷所致血管性認(rèn)知障礙動(dòng)物模型的認(rèn)知障礙，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。