羅昌國(guó)，王三紅，袁啟鳳，鄭 偉，宋 莎

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)科學(xué)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

1997年在擬南芥(Arabidopsisthaliana)上發(fā)現(xiàn)3個(gè)抗白粉病﹝Erysiphespp.(Golovinomycesspp.)﹞的位點(diǎn)RPW(RESISTANCE TO POWDERY MILDEW)6/7/8，其中RPW8.1(GenBank ID：AF273059)和RPW8.2(AF273059)基因是擬南芥Ms-0生態(tài)型2個(gè)緊密連鎖的白粉病抗性基因，于2001被成功克隆，并具有抗白粉病的功能。RPW8在不同生態(tài)型的擬南芥中存在被同源基因取代的現(xiàn)象，即便基因不被取代也可能在功能方面存在一定差異。在來(lái)自全球各地的不同生態(tài)型的擬南芥中，RPW8.1和RPW8.2基因主要存在于抗白粉病擬南芥Ms-0、Kas-1、Wa-1、Ei-5、Nw-0等5個(gè)生態(tài)型中；在感病擬南芥Col-0、Fr-3、Is-1、Nie-0、Sg-2等生態(tài)型中則缺乏RPW8.1和RPW8.2基因，取而代之的是HR4；而B(niǎo)u-06、Is-0、K1-0生態(tài)型中具備RPW8.1和RPW8.2基因，但卻表現(xiàn)出感病的性狀。在擬南芥中，RPW8的同源基因還有HR1(Tair ID：At3g50450)、HR2(At3g50460)和HR3(At3g50470)。RPW8基因在不同種類(lèi)植物中，甚至同種不同生態(tài)型中，其基因序列和功能都存在差異。筆者等主要對(duì)具有抗性功能的RPW8或其同源基因的研究成果進(jìn)行綜述，并對(duì)RPW8基因在種群關(guān)系、抗病育種上的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行展望，以期為白粉病抗性調(diào)控、抗性育種等方面的研究提供參考。

1 RPW8基因的生理生化特征

1.1 RPW8基因的結(jié)構(gòu)與序列特征

在擬南芥(Col-0生態(tài)型)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中(https：//www.arabidopsis.org)，HR4位于第3條染色體上。RPW8基因在親緣關(guān)系較近的不同生態(tài)型或近緣種中，基因位點(diǎn)相對(duì)固定，但可能由于重復(fù)片段插入、缺失、交換等事件發(fā)生，使得PRW8被同源基因取代或丟失，并在序列和功能方面存在較大差異。從圖1看出，Ms-0生態(tài)型擬南芥RPW8.1和RPW8.2基因位于HR3和SPK-2(SNF1-RELATED PROTEIN KINASE)之間，Col-0生態(tài)型的HR4也位于HR3和SPK-2之間。琴葉擬南芥(Arabidopsislyrata)則只有RPW8.2基因，位置在HR3和SPK-2之間。

注：At為擬南芥；Al為琴葉擬南芥。
Note: At，A.thaliana; Al，A.lyrata.
圖1擬南芥及其近緣種中RPW8基因的位點(diǎn)
Fig.1RPW8 locus ofA.thalianaandA.lyrata

RPW8基因在不同植物中的數(shù)量、基因長(zhǎng)度、基因結(jié)構(gòu)等方面存在較大差異(圖2)。在43個(gè)不同的生態(tài)型擬南芥的基因序列比對(duì)中，RPW8.1基因長(zhǎng)度為718個(gè)核苷酸，包含長(zhǎng)度分別為281 bp和229 bp的2個(gè)外顯子和1個(gè)208 bp內(nèi)含子，編碼148個(gè)氨基酸；RPW8.2基因長(zhǎng)度為653個(gè)核苷酸，包含長(zhǎng)度分別為296 bp和229 bp的2個(gè)外顯子和1個(gè)183 bp內(nèi)含子；編碼174個(gè)氨基酸。擬南芥RPW8.1(核苷酸多樣性π=0.012)和RPW8.2(π=0.010)系列比同源基因HR3(π=0.002)和HR4(π=0.002)的變化大。琴葉擬南芥和擬南芥上RPW8.2同源基因的核苷酸和蛋白序列相似度只有81%和61%。油菜(Brassicanapus)的4個(gè)BnHRs也只有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，外顯子和內(nèi)含子核苷酸多樣性在0.001～0.015。華東葡萄(Vitispseudoreticulata)中克隆到的5個(gè)RPW8基因(GenBank ID：KU365990、KU365991、KU365992、KX389173和KX389175)，編碼的蛋白長(zhǎng)度在647～825個(gè)氨基酸，相似度為78%，每個(gè)基因包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。

注：At為擬南芥；Bn為油菜；Vp為華東葡萄。
Note:At,A.thaliana；Bn,B.napus；VP,V.pseudoreticulata.
圖2RPW8基因的結(jié)構(gòu)
Fig.2 Structure ofRPW8 genes

1.2 RPW8氨基酸序列的重要位點(diǎn)

位于RPW8.2蛋白第64位、第116位和第161位的蘇氨酸(Thr-64)、天冬氨酸(Asp-116)和蘇氨酸(Thr-161)對(duì)白粉病的抗性至關(guān)重要，尤其位于卷曲結(jié)構(gòu)域的Thr-64是蛋白磷酸化的關(guān)鍵位點(diǎn)，在過(guò)敏性抗病反應(yīng)中起決定性作用。N端1～22位氨基酸為跨膜結(jié)構(gòu)域TMD(Trans-membrane domain)，TMD的5～14位序列(VAAGGALGLA)在蛋白穩(wěn)定和錨定白粉菌吸器外膜EHM(Extrahaustorial membrane)中起比較關(guān)鍵的作用。C端的111位亮氨酸也是錨定EHM的關(guān)健位點(diǎn)，缺少此位點(diǎn)及之后的序列也對(duì)蛋白錨定有影響。RPW8.2N端30個(gè)氨基酸對(duì)其與14-3-3λ(G-BOX FACTOR 14 LAMBDA或稱(chēng)14-3-3 lambda)蛋白互作沒(méi)有影響，而C端的38個(gè)氨基酸則影響很大。通過(guò)酵母雙雜試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RPW8.2蛋白能與14-3-3 λ(At5g10450)蛋白互作，RPW8.1蛋白與14-3-3λ互作的能力很弱。

1.3 RPW8基因與R基因的關(guān)系

多數(shù)R抗病基因(Resistance Genes)編碼的蛋白通常具有1個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(Nucleotide-binding site ，NBS)和1個(gè)羧基端的亮氨酸重復(fù)系列(Leucine-rich repeats，LRRs)，因此亦將此類(lèi)基因稱(chēng)為NBS-LRR基因(文中用該名稱(chēng))或NBS基因。根據(jù)此特征可將NBS-LRR類(lèi)R蛋白分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是氨基含有1個(gè)TIR(Toll/interleukin receptor)域的TIR-NBS-LRR蛋白，或又稱(chēng)TIR-NBS-LRR，簡(jiǎn)寫(xiě)為T(mén)NLs蛋白；另一類(lèi)是無(wú)TIR結(jié)構(gòu)域的none TIR-NBS-LRR蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)nTNLs蛋白。在nTNLs中，又將氨基端含有卷曲螺旋結(jié)合位點(diǎn)(Coiled-coiled motif)的蛋白歸類(lèi)為CC-NBS-LRR蛋白，簡(jiǎn)寫(xiě)為CNLs蛋白[9-10]。亦有學(xué)者將此類(lèi)R基因編碼的蛋白稱(chēng)為NB-LRR蛋白(Nucleotide binding-leucine rich repeat)[11-13]。 NBS結(jié)構(gòu)域通常包括P-loop(GxGKT)、Kinase2(LxxLDDV)、Kinase3或稱(chēng)RNBS-B (GxxxxxT(T/S)R)、GLPL(GLPL)等保守結(jié)構(gòu)，LRR結(jié)構(gòu)域序列通常為xxLxLxx結(jié)構(gòu)[14]。RPW8屬于nTNLs，N端含1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域TMD(N-terminal transmembrane domain)和1～2個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(Coiled-coil)，還具有R基因常有NBS和LRR結(jié)構(gòu)域[15-17]，因此，有學(xué)者將RPW8歸為一類(lèi)特殊類(lèi)型R基因，即RPW8-NBS-LRR，簡(jiǎn)寫(xiě)為RNL，或者將其歸在X-NBS-LRR類(lèi)型中[17-20]。

1.4 RPW8基因的起源與進(jìn)化

在藻類(lèi)植物中，灰色藻門(mén)(Glaucophyta) 和紅藻門(mén)(Rhodophyta)還沒(méi)有出現(xiàn)TNLs和CNLs基因，綠藻門(mén)(Chlorophyta)和輪藻門(mén)(Charophyta)才開(kāi)始有NBS-LRR基因的出現(xiàn)；苔蘚植物如地錢(qián)(Marchantiapolymorpha) 、泥炭蘚(Sphagnumfallax)和開(kāi)花植物中，NBS-LRR基因較豐富，但是單子植物中沒(méi)有TNLs類(lèi)型基因[21]。RPW8雖屬于NBS-LRR基因，但在藻類(lèi)植物中沒(méi)有出現(xiàn)，直到苔蘚植物(Bryophyta)才出現(xiàn)。其他的開(kāi)花植物則存在數(shù)量不等的RPW8基因[22]。在草莓、蘋(píng)果、梨、桃和梅基因組中，預(yù)測(cè)的RPW8基因分別有24個(gè)、20個(gè)、22個(gè)、11個(gè)和13個(gè)[23]。截型苜蓿(Medicagotruncatula)、木豆(Cajanuscajan)、菜豆(Phaseolusvulgaris)和大豆(Glycinemax)中，RPW8基因分別有8個(gè)、4個(gè)、5個(gè)和9個(gè)。RPW8與ADR1(activated disease resistance gene)和NRG1(N-required gene 1)有較高的同源性，在基因的進(jìn)化和形成過(guò)程中可能存在比較緊密的關(guān)系。RPW8基因可能從ADR1或NRG1進(jìn)化而來(lái)，蕨類(lèi)植物(Pteridophyta)，如石松門(mén)(Lycopodiophyta)以及單子葉植物中在進(jìn)化過(guò)程中只保留ADR1和NRG1類(lèi)似基因或數(shù)量極少的RPW8同源基因[24-25]。

2 RPW8基因的抗病功能

2.1 基因表達(dá)特點(diǎn)

培養(yǎng)基接種木霉菌(Trichodermaatroviride)試驗(yàn)中，Col-0生態(tài)型擬南芥的HR4在接種后96 h，表達(dá)比對(duì)照提高4倍； Ms-0生態(tài)型擬南芥的RPW8.1在接種后96 h，表達(dá)比對(duì)照提高155倍，RPW8.2則不明顯[26]。通過(guò)PRW8.1-YFP(yellow fluorescent protein)和PRW8.2-YFP融合基因在洋蔥表皮細(xì)胞和擬南芥葉片表皮細(xì)胞表達(dá)后，兩者的亞細(xì)胞定位主要在膜系統(tǒng)上，包括細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。亞細(xì)胞定位過(guò)程中觀察到RPW8在細(xì)胞中有流動(dòng)現(xiàn)象，這一現(xiàn)象在進(jìn)一步研究后被證實(shí)是RPW8蛋白利用胞內(nèi)小泡運(yùn)輸(Vesicle trafficking)并通過(guò)微絲細(xì)胞骨架(Actin cytoskeleton)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物中穩(wěn)定表達(dá)PRW8.1-YFP和PRW8.2-YFP發(fā)現(xiàn)，PRW8.1主要在葉肉細(xì)胞中表達(dá)，很少在表皮細(xì)胞中表達(dá)，PRW8.2則在葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞中均有表達(dá)[27]。

2.2 抗病作用

目前，RPW8抗病方面的研究以白粉病居多。將Ms-0的RPW8.1和RPW8.2基因中任何1個(gè)或2個(gè)同時(shí)轉(zhuǎn)化到Col-0中，轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出提高白粉病抗性。異位表達(dá)(Ectopic expression)擬南芥RPW8.1基因，使得PTI﹝PAMP(Pathogen-associated molecular pattern )-triggered immunity﹞通路誘導(dǎo)的抗性相關(guān)的基因PRRs(Pattern recognition receptors)、FLS2(Flagellin Sensing2)、CERK1(Chitin elicitor receptor kinase1 )、BAK1(BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE1)、BIK1(BOTRYTIS-INDUCED KINASE1)、PBL1﹝AvrPphB susceptible1 (PBS1)-like﹞、MPK3、MPK6和PBL2上調(diào)表達(dá)，以及PR1(Pathogenesis-related)、PR2和WRKY29上調(diào)表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)H2O2產(chǎn)生，出現(xiàn)HR(Hypersensitive response)過(guò)敏性反應(yīng)類(lèi)似的細(xì)胞壞死癥狀。轉(zhuǎn)PRW8基因的煙草可提高白粉病的抗性，其對(duì)抗性調(diào)控依賴(lài)于SA(Salic acid)通路和EDS1(ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1)通路，并伴隨著類(lèi)似的HR反應(yīng)；但同樣轉(zhuǎn)PRW8基因在蕃茄(Lycopersicon esculentum)上未表現(xiàn)出抗白粉病(Oidiumlycopersici)[28]。過(guò)量表達(dá)HR1、HR2和HR3基因也有提高白粉病抗性的作用，HR4則更易感白粉??；HR1、HR2和HR3敲除后，HR2和HR3敲除株系更易感白粉病[29]。感白粉病生態(tài)型和抗白粉病生態(tài)型的抗病雜交后代只對(duì)白粉菌分生孢子有抑制作用，而在病原菌其他的生活周期抗性不明顯[30]。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，不同白粉病抗性的擬南芥植株也會(huì)發(fā)生一定變化[31]。RPW8對(duì)白粉病的抗性可能同時(shí)受到基因本身、遺傳背景和環(huán)境的影響。RPW8除了具有抗白粉病的功能外，可能還具有其他抗性作用，水稻中異源表達(dá)擬南芥RPW8.1基因表現(xiàn)出抗稻瘟病(Pyriculariaoryzae)和白葉枯病(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)[32]。華東葡萄(Vitispseudoreticulata)VpRPW8基因受霜霉病誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)VpRPW8基因煙草(Nicotianabenthamiana)表現(xiàn)出抗疫霉病(Phytophthoracapsici)。轉(zhuǎn)PRW8基因擬南芥對(duì)霜霉病(Hyaloperonosporaparasitica)和花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus)的抗性有提高作用；對(duì)假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.maculicolaES4326)的抗性沒(méi)有影響，而更感鏈格孢菌(Alternariaspp.)和 灰霉菌(Botrytisspp.)[27]。

2.3 RPW8調(diào)控機(jī)制

SA、EDS1和NPR1都是植物抗病過(guò)程中的重要信號(hào)通路[33-37]。RPW8.1和RPW8.2對(duì)白粉病的抗性常需要SA和EDS1、PAD4、EDS5、NPR1的參與，并伴隨HR出現(xiàn)[15]。1998年篩選到edr1(Enhanced disease resistance 1)抗白粉病突變體，其沒(méi)有提高PR1和PR5的表達(dá)[38]。EDR1通過(guò)抑制RPW8.1和RPW8.2的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制HR細(xì)胞死亡和白粉病抗性[15]。EDR1負(fù)調(diào)控RPW8的抗性亦需要EDS1和SA的參與[15]，EDR1也聯(lián)系SA與ET(ethylene)[39]、ABA(abscisic acid)[40]信號(hào)通路之間的橋梁。EDR2突變體能增強(qiáng)白粉病的抗性，突變體中RPN1a蛋白起關(guān)鍵作用，RPN1a是蛋白降解系統(tǒng)中26S蛋白的一個(gè)亞基，也是edr1和pmr4白粉病性抗性調(diào)控所必需的，RPN1a基因突變使植株更易感白粉病[41]。XCT(X-CHROMOSOME ASSOCIATED PROTEIN5(XAP5) CIRCADIAN TIMEKEEPER)基因(At2g21150)正調(diào)控RPW8.1的抗性[42]，而XCT是ET信號(hào)通路中重要的調(diào)控因子[43]。14-3-3λ(GF14 lambda)正調(diào)控RPW8的抗性，14-3-3λ是真核生物普遍存在的調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)識(shí)別特異的磷酸化序列與靶蛋白互作，也是蛋白間相互作用的重要橋梁蛋白。14-3-3λ蛋白能夠與APX3 (Ascorbate peroxidase) 和AKR2互作，并可能參與植物氧化代謝過(guò)程。14-3-3λ還與BZR1轉(zhuǎn)錄因子互作，參與油菜素內(nèi)脂信號(hào)通路BRs(Brassinosteroid signaling)。在酵母和植物體還能觀察到RPW8.2蛋白能與PAPP2C(Phytochrome-associated protein phosphatase type 2C，At1g22280)互作，RNAi干涉PAPP2C后，出現(xiàn)RPW8過(guò)表達(dá)的表現(xiàn)，即葉片出現(xiàn)敏性細(xì)胞死亡并提高白粉病抗性[44]。PP2C是通過(guò)調(diào)控CDK(Cyclin-dependent protein kinases)去磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，PP2C還可通過(guò)去磷酸化作用調(diào)控MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信號(hào)通路，進(jìn)而可能關(guān)聯(lián)病菌入侵寄主時(shí)細(xì)胞壁完整性過(guò)程[45-46]。與PRW8介導(dǎo)密切相關(guān)的基因ERH(Enhancing RPW8-mediated HR-like cell death)突變體erh表現(xiàn)為SA的積累和RPW8表達(dá)量的上升，ERH與酵母IPCS(Inositolphosphorylceramide synthase)同源，并編碼植物IPCS。IPCS是調(diào)控細(xì)胞PCD(Programmed cell death)的重要基因，在植物防疫反應(yīng)中扮演著重要角色[47]。

白粉菌在入侵過(guò)程中形成吸器體(Haustorium)、吸器外質(zhì)膜(Extrahaustorial membrane，EHM)和吸器外間質(zhì)(Extrahaustorial matrix，EHMx)[48]，將白粉菌吸器從葉片組織中分離出來(lái)，可觀測(cè)到PRW8.2蛋白匯集到吸器外質(zhì)膜上[49]，PRW8同源蛋白也有類(lèi)似現(xiàn)象[29]。RPW8.2被白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)后還激發(fā)過(guò)氧化氫在吸器復(fù)合體(Encasement of Haustorial Complex，EHC)內(nèi)高濃度富集，同時(shí)激發(fā)富含胼胝質(zhì)(Callose)的吸器復(fù)合體形成，并將高濃度的過(guò)氧化氫限制在吸器復(fù)合體內(nèi)，從而達(dá)到抗病的效果而不傷害寄主細(xì)胞；在植株抗白粉病過(guò)程中，胼胝質(zhì)沉積現(xiàn)象在其他抗病基因型中也起到十分關(guān)鍵的作用[50-51]。胼胝質(zhì)沉積往往也需要SA的誘導(dǎo)和參與[52]。當(dāng)EHC不足以阻止白粉菌的入侵時(shí)，RPW8.2表達(dá)量便不斷增加直至受侵染細(xì)胞死亡，從而消滅入侵的白粉菌[53]。RPW8.2-YFP不但可以錨定在白粉菌吸器外質(zhì)膜上，也可以錨定霜霉菌吸器表面。但是，失去抗性功能的RPW8突變體即便可以錨定到吸器外質(zhì)膜上，或者失去錨定功能的RPW8突變體均不能產(chǎn)生抗病性[54]。

RPW8的上調(diào)表達(dá)常伴隨著活性氧產(chǎn)生，過(guò)量的活性氧產(chǎn)生不僅對(duì)病原菌具有殺傷作用，同時(shí)也對(duì)寄主本身形成傷害，除EHC對(duì)寄主細(xì)胞保護(hù)外，黃嘌呤脫氫酶XDH1(XANTHINE DEHYDROGENASE1)對(duì)寄主保護(hù)也有重要作用。XDH1通過(guò)調(diào)控ROS過(guò)程，影響RPW8介導(dǎo)的白粉病抗性，黃嘌呤脫氫酶是植物幾種鉬酶之一，XDH即可在嘌呤代謝過(guò)程中催化黃嘌呤(xanthine)和次黃嘌呤(of xanthine)生成尿酸，還可轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶還原酶(Xanthine oxidoreductase，XOR)促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。在白粉病侵染過(guò)程中，一方面XDH促進(jìn)ROS破壞吸器的形成，另一方面作為看家酶類(lèi)存在，代謝產(chǎn)生尿酸來(lái)保護(hù)寄主細(xì)胞免受活性氧的傷害。XDH1基因啟動(dòng)子包括3個(gè)WRKY結(jié)合元件W-box(TTGACC/T)，預(yù)示其可能受WRKY的調(diào)控[55-56]。

3 展望

白粉病是最為常見(jiàn)的一種植物病害，白粉菌種類(lèi)有600余種，每個(gè)種又存在或多或少的生理小種，其為害的植物寄主近萬(wàn)種。在進(jìn)化過(guò)程中，很多白粉菌(或生理小種)與相應(yīng)的植物種類(lèi)(或生態(tài)型)形成專(zhuān)一性的寄生關(guān)系，RPW8在這一進(jìn)化過(guò)程中也發(fā)生了復(fù)雜遺傳變異的事件，這些事件是否與白粉病直接相關(guān)還有待深入研究。白粉病抗性調(diào)控基因除RPW8外，目前已報(bào)道在植物白粉病抗性調(diào)控中起重要作用的還有WRKY、PMR(powdery mildew resistant)、MLO(mildew locus O)和MLA(mildew locus A)等基因。RPW8在不同植物或生態(tài)型中的基因數(shù)量、結(jié)構(gòu)、功能等方面有著豐富的變化，為白粉病抗性研究帶來(lái)了一定的難度，同時(shí)也帶來(lái)了機(jī)遇：當(dāng)RPW8發(fā)揮抗病作用并占主導(dǎo)地位時(shí)，如何通過(guò)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與其他抗病基因協(xié)同調(diào)控；當(dāng)RPW8失去抗病功能時(shí)，其在生命體中又扮演怎樣的角色，其他抗病基因如何彌補(bǔ)RPW8的抗病功能，使植株產(chǎn)生抗病性，這些都值得去探索。RPW8基因在同一類(lèi)群內(nèi)豐富的核苷酸多樣性和不同類(lèi)群間高頻次的基因片段的插入、交換、缺失等事件的發(fā)生，使其成為種群關(guān)系甚至不同植物種類(lèi)進(jìn)化關(guān)系的研究提供了一個(gè)較好的切入點(diǎn)。隨著對(duì)RPW8基因研究的不斷深入，預(yù)期其可為不同種類(lèi)植物白粉病的抗性機(jī)制、白粉病抗性育種等方面的研究和應(yīng)用提供重要的參考價(jià)值。