顧超

在慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者中，長(zhǎng)期氣流受限的主要原因是肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致氣腔的擴(kuò)大以及肺彈性組織降解［1］。引起肺氣腫及COPD最主要的危險(xiǎn)因素是吸煙［2］。在哺乳動(dòng)物中，肺泡上皮細(xì)胞是由I型肺泡上皮細(xì)胞（type I alveolar epithelial cells，AECI）和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（type II alveolar epithelial cells，AECII）組成。其中，AECII是AECI的祖細(xì)胞，并且在分泌肺泡表面活性物質(zhì)、維持肺泡內(nèi)液體平衡等方面發(fā)揮重要的作用［3］。Sirtuins是Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶，能夠?qū)Χ喾N非組蛋白去乙?；?，在基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝和細(xì)胞衰老中起到重要作用［4］。前期已有研究表明，SIRT1水平的下降會(huì)促進(jìn)COPD患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老和功能異常［5］。本研究通過(guò)SIRT1選擇性激動(dòng)劑SRT2104治療肺氣腫大鼠，并檢測(cè)其對(duì)大鼠肺損傷的修復(fù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)的雄性SD大鼠45只，體重170～200g，購(gòu)于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，并飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)溫度為21℃～25℃，相對(duì)濕度為40%～60%，12h明暗交替。（2）主要試劑：兔抗大鼠SPA和SPC抗體、羊抗兔IgG二抗（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司），TRIzol（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司），雄獅牌香煙（購(gòu)自浙江中煙工業(yè)有限公司）。SIRT1去乙酰化酶檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Enzo Life Sciences公司）；細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒（購(gòu)自江蘇碧云天公司）；SRT2104（購(gòu)自美國(guó)MedChem Express公司）。

1.2 方法 （1）肺氣腫大鼠模型的建立和SRT2104治療：將45只清潔級(jí)的雄性SD大鼠完全隨機(jī)平均分為3組，每組各15只，A組（正常對(duì)照組）、B組（肺氣腫組）、C組（肺氣腫+SRT2104治療組）；根據(jù)本課題組的前期方法［6］建立肺氣腫大鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。C組大鼠于建模第12周后開始按100mg/（kg·d）劑量灌胃SRT2104，共4周；其中，B組大鼠每天給予相同體積的生理鹽水灌胃。（2）肺功能檢測(cè)：采用小動(dòng)物肺功能儀測(cè)定各組大鼠的肺功能，大鼠麻醉消毒并切開頸部皮膚，將氣管倒“T型”切開，用食道插管經(jīng)口插入大鼠食道中部，并連接壓力傳感器記錄食道壓（胸腔負(fù)壓）、“Y型”套管氣管插管，采集信號(hào)，通過(guò)MPA肺功能分析計(jì)算氣道阻力（airway resistance，AR）、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（pulmonary dynamic compliance，Cdyn）及呼氣峰值流速（（peak expiratory flow，PEF）并取平均值。（3）大鼠肺組織病理學(xué)分析：大鼠肺功能測(cè)定后采用10%水合氯醛行腹腔麻醉處死。取肺組織，固定脫水后石蠟包埋并切片后，行蘇木素-伊紅（HE）染色，根據(jù)本課題組前期方法［6］，采用肺組織病理半定量分析其肺泡平均內(nèi)襯間隔（mlI）和平均肺泡面積（MAA）。（4）Realtime PCR測(cè)定SPA和SPC mRNA表達(dá)：收集各組大鼠肺組織，按試劑盒的說(shuō)明書合成cDNA，按照前期方法［6］行Real-time PCR，并以GAPDH作為內(nèi)參；以2-ΔΔCt分析目的基因的相對(duì)表達(dá)。其中，引物序列如下：SPA正義鏈5'-TCGGTGTCCCAGGATTTAG-3'，反 義 鏈 5'-CAGGGTGGCTGCTGTTAGT-3'；SPC正 義 鏈5'-CAGACACCATCGCTACCTT-3'， 反 義鏈 5'-TAGCCAAAGCCTCAAGACT-3'；GAPDH 正義鏈5'-GTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，反義鏈5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'。（5）Western blot測(cè)定SPA及SPC蛋白水平：按照本課題組前期方法［6］進(jìn)行。（6）衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性測(cè)定：采用染色法測(cè)定大鼠肺組織的SA-β-gal活性，按照試劑盒說(shuō)明書操作。（7）SIRT1去乙?；富钚詸z測(cè)：以比色法測(cè)定大鼠肺組織SIRT1去乙?；富钚裕瑖?yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料以（±s）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能AR、Cdyn及PEF比較 見表1。

表1 各組大鼠肺功能AR、Cdyn及PEF比較［n=15，（±s）］

表1 各組大鼠肺功能AR、Cdyn及PEF比較［n=15，（±s）］

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

組別 AR［cm/（ml·s）］ Cdyn（ml/cm） PEF（ml/s）A組 0.120±0.033 0.316±0.022 14.212±1.697 B組 0.341±0.028 * 0.179±0.017 * 6.882±1.452 *C組 0.254±0.022 *# 0.208±0.031 *# 10.420±3.663 *#F值 45.042 53.332 7.346 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 肺組織病理學(xué)改變 各組大鼠的肺組織采用常規(guī)HE染色，B組及C組大鼠的肺組織出現(xiàn)肺氣腫病理特征：部分肺泡出現(xiàn)囊狀擴(kuò)張，部分肺泡腔不規(guī)則，并且相同視野內(nèi)的肺泡數(shù)目顯著減少，部分肺泡間隔出現(xiàn)斷裂，進(jìn)而肺泡融合；但是，SRT2104治療后肺組織肺氣腫改變程度顯著減輕，見圖1。肺組織病理的半定量分析證實(shí)，B組大鼠肺組織mlI及MAA顯著高于A組（P＜0.05），而SRT2104治療后（C組）大鼠肺組織mlI及MAA顯著低于B組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠肺組織的mlI及MAA變化（n=15，±s）

表2 各組大鼠肺組織的mlI及MAA變化（n=15，±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

組別 mlI（μm） MAA（μm2）A組 64.34±12.33 4938.39±501.92 B組 121.65±12.22* 12488.89±1146.42*C組 80.98 ±11.30 *# 7983.88±358.12 *#F值 28.782 97.367 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變（HE染色，×200）

2.3 SPA和SPC mRNA表達(dá)水平 采用Real-time PCR檢測(cè)大鼠肺組織的SPA和SPC mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，與A組比較，B組大鼠肺組織中SPA及SPC mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；而SRT2104治療后（C組）大鼠肺組織SPA及SPC mRNA的表達(dá)顯著高于B組（P＜0.05），見圖2。

2.4 SPA及SPC蛋白表達(dá) Western blot測(cè)定大鼠肺組織的SPA和SPC蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明，SPA及SPC蛋白在B組大鼠肺組織中表達(dá)明顯低于A組（P＜0.05）；但是SRT2104治療后（C組），SPA及SPC蛋白表達(dá)顯著高于B組（P＜0.05），見圖3；其結(jié)果與SPA及SPC mRNA在大鼠肺組織中表達(dá)一致。

2.5 SA-β-gal活性變化 采用染色法測(cè)定大鼠肺組織的SA-β-gal活性，大鼠肺組織中被染色成藍(lán)色的細(xì)胞即為SA-β-gal陽(yáng)性的細(xì)胞，即為衰老細(xì)胞，其大多數(shù)位于肺泡角部。結(jié)果顯示，與A組比較，B組大鼠肺組織中的SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，但是SRT2104治療后（C組），大鼠肺組織SA-β-gal陽(yáng)性的細(xì)胞顯著減少，見圖4。

圖2 各組大鼠肺組織的SPA和SPC m R N A水平。注：與A組比較，★P＜0．05；與B組比較，# P＜0．05

圖3 各組大鼠肺組織SPA及SPC蛋白表達(dá)。注：與A組比較，★P＜0．05；與B組比較，#P＜0．05

圖4 各組大鼠肺組織的SA-β-gal活性變化（× 400）。

2.6 SIRT1去乙?；傅幕钚愿淖?比色法檢測(cè)大鼠肺組織SIRT1去乙?；富钚?，結(jié)果表明，與A組比較，B組大鼠肺組織SIRT1去乙酰化酶活性顯著降低（P＜0.05），而SRT2104治療后（C組），大鼠肺組織中的SIRT1去乙酰化酶活性明顯升高（P＜0.05）。

3 討論

到2020年，預(yù)計(jì)COPD將會(huì)是全球死亡原因的第三位因素，給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)［2］。COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病變可以累及肺實(shí)質(zhì)和肺血管等，并且進(jìn)行性發(fā)展［1］。本研究中，通過(guò)被動(dòng)吸煙及大鼠氣道內(nèi)脂多糖吸入建立肺氣腫模型，肺組織出現(xiàn)明顯的肺氣腫病理表現(xiàn)，包括肺泡出現(xiàn)囊狀擴(kuò)張，部分肺泡間隔出現(xiàn)斷裂，進(jìn)而肺泡融合。并且肺功能檢測(cè)也表明肺氣腫大鼠氣道阻力顯著增加，而肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性及呼氣峰值流速明顯降低，符合肺氣腫的變化。

作為AECI的祖細(xì)胞，AECII在分泌肺泡表明活性物質(zhì)、維持肺泡內(nèi)穩(wěn)態(tài)及氣體交換和提高肺組織修復(fù)能力方面具有重要的作用，并且SPA及SPC是由AECII特異性地分泌。與上述研究相同的是，在本研究中，肺氣腫大鼠肺組織中的SPA及SPC mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明其肺組織中AECII存在受損。但是，SRT2104治療后，大鼠肺功能中的氣道阻力、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性及呼氣峰值流速得到改善，并且肺組織肺氣腫表現(xiàn)好轉(zhuǎn)。但是，通過(guò)SRT2104治療來(lái)改善肺氣腫大鼠肺功能的相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。作為SIRT1的選擇性激動(dòng)劑，SRT2104具有重要的病理生理學(xué)功能；如減輕心肌纖維化、改善動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、緩解骨質(zhì)疏松。相關(guān)研究證實(shí)，細(xì)胞衰老在COPD患者中會(huì)加速，并且促進(jìn)COPD進(jìn)展［7］。肺氣腫患者肺泡細(xì)胞衰老的水平與其氣流受限的程度呈正相關(guān)。因此，作者假設(shè)肺氣腫大鼠的肺泡上皮細(xì)胞異常表達(dá)可能與其過(guò)早衰老相關(guān)。SIRT1是長(zhǎng)壽基因，具有顯著的逆轉(zhuǎn)衰老的能力，并且具有較高的安全性和抗炎活性［8］。SA-β-gal是細(xì)胞衰老重要生物標(biāo)記物。

本研究中，C組肺氣腫大鼠經(jīng)SRT2104治療后，肺組織中的SPA及SPC mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，考慮其相關(guān)機(jī)制可能是SRT2104通過(guò)改善或者修復(fù)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的數(shù)量或者功能來(lái)改善肺氣腫大鼠的肺損傷。作者進(jìn)一步采用染色法和比色法來(lái)測(cè)定大鼠肺組織中SA-β-gal活性變化及SIRT1去乙?；傅幕钚愿淖儯l(fā)現(xiàn)C組肺氣腫大鼠肺組織中SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，并且SIRT1去乙酰化酶活性明顯升高，結(jié)果表明SRT2104治療后大鼠肺組織中衰老的肺泡細(xì)胞明顯減少。綜上所述，SIRT1選擇性激動(dòng)劑SRT2104可能通過(guò)抑制Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞衰老或者促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的進(jìn)一步修復(fù)來(lái)改善肺氣腫大鼠的肺損傷。但是，SRT2014上述功能的信號(hào)調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。