蔣淳琪 張磊

結(jié)腸腺癌是由結(jié)腸黏膜上皮異型增生形成的腫瘤，臨床較為常見，主要發(fā)生于中老年人，與病變相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制較多，其涉及遺傳學(xué)和增殖基因調(diào)控的領(lǐng)域［1］。雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1B（dual specificity tyrosinephosphorylation regulated kinase 1B，Dyrk1B）是一種絲氨酸或酪氨酸蛋白激酶，位于19號(hào)染色體上，在腦組織或肌肉組織中表達(dá)，其它正常組織中表達(dá)較少［2］，近年研究顯示Dyrk1B在幼稚的細(xì)胞中表達(dá)升高，其可能與腫瘤的形成有關(guān)［3］。Dyrk1B在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)未見相關(guān)報(bào)告，對預(yù)后的判斷價(jià)值尚無研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化、Western Blot和熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測結(jié)腸腺癌中Dyrk1B的表達(dá)，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般材料 選擇2012年1月至2014年12月在寧波市中醫(yī)院確診為結(jié)腸腺癌，并行手術(shù)治療的患者作為研究對象。共觀察87例，其中男47例，女40例；年齡40～87歲，平均62.3歲，中位年齡59歲。均留取腫瘤組織的新鮮組織和石蠟包埋組織作為觀察組，留取距腫物邊緣＞3cm的正常結(jié)腸黏膜的新鮮組織和石蠟包埋組織作為對照組。新鮮組織應(yīng)用-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。本研究由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)家屬簽訂知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）由病理醫(yī)師復(fù)診切片，并按WHO的標(biāo)準(zhǔn)分型者。（2）原發(fā)腫瘤者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）手術(shù)前接受放、化療者。（2）林奇綜合征者；（3）消化系統(tǒng)發(fā)育畸形者；（4）伴有其它器官惡性腫瘤者。

1.2 Dyrk1B表達(dá)的檢測及結(jié)果判定 （1）免疫組化法：術(shù)后標(biāo)本常規(guī)取材，應(yīng)用福爾馬林固定，脫水機(jī)脫水，并行石蠟包埋，切4μm切片后置于膠片上，應(yīng)用免疫組化二步法檢測Dyrk1B的表達(dá)。Dyrk1B濃縮液購自ABGENT公司，二抗和DAB購自福州邁新公司。先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇1：200顯色最理想的濃度用于正式實(shí)驗(yàn)。操作由同一檢驗(yàn)師操作完成，做好質(zhì)控工作，減少人為誤差。Dyrk1B的顯色部位是細(xì)胞漿，以棕黃色為陽性細(xì)胞。由兩位病理醫(yī)師應(yīng)用盲法進(jìn)行判讀，選擇上皮細(xì)胞分布集中的熱點(diǎn)區(qū)進(jìn)行觀察，共選擇5個(gè)400倍視野，以陽性率＜10%為陰性，以＞10%為陽性計(jì)算陽性率。（2）Western Blot法檢測：取新鮮凍存標(biāo)本，適當(dāng)?shù)牧呀庖禾幚斫M織樣品，測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。冷卻至室溫后，將蛋白樣品直接上樣至SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)。轉(zhuǎn)膜完畢后，立即將蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1～2min，以洗掉膜上的轉(zhuǎn)膜液。吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60min。對于一些背景較高的抗體，4℃封閉過夜。吸盡封閉液，加入稀釋好的一抗，室溫?fù)u床上孵育1h或者4℃孵育過夜。吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或者4℃搖床上孵育1h。ECL化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶和內(nèi)參條帶的凈光密度值以及他們的比值。應(yīng)用新鮮凍存組織。內(nèi)參應(yīng)用GAPDH。取新鮮組織，提取總蛋白，測定試劑盒定量，丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，牛奶封閉后稀釋好抗體，4℃置于冰箱中過夜，取出后進(jìn)行洗滌，加入二抗，孵育2h，化學(xué)發(fā)光劑顯影，并拍照，用凝膠分析軟件對圖像進(jìn)行分析?；叶确治鰬?yīng)用Image J V1.47H軟件，以蛋白與GAPDH的比值進(jìn)行分析其相對表達(dá)量。（3）熒光PCR法檢測：檢測新鮮標(biāo)本中Dyrk1B的mRNA的表達(dá)。記錄Ct值，通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因和相對表達(dá)水平。ΔΔCt=［Ct目的基因（未知樣品）-CtGAPDH（未知樣品）］-［Ct目的基因（校正樣品）-CtGAPDH（校正樣品）］。操作嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟完成，均由同一實(shí)驗(yàn)師完成，做好質(zhì)控工作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS6.12分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 （1）兩組中Dyrk1B陽性率的比較：觀察組中Dyrk1B的陽性率均明顯高于對照組（見表1）。（2）觀察組不同特征分組中Dyrk1B陽性率比較：觀察組中Dyrk1B的表達(dá)與腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、增殖指數(shù)、脈管累犯、神經(jīng)累犯和TNM分期密切相關(guān)，Dyrk1B的表達(dá)與性別、年齡、部位、分化程度和炎細(xì)胞浸潤程度無明顯相關(guān)性（見表2）。（3）觀察組中Dyrk1B表達(dá)的生存分析：術(shù)后隨訪患者時(shí)間為6～60個(gè)月，應(yīng)用生存分析顯示觀察組中Dyrk1B與生存時(shí)間有關(guān)，即Dyrk1B高表達(dá)患者的生存時(shí)間短，預(yù)后差（見圖1）。

表1 兩組中Dyrk1B陽性率的比較［n（%）］

表2 觀察組不同特征分組中Dyrk1B陽性率比較［n（%）］

圖1 結(jié)腸腺癌中Dyrk1B與生存時(shí)間的關(guān)系

2.2 兩組中Western Blot法檢測Dyrk1B蛋白半定量表達(dá)的比較 觀察組中Dyrk1B的半定量表達(dá)量為（0.98±0.20），對照組中Dyrk1B的半定量表達(dá)量為（0.68±0.21），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010）。（見圖2）。

2.3 兩組熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測Dyrk1B mRNA的比較 觀察組中Dyrk1B mRNA表達(dá)的陽性率為（1.12±0.24）%，對照組中Dyrk1B mRNA表達(dá)的陽性率為（0.80±0.26）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）。

圖2 Western Blot法檢測觀察組和對照組中Dyrk1B的表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌的形成與細(xì)胞的異型增殖有關(guān)，Dyrk1B又稱為Mirk，其基因位于19號(hào)染色體q12-13.11上，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，其具有三種剪接變形體，即P65、P69和P75。由于P65在體外缺乏激酶活性并不含有酪氨酸磷酸化功能，因此其激酶的不同功能與剪接差異有關(guān)［4］。有研究將Dyrk1B基因敲除后發(fā)現(xiàn)可以改變調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖分化的相關(guān)蛋白，如PRAP、bcl-2等，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和分化［5］。Dyrk1B敲除后不引起胚胎致死，有觀點(diǎn)認(rèn)為Dyrk1B與正常細(xì)胞的形成無必然聯(lián)系，Dyrk1B可能是腫瘤治療的靶點(diǎn)［6］。缺氧和低pH值等因素能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)Dyrk1B，使細(xì)胞進(jìn)入暫時(shí)性休眠狀態(tài)的G0期，并在E2F4復(fù)合物的作用下穩(wěn)定停留在 G0期，該階段可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞完成ROS損傷的修復(fù)過程，并減少毒性ROS自由基的產(chǎn)生［7］。血清“饑餓”誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)入G0期，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Dyrk1B敲除后逃離G0期的腫瘤細(xì)胞迅速增加［8］。Dyrk1B通過磷酸化阻止細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制子P27的降解使細(xì)胞處于G0期。Dyrk1B無論擴(kuò)增與否，均可通過磷酸化降低cyclinD1與cyclinD3的穩(wěn)定性，使細(xì)胞處于高度活躍狀態(tài)。Dyrk1B對組織發(fā)育和染色質(zhì)重塑的作用更明顯，Dyrk1B的作用方式可能更多［9］。Dyrk1B可能下調(diào)Spry2和ERK MAPK途徑發(fā)揮促進(jìn)腫瘤增殖、遷移的作用［10］。ERK下調(diào)后可以激活MMPs的調(diào)節(jié)，能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加速腫瘤細(xì)胞的遷移。Dyrk1B在腫瘤遷移過程中可能對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有一定的促進(jìn)作用［11］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)直腸腺癌中Dyrk1B的表達(dá)明顯高于對照組，提示Dyrk1B是腫瘤形成的促進(jìn)蛋白，其作用與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，Dyrk1B通過P27調(diào)控CyclinD1的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞G0靜止期通過檢測控制進(jìn)入S期。Dyrk1B的腫瘤細(xì)胞特異性，可作為腫瘤細(xì)胞治療靶點(diǎn)開發(fā)抗癌藥物，同時(shí)，其下游調(diào)控的細(xì)胞周期蛋白Cdk4抑制劑已成為抗癌藥物，二者協(xié)同作用可增強(qiáng)腫瘤治療特性。觀察組中Dyrk1B的表達(dá)與腫瘤最大徑和增殖指數(shù)相關(guān)，提示Dyrk1B高表達(dá)是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞失控性增殖的重要蛋白因素，Dyrk1B對細(xì)胞的增殖作用使細(xì)胞的增生活躍，細(xì)胞的數(shù)量增多，異型細(xì)胞增加，腫瘤體積增大，細(xì)胞侵襲生長的能力增強(qiáng)。結(jié)果顯示Dyrk1B的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管累犯和神經(jīng)累犯相關(guān)，提示Dyrk1B直接參與腫瘤的進(jìn)展及腫瘤細(xì)胞的播散。Dyrk1B高表達(dá)引起細(xì)胞的遷移作用也提示可能是轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的作用。Dyrk1B可以引起細(xì)胞增生，增生的細(xì)胞幼稚，體積小，遷移能力強(qiáng)，是轉(zhuǎn)移的重要腫瘤細(xì)胞，且細(xì)胞遷移后，幼稚的細(xì)胞適應(yīng)異源性組織的能力強(qiáng)，定植程度高，腫瘤細(xì)胞在非原發(fā)灶的部位生長繁殖。結(jié)果顯示Dyrk1B的表達(dá)與TNM分期相關(guān)，提示可能是判斷腫瘤分期的輔助指標(biāo)。本研究未發(fā)現(xiàn)Dyrk1B的表達(dá)與分化程度和炎細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性，提示Dyrk1B與幼稚細(xì)胞的異型增生和炎性周圍環(huán)境無明顯關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示Dyrk1B的表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)，提示Dyrk1B對判斷預(yù)后可能有一定幫助，因此臨床可以檢測Dyrk1B的表達(dá)輔助判斷預(yù)后，即高表達(dá)患者的預(yù)后較差，但其臨界值尚需要多中心、大樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步敲定。本實(shí)驗(yàn)免疫組化的結(jié)果經(jīng)Western Blot的半定檢測得到驗(yàn)證，同時(shí)顯示出Dyrk1B蛋白與mRNA表達(dá)具有一致性。Dyrk1B具有癌基因樣的作用，引起腫瘤異型增生明顯，細(xì)胞分裂速度增加。Dyrk1B參與腫瘤的形成是其經(jīng)典作用，Dyrk1B參與腫瘤進(jìn)展可能是通過對相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。Dyrk1B表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平。也有學(xué)者認(rèn)為Dyrk1B可以引起上皮粘附素的低表達(dá)，使惡性腫瘤細(xì)胞間的連接松動(dòng)，同時(shí)引起神經(jīng)型粘附素的高表達(dá)，引起轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞的異質(zhì)型粘附作用增加，腫瘤定植能力提高，形成轉(zhuǎn)移灶［12］。腫瘤形成中具有一定的間質(zhì)反應(yīng)，主要表現(xiàn)為纖維化和炎細(xì)胞浸潤，這與Dyrk1B的表達(dá)升高直接相關(guān)，是腫瘤直接侵襲或種植的結(jié)果，常伴隨著明顯的炎癥反應(yīng)，此種作用是持續(xù)性的。使Dyrk1B下調(diào)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用，其作用可能是通過下調(diào)CyclinD1、P21實(shí)現(xiàn)的。

總之，Dyrk1B蛋白和mRNA在結(jié)腸腺癌組織中表達(dá)升高，是腫瘤形成和進(jìn)展中重要的促進(jìn)因素，檢測術(shù)后組織中Dyrk1B的表達(dá)對判斷預(yù)后有一定價(jià)值。