韓 劍， 陳開文， 紀(jì)文博， 陳 杭， 唐章虎

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830052； 2.新疆自治區(qū)高校農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830052； 3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 輪臺(tái)國家果樹資源圃，新疆 輪臺(tái) 841600)

杏褪綠卷葉病(Apricot chlorotic leaf roll，ACLR)是危害杏樹的一種高致死性植原體病害，中國、歐洲和北美均將其列入進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病害名錄[1-2]。該病害傳染性極強(qiáng)，病原可通過嫁接傳染、隨無癥帶菌苗木遠(yuǎn)距離傳播、介體昆蟲(木虱、葉蟬)在感病樹上取食后終生帶菌傳染，還可經(jīng)卵傳播[3]。2007年李文慧等[4]首次在新疆輪臺(tái)縣的杏園中發(fā)現(xiàn)杏褪綠卷葉病疑似病株，癥狀主要表現(xiàn)為葉片沿主脈向上翻卷成筒狀，早衰落果，果小味差，輕者產(chǎn)量降低，重者樹體整株死亡，并通過電鏡觀察確定引起杏褪綠卷葉病的病原為植原體。2010年韓冰[5]通過常規(guī)和巢氏PCR檢測(cè)進(jìn)一步確定引起新疆杏褪綠卷葉病的病原為植原體，通過序列相似性比較及系統(tǒng)發(fā)育研究，發(fā)現(xiàn)該植原體與植原體16SrⅤ-B亞組不同分離物的親緣關(guān)系最近，暫時(shí)命名為杏褪綠卷葉植原體新疆分離物。植原體病害防治是目前公認(rèn)的世界性難題，雖然藥物治療和控制昆蟲介體具有一定減輕和延緩發(fā)病的作用，但無法根除且不能阻止病原的再次侵染，同時(shí)還會(huì)引起環(huán)境污染及果實(shí)農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題。由于植原體尚不能人工分離培養(yǎng)，目前對(duì)于植原體的檢測(cè)主要是基于PCR技術(shù)發(fā)展出的巢氏PCR(Nested PCR)[6]、免疫捕獲PCR(Immuno capture PCR)[7]和實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time PCR)[8]等，這些方法雖然大大提高了植原體檢測(cè)的靈敏度和可靠性，但普遍存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作過程復(fù)雜和成本高等特點(diǎn)，極大限制了其作為快速檢測(cè)方法的推廣使用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是NOTOMI等[9]建立的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法具有檢測(cè)成本低、速度快、操作簡(jiǎn)易、特異性強(qiáng)、靈敏度高和可視化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，非常適合在基層推廣和病害現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物病原菌的檢測(cè)[10-12]，其中也包括一些植原體的LAMP檢測(cè)技術(shù)。如SUGAWARA等[13]以groEL基因和16S rRNA為靶序列建立翠菊黃化植原體的LAMP檢測(cè)方法；KOGOVEK等[14]以secA基因?yàn)榘袠?biāo)建立葡萄黃化植原體的LAMP檢測(cè)方法；SIEMONSMEIER等[15]以16S rRNA為靶序列建立梨衰退植原體的LAMP檢測(cè)方法。我國目前針對(duì)植原體建立的LAMP檢測(cè)方法較少，僅見韓劍等[16]建立了棗瘋病植原體LAMP可視化檢測(cè)方法；王圣潔等[17]以tuf基因?yàn)榘袠?biāo)建立了檢測(cè)5種16 SrⅠ組植原體的LAMP檢測(cè)方法。目前針對(duì)杏褪綠卷葉植原體的LAMP的快速檢測(cè)技術(shù)鮮見報(bào)道。因此，研究以tuf基因作為靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)LAMP引物，針對(duì)杏褪綠卷葉植原體新疆分離物建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、操作簡(jiǎn)便的LAMP可視化快速檢測(cè)技術(shù)，以期為新疆杏褪綠卷葉病的田間快速診斷、抗性種質(zhì)資源的篩選及高效檢疫與防控提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

杏褪綠卷葉病樣品于2018年采自新疆輪臺(tái)縣國家果樹資源圃，將采集的葉片上卷、葉肉有不規(guī)則褪綠斑的疑似杏褪綠卷葉病葉片及枝條于保鮮袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于4℃和-20℃冰箱中；同時(shí)采集健康杏樹植株枝葉作為對(duì)照。

泡桐叢枝植原體(Paulownia witches’ broom phytoplasma，PaWB)、棗瘋病植原體(Jujube witches’ broom phytoplasma，JWB)、柳樹叢枝植原體(Willow witches’ broom phytoplasma，WWB)和葡萄金黃化植原體(Flavescence dorée phytoplasma，F(xiàn)D)由新疆自治區(qū)高校農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供，Bst 2.0 Warm StartRDNA聚合酶、1xThermoPol反應(yīng)緩沖液均購于北京紐英倫NEB生物技術(shù)有限公司，MgSO4、dNTPs、甜菜堿(Betain)、鈣黃綠素(Calcein)、Taq PCR Master Mix購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 樣品總DNA提取

采用CTAB法[18]提取杏樹多年生枝條韌皮部總DNA，保存于-40℃低溫冰箱中備用。

1.3 PCR檢測(cè)

參照LEE等[19]的方法，根據(jù)植原體16S rDNA序列設(shè)計(jì)的通用引物R16mF2/R16mR2進(jìn)行普通PCR檢測(cè)。引物R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′，引物R16mR2: 5′-CTTAACCCCAATCATCGA-3′；普通反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板2.0 μL，引物 (10 μmol/L)各1.0 μL，Taq PCR Master Mix 12.5 μL，滅菌超純水8.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，50℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 LAMP反應(yīng)的建立和優(yōu)化

1.4.1 LAMP引物的合成和設(shè)計(jì) 從GenBank中搜集不同組植原體tuf基因的核苷酸序列，利用DNAMAN對(duì)上述序列進(jìn)行比較及一致性分析，找出杏褪綠卷葉植原體與其他植原體的基因差異位點(diǎn)和高度保守區(qū)域，利用在線軟件Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)設(shè)計(jì)多組引物，進(jìn)而根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)原理及要求，篩選出1套特異性引物，包括1對(duì)外引物ACLR-F3、ACLR-B3和1對(duì)內(nèi)引物ACLR-FIP、ACLR-BIP(表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司按照HPLC純度級(jí)別合成。

表1 LAMP引物序列

1.4.2 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)已報(bào)道LAMP基本原理，初步設(shè)計(jì)并建立杏褪綠卷葉植原體的LAMP反應(yīng)體系和程序，并對(duì)LAMP反應(yīng)體系的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化。外引物與內(nèi)引物濃度比為1∶1、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14；Mg2+為0～14.0 mmol/L，以0.5 mmol/L依次遞增；dNTPs為0.2～1.6 mmol/L，以0.2 mmol/L依次遞增；Bst 2.0 WarmStart?DNA聚合酶為1.6～12.8 U/μL，以1.6 U依次遞增；甜菜堿為0～1.6 mmol/L，以0.5 mmol/L依次遞增；鈣黃綠素濃度1.25 mmol/L，MnCl2濃度0.4～2.5 mmol/L，以0.2 mmol/L依次遞增。擴(kuò)增溫度55～68℃，依次遞增，反應(yīng)60 min；在最優(yōu)擴(kuò)增溫度條件下，分別擴(kuò)增20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min，確定最佳擴(kuò)增時(shí)間。每次試驗(yàn)均以滅菌的超純水作陰性對(duì)照。在恒溫水浴鍋中進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行分析，同時(shí)肉眼觀察PCR管中反應(yīng)液的顏色變化，篩選出最優(yōu)的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。

1.4.3 LAMP反應(yīng)特異性的測(cè)定 分別以杏褪綠卷葉植原體(16SrⅤ組)、棗瘋病植原體(16SrⅤ組)、葡萄金黃化植原體(16SrⅤ組)、泡桐叢枝植原體(16SrⅠ組)、柳樹從枝植原體(16SrⅠ組)陽性樣品及實(shí)驗(yàn)室保存的健康杏樹基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行分析，同時(shí)用肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化情況，確定其特異性。

1.4.4 LAMP反應(yīng)靈敏度測(cè)定 提取患病杏樹枝條韌皮部基因組總DNA，測(cè)定基因組DNA濃度，用滅菌超純水按10倍梯度進(jìn)行稀釋，采用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)稀釋樣品進(jìn)行普通PCR檢測(cè)，比較2種方法的靈敏度。

1.5 田間樣品檢測(cè)

在新疆輪臺(tái)縣采集疑似杏褪綠卷葉病植株枝條樣品30份，采用CTAB法提取枝條韌皮部基因組DNA后，用建立的LAMP檢測(cè)方法及普通PCR檢測(cè)方法對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，比較2種方法的陽性檢出率和符合率，驗(yàn)證LAMP方法的可行性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測(cè)方法的建立

經(jīng)優(yōu)化，LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)體系為25 μL，8 U/μL Bst 2.0WarmStartRDNA聚合酶0.5 μL，1×ThermoPol反應(yīng)緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L Betaine 2.0 μL，100 mmol/L MgSO41.5 μL，20 μmol/L內(nèi)引物ACLR-FIP/BIP各1.5 μL，10 μmol/L外引物ACLR-F3/B3各0.5 μL，1.25 mmol/L calcein 1.0 μL，12.5 mmol/L MnCl21.0 μL，模板DNA 1.0 μL， 補(bǔ)足滅菌超純水至25 μL。對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度擴(kuò)增結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)40 min后陽性樣品反應(yīng)液顏色變?yōu)榇渚G色，擴(kuò)增溫度從55～65℃均有梯形條帶產(chǎn)生，且60℃時(shí)梯形條帶最明亮，最終確定最佳反應(yīng)程序?yàn)?0℃水浴反應(yīng)60 min，80℃滅活5 min終止反應(yīng)。

電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，ACLR出現(xiàn)明顯的瀑布形條帶，空白對(duì)照未出現(xiàn)任何條帶(圖1A)，肉眼觀察反應(yīng)液顏色的變化，陽性管中的顏色為翠綠色，空白對(duì)照管中顯示的顏色為棕黃色(圖1B)。

注：M:100 bp DNA Ladder，1為空白對(duì)照，2～5為杏褪綠卷葉植原體。

Note: M, 100 bp DNA Ladder; 1, blank control; 2-5, phytoplasma of ACLR.

圖1ACLR-LAMP產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(A)與可視化檢測(cè)(B)結(jié)果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis (A) and visual detection (B) results of ACLR-LAMP products

2.2 LAMP檢測(cè)方法的特異性

特異性試驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示，隸屬于同組(16SrⅤ組)但不同亞組的葡萄金黃化植原體和不同組(16SrⅠ組)的泡桐叢枝植原體、柳樹叢枝植原體以及健康杏樹檢測(cè)結(jié)果均為陰性(圖2A)。建立的LAMP檢測(cè)方法能夠特異性地檢出杏褪綠卷葉植原體新疆分離物(圖2B-2)和同屬16SrⅤ-B亞組的棗瘋病植原體(圖2B-3)，肉眼觀察可見翠綠色，瓊脂糖凝膠電泳呈特征性梯形條帶。

注：A為可視化檢測(cè)，B為瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，M為100 bp DNA Ladder，1為健康杏樹，2為杏褪綠卷葉植原體，3為棗瘋病植原體，4為葡萄金黃化植原體，5為泡桐叢枝植原體， 6為柳樹叢枝植原體，7為空白對(duì)照。

Note: A, agarose gel electrophoresis detection; B, visual detection; M, 100 bp DNA Ladder; 1, healthy apricot tree; 2, phytoplasma of ACLR; 3,Jujube witches’ broom phytoplasma; 4, Flavescence dorée phytoplasma; 5, Paulownia witches’broom phytoplasma; 6, Willow witches’broom phytoplasma; 7, blank control.

圖2LAMP 特異性的瓊脂糖凝膠電泳(A)與可視化(B)檢測(cè)結(jié)果

Fig.2 Agarose gel electrophoresis (A) and visual detection (B) results from LAMP specificity analysis

2.3 LAMP檢測(cè)方法的靈敏度

從圖3看出，普通PCR對(duì)杏褪綠卷葉病植株韌皮部總DNA最小檢出限為5.0 ng/μL，LAMP最小檢出限為50 pg/μL， LAMP檢測(cè)方法的靈敏度比普通PCR高100倍。

注：A為普通PCR檢測(cè)， B為L(zhǎng)AMP可視化檢測(cè)；M為DL2 000 DNA Marker，1為 DNA濃度50 ng/μL，2為5.0 ng/μL，3為500 pg/μL; 4為50 pg/μL，5為5.0 pg/μL，6為空白對(duì)照。

Note: A, normal PCR detection; B, LAMP visual detection; M,DL 2000 DNA Marker; 1-5, DNA concentration is 50 ng/μL,5.0 ng/μL,500 pg /μL,50 pg/μL and 5.0 pg/μL respectively; 6, blank control.

圖3普通PCR檢測(cè)(A)和LAMP檢測(cè)(B)ACLR靈敏度

Fig.3 ACLR sensitivity of normal PCR detection (A) and LAMP detection (B)

2.4 LAMP方法的田間應(yīng)用效果

經(jīng)對(duì)田間30份疑似杏褪綠卷葉病植株韌皮部總DNA樣品的檢測(cè)，LAMP方法陽性檢出11份，常規(guī)PCR方法陽性檢出4份，陽性檢出率分別為36.6%和13.3%。表明，常規(guī)PCR檢測(cè)方法靈敏度極低，建立的LAMP方法比常規(guī)PCR方法更敏感，可以穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)對(duì)田間樣品中杏褪綠卷葉植原體的檢測(cè)。

3 結(jié)論與討論

建立的LAMP檢測(cè)方法最優(yōu)反應(yīng)體系為25 μL：8 U/μL Bst 2.0 WarmStart?DNA聚合酶0.5 μL，1×ThermoPol反應(yīng)緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L Betaine 2.0 μL，100 mmol/L MgSO41.5 μL，20 μmol/L內(nèi)引物ACLR-FIP/BIP各1.5 μL，10 μmol/L外引物ACLR-F3/B3各0.5 μL，1.25 mmol/L calcein 1.0 μL，12.5 mmol/L MnCl21.0 μL，模板DNA 1.0 μL，補(bǔ)足滅菌超純水至25 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃水浴反應(yīng)60 min，80℃滅活5 min終止反應(yīng)。建立的LAMP檢測(cè)方法能夠特異性地檢出杏褪綠卷葉植原體新疆分離物，LAMP檢測(cè)方法的靈敏度較高，比普通PCR檢測(cè)方法高100倍。

植原體在世界范圍內(nèi)分布廣泛，引起的植物病害已超過1 000余種，其中不乏一些重要的經(jīng)濟(jì)作物。植原體可通過介體昆蟲、人工嫁接和苗木等無性繁殖方式傳播，傳染性極強(qiáng)，加之植原體病害防治困難，因此從源頭杜絕病原，建立先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)才是防控此類病害的核心所在。近年來越來越多的診斷技術(shù)被應(yīng)用于一些重要的植原體病害檢測(cè)，而如何實(shí)現(xiàn)田間和現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)成為研究的一個(gè)焦點(diǎn)。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)所開發(fā)的植原體診斷技術(shù)，依賴于昂貴的熱循環(huán)儀器，限制了其在基層的推廣及現(xiàn)場(chǎng)的應(yīng)用。與PCR技術(shù)相比，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高效、快速，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，如依賴核酸序列擴(kuò)增(Nucleicacid sequence based amplification, NASBA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、鏈替代擴(kuò)增(Strand displacement amplification, SDA)、滾環(huán)核酸擴(kuò)增(Rolling circle amolification, RCA)和解鏈酶擴(kuò)增(Helix dependent amplification, HAD)等核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，正逐步在檢驗(yàn)檢疫、醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[20]。研究建立的ACLR-LAMP檢測(cè)體系擺脫了對(duì)昂貴熱循環(huán)儀器的依賴，僅需1臺(tái)水浴鍋甚至1個(gè)55℃恒溫保溫杯即能在1 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果可通過肉眼觀察直接判定，省去了通過瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果的繁瑣步驟，極大提高了檢測(cè)效率，因此非常適合在技術(shù)、條件相對(duì)落后的基層實(shí)驗(yàn)室、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)及現(xiàn)場(chǎng)快速診斷使用，具有很高的實(shí)用價(jià)值。

LAMP特異性引物的設(shè)計(jì)，其關(guān)鍵在于靶標(biāo)基因的選擇和LAMP引物的篩選，靶標(biāo)基因應(yīng)選擇亞組或種內(nèi)高度保守、組間變異性較高的基因。目前以16S rRNA、23S rRNA、SecA、groEL、tuf等基因?yàn)榘袠?biāo)的植原體LAMP檢測(cè)技術(shù)已見報(bào)道，但以不同靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)的LAMP引物其特異性存在較大差異。如JONGHE等[21]以植原體保守基因16SrRNA為靶標(biāo)基因建立了16S rⅩ組植原體LAMP檢測(cè)體系，僅能實(shí)現(xiàn)組間的特異性檢測(cè)，而針對(duì)同組內(nèi)不同亞組的植原體則無法進(jìn)行明確鑒別。KOGOVEK等[14]以更具變異性的SecA基因?yàn)榘袠?biāo)建立了16SrⅫ-A亞組植原體的特異性LAMP檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了從亞組水平上對(duì)植原體進(jìn)行定性分析。與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的延伸因子EF-Tu(tuf)基因，是植原體進(jìn)化演變的一個(gè)重要基因。研究發(fā)現(xiàn)，植原體tuf基因比16S rDNA基因的序列可變程度高，不同組之間相似性差異為17%左右，而同組不同亞組之間為3%左右[22]，因此更有利于設(shè)計(jì)組內(nèi)不同亞組或株系的特異性LAMP引物。該研究以植原體持家基因tuf基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)并篩選出1套特異性LAMP引物，特異性檢測(cè)結(jié)果表明，建立的LAMP檢測(cè)體系能夠特異性地檢出杏褪綠卷葉植原體新疆分離物和同屬16SrⅤ-B亞組的棗瘋病植原體，而隸屬于同組(16SrⅤ組)但不同亞組的葡萄金黃化植原體和不同組(16SrⅠ組)的泡桐叢枝植原體、柳樹叢枝植原體檢測(cè)結(jié)果為陰性，盡管設(shè)計(jì)的LAMP引物還無法區(qū)分同一亞組不同株系的植原體，但由于棗瘋病植原體和杏褪綠卷葉植原體其寄主范圍不同，因此并不影響其在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。此外，由于研究供試的植原體種類較少，因此還需廣泛收集植原體菌株，進(jìn)一步評(píng)估其特異性。

對(duì)于實(shí)際樣品的檢測(cè)LAMP的靈敏性明顯高于PCR檢測(cè)方法，原因主要是LAMP體系中添加的BstDNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，使得LAMP對(duì)于植物總DNA中的抑制劑(包括生物污染物)相較PCR反應(yīng)不敏感[23-24]。該研究建立的LAMP檢測(cè)體系靈敏度及對(duì)于田間疑似病樣的檢測(cè)結(jié)果均顯著高于普通PCR。但不同研究建立的植原體LAMP檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度存在較大差異。如SUGAWARA等[13]研究表明，以16S rDNA和groEL基因?yàn)榘袠?biāo)序列設(shè)計(jì)的不同LAMP引物組合其靈敏度存在明顯差異，分別比常規(guī)PCR低10～100倍；王圣潔等[17]建立的16SrⅠ組植原體LAMP檢測(cè)方法，靈敏度高于普通PCR但低于巢式PCR，原因可能與引物特性或無環(huán)引物有關(guān)；還有研究比較了不同熒光染料對(duì)LAMP靈敏性的影響，結(jié)果表明在LAMP反應(yīng)前加入SYBR Green Ⅰ作為熒光染料，會(huì)破壞DNA雙鏈的動(dòng)態(tài)平衡，抑制LAMP反應(yīng)。綜上，LAMP檢測(cè)方法的靈敏性與引物、靶標(biāo)序列、測(cè)定方法等有著密切的關(guān)系。