張邦躍　李彩虹　劉旋　廖曉珊　榮朵艷

張邦躍（1985-），博士，主要從事植物分子育種研究工作。先后主持或作為主要成員參與湖南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目“高產(chǎn)類黃酮紅花檵木種質(zhì)資源的篩選研究”和“百合抗尖孢鐮刀菌的分子機(jī)理研究及抗病品種的推廣應(yīng)用”、湖南省教育廳項(xiàng)目“紅花檵木類黃酮生物合成途徑調(diào)節(jié)因子MYB的分子克隆及功能鑒定”、株洲市科技計(jì)劃項(xiàng)目“紅花檵木葉色控制關(guān)鍵基因篩選及轉(zhuǎn)基因研究”等科研項(xiàng)目8項(xiàng)。獲海南省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)1項(xiàng)、湖南省科技廳成果登記證書1項(xiàng)、國(guó)家發(fā)明專利1項(xiàng);參與培育百合新品種2個(gè);在《Plant Physiology》《Molecules and Cells》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》《西北植物學(xué)報(bào)》《西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》等國(guó)內(nèi)外期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文10余篇，其中第一作者或通訊作者7篇（SCI收錄期刊2篇）。

摘要：【目的】克隆紅花檵木二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因（LcDFR1和LcDFR2），并對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位，為揭示紅花檵木花青苷的分子合成機(jī)理提供理論依據(jù)。【方法】基于紅花檵木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以紅花檵木葉片cDNA為模板，RT-PCR克隆LcDFR1和LcDFR2基因開放閱讀框（ORF）序列，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行分析，并通過煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)方法觀察蛋白的亞細(xì)胞定位情況?！窘Y(jié)果】克隆獲得的紅花檵木LcDFR1和LcDFR2基因ORF序列分別為1014和993 bp，分別編碼337和330個(gè)氨基酸殘基。LcDFR1與LcDFR2的氨基酸序列相似性為77%，二者與其他物種DFRs氨基酸序列的相似性均較高，其中與葡萄、山核桃、擬南芥等雙子葉植物的DFRs氨基酸序列相似性為64%～84%，而與單子葉植物玉米和水稻的DFRs氨基酸序列相似性為58%～61%，表明不同物種DFRs氨基酸序列具有較高的保守性。在基于DFRs氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上，LcDFR1與牡丹和芍藥的DFRs聚為一類，而LcDFR2與煙草和番茄的DFRs聚為一類。結(jié)合前人研究結(jié)果推測(cè)LcDFR1和LcDFR2的氨基酸序列中均包含保守的NADP結(jié)合域和底物結(jié)合域。但三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果均未預(yù)測(cè)到二者的底物結(jié)合位點(diǎn)，也未預(yù)測(cè)到LcDFR2的NADP結(jié)合位點(diǎn)。LcDFR1和LcDFR2亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中行使催化功能?！窘Y(jié)論】LcDFR1和LcDFR2在紅花檵木細(xì)胞質(zhì)中催化花青苷物質(zhì)的生物合成，但二者在進(jìn)化過程中產(chǎn)生底物偏好性、催化能力等功能差異。

關(guān)鍵詞： 紅花檵木;二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）;基因克隆;生物信息學(xué)分析;亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)： S687? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）12-2865-10

Abstract：【Objective】Cloning and subcellular localization of two dihydroflavonol-4-reductase（DFR） genes LcDFR1 and LcDFR2 from Loropetalum chinense var. rubrum were conducted to provide theoretical basis for further study of molecular mechanism of anthocyanin biosynthesis in L. chinense. 【Method】The open reading frame（ORF） sequences of two LcDFR1 and LcDFR2 were cloned with the templates of cDNA from the leaves of L. chinense using RT-PCR method based on the previous transcriptome data. Their amino acid sequences were analyzed by bioinformatics methods. The subcellular localization of LcDFRs proteins were detected by transient expression in tobacco leaves. 【Result】LcDFR1 and LcDFR2 ORF sequences cloned from L. chinense were 1014 and 993 bp， encoding 337 and 330 amino acids residues respectively. The amino acid sequences similarity between LcDFR1 and LcDFR2 was 77%. The identities of two LcDFRs amino acid sequences with DFRs? amino acid sequence of other species were high. The similarity of two LcDFRs amino acid sequences with dicotyledon such as Vitis vinifera（NP_001268144.1）， Paeonia lactiflora（QIC54081.1） and P. suffruticosa（AMW36065.1） was ranging from 64% to 84%， while their similarities with monocotyledon such as Zea mays （NP_001152467.2） and Oryza sativa （CAA69253.1） were from 58% to 61%， indicating that DFRs amino acid sequences from different species were highly conserved. Phylogenetic tree constructed based on DFRs amino acid sequence similarity showed that LcDFR1 was clustered into the same group with DFRs of P. lactiflora and P. suffruticosa， while LcDFR2 was clustered into the same group with DFRs of Nicotiana tabacum and Solanum lycopersicum. The amino acid sequence of both LcDFR1 and LcDFR2 contained conserved NADP binding motif and substrate binding domain， while their tertiary structure prediction results showed no available substrate binding site in both LcDFR and NADP binding site in LcDFR2. The subcellular localization studies have revealed that LcDFR1 and LcDFR2 were mainly cytoplasmic proteins， indicating that LcDFRs catalyzed substrates in cytoplasm. 【Conclusion】Both LcDFR1 and LcDFR2 may be involved in anthocyanin biosynthesis in cytoplasm of L. chinense. However， they may obtain different functions such as substrate prefe-rence and catalytic ability during evolution.

Key words：Loropetalum chinense var. rubrum; dihydroflavonol-4-reductase（DFR）; gene cloning; bioinformatics analysis; subcellular localization

Foundation item： Project of Hunan Department of Science and Technology（2016NK2097）; Hunan Natural Science Foundation（2019JJ50135）; Project of Zhuzhou Science and Technology Bureau（Zhukefa〔2017〕68）; Zhuzhou Science and Technology Talent Support Project（2019TJ-06）

0 引言

【研究意義】紅花檵木（Loropetalum chinense var. rubrum）是金縷梅科（Hamamelidaceae）檵木屬（Loropetalum）植物，為我國(guó)特有的觀花觀葉灌木，其葉子長(zhǎng)時(shí)間保持紅色，且植株易繁殖、耐修剪，是我國(guó)南方地區(qū)常用的園林觀賞植物（彭閏珉和于曉英，2012）。葉片是否呈紅色，主要取決于葉片中花青苷物質(zhì)的含量，因此可將葉片中花青苷物質(zhì)的含量及其穩(wěn)定性作為新品種選育的核心指標(biāo)（彭閏珉和于曉英，2012）。植物花青苷物質(zhì)生物合成涉及到多種合成酶，其中，二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）是生物合成途徑后期的第一個(gè)關(guān)鍵酶，可催化底物二氫黃酮醇流向花青苷代謝途徑（Santos-Buelga et al.，2014;李亞麗等，2018）。因此，開展紅花檵木DFRs基因克隆及功能研究，深入了解紅花檵木該類同源基因在花青苷物質(zhì)生物合成的作用，對(duì)促進(jìn)紅花檵木品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】DFR是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）依賴的還原酶家族成員，能利用NADP輔因子催化二氫黃酮醇還原形成無色、不穩(wěn)定的無色花青素，以其為前體進(jìn)一步合成有色花青苷物質(zhì)（Petit et al.，2007）。大量研究證實(shí)，DFR在部分經(jīng)濟(jì)作物和觀賞植物組織顏色形成過程中發(fā)揮著十分重要的作用。馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）塊莖中生成紅色花青苷物質(zhì)需要StDFR基因（又稱R基因座）高效表達(dá)，如在白色塊莖品種中過表達(dá)StDFR基因能完全恢復(fù)塊莖花青苷物質(zhì)的合成能力（De Jong et al.，2003;Zhang et al.，2009）。通過RNAi技術(shù)下調(diào)紫薯（Ipomoea batatas L. cv. Ayamurasaki）IbDFR基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其嫩葉、莖及貯藏根中的花青苷含量均顯著減少，整株顏色變淺（Wang et al.，2013）。利用病毒誘導(dǎo)基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)瞬時(shí)沉默紅葉海棠（Malus spp.）葉片中的McDFR基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受到干擾的葉片由紅色變綠色，花青苷物質(zhì)含量顯著降低，而在綠葉海棠中瞬時(shí)過表達(dá)McDFR基因會(huì)誘導(dǎo)葉片由綠色變紅色，花青苷物質(zhì)含量顯著增加（Tian et al.，2015）。利用CRISPR/cas9技術(shù)對(duì)牽?；ǎ↖pomoea nil）的InDFR-B基因進(jìn)行編輯，結(jié)果顯示DFR-B雙等位基因同時(shí)突變會(huì)導(dǎo)致花朵中花青苷物質(zhì)消失，花由紫羅蘭色變成白色（Watanabe et al.，2017）。通過在煙草中異源過表達(dá)其他植物的DFRs基因，包括苜蓿（Medicago trunca-tula）的MtDFR1（Xie et al.，2004）、玫瑰（Rosa rugosa）的RrDFR1（Luo et al.，2016）、矮牽牛（Petunia hybrida）的PhDFR（Luo et al.，2016）、美麗葡萄（Vitis bellula）的VbDFR（Zhu et al.，2018）和麝香蘭（Muscari spp.）的MaDFR（Liu et al.，2019），結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些植物的DFRs基因均參與花青苷物質(zhì)的積累，也間接說明DFRs在進(jìn)化過程中保持了生物學(xué)功能的保守性。此外，觀賞植物DFRs基因克隆及功能研究也較多，如牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）（周琳等，2011）、百合（Lilium）（覃仁娟，2014）、香雪蘭（Freesia hybrida）（Li et al.，2017）和一串紅（Euphorbia pulcherrima willd. ex Klotzsch）（Gu et al.，2018）等，結(jié)果均顯示這些觀賞植物DFRs基因與花青苷物質(zhì)的積累緊密相關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)于紅花檵木DFRs基因的相關(guān)研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于前期紅花檵木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過RT-PCR克隆出LcDFR1和LcDFR2基因cDNA序列，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行功能分析，構(gòu)建35S：：LcDFR1-GFP和35S：：LcDFR2-GFP表達(dá)載體并檢測(cè)編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，為深入了解LcDFR1和LcDFR2基因在紅花檵木花青苷合成過程中的調(diào)控作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試紅花檵木為4年生扦插苗，盆栽于溫室內(nèi);用于瞬時(shí)表達(dá)的本氏煙草種植于植物光照培養(yǎng)箱中。植物多糖多酚總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PCR產(chǎn)物磁珠回收試劑盒、無縫連接試劑盒和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;AGL-0根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞為自制保存;pCAMBIA1305-GFP為湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室改造保存。主要儀器設(shè)備：Fusion FX5-XT凝膠成像系統(tǒng)（Vilber，法國(guó)）和SP8激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國(guó)）。

1. 2 RNA提取和第一鏈cDNA合成

利用植物RNA提取試劑盒提取紅花檵木葉片總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。以總RNA為模板，利用Oligo dT18引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 LcDFR1和LcDFR2基因克隆

基于紅花檵木轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從中篩選到3個(gè)DFRs同源cDNA序列，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)僅有2個(gè)基因包含有完整的開放閱讀框（ORF），長(zhǎng)度分別為1014和993 bp，分別命名為L(zhǎng)cDFR1和LcDFR2。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)這2個(gè)基因5'-非編碼區(qū)（5'-UTR）和3'-UTR區(qū)域的特異引物DFR1-F/DFR1-R和DFR2-F/DFR2-R（表1），用于擴(kuò)增LcDFR1和LcDFR2基因cDNA序列（包含部分5'-UTR、3'-UTR及完整ORF）。以cDNA第一鏈為模板，利用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶擴(kuò)增LcDFR1和LcDFR2基因cDNA序列。反應(yīng)體系25.0 μL：5×PrimeSTAR GXL Bu-ffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL，10 mmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板0.3 μL，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶0.5 μL，滅菌水補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 80 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，挑取條帶大小正確的目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)通，以確定轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中LcDFR1和LcDFR2基因cDNA序列的正確性。

1. 4 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 9.0對(duì)LcDFR1和LcDFR2基因的ORF及其編碼氨基酸序列進(jìn)行分析。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)LcDFR1和LcDFR2的同源氨基酸序列進(jìn)行搜索。利用DNAMAN 9.0對(duì)不同物種DFRs氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并利用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。最后，使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1. 5 植物表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

根據(jù)紅花檵木LcDFR1和LcDFR2基因的ORF序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF片段（不包含終止密碼子）的特異引物DFR1-GFP-F/DFR1-GFP-R和DFR2-GFP-F/DFR2-GFP-R（表1）。利用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶對(duì)LcDFR1和LcDFR2基因ORF片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)磁珠法回收后利用無縫連接試劑盒連接到Xba I酶切線性化的pCAMBIA1305-GFP載體上，獲得重組植物表達(dá)載體35S：：LcDFR1-GFP和35S：：LcDFR2-GFP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定后挑取陽(yáng)性菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的35S：：LcDFR1-GFP和35S：：LcDFR2-GFP重組植物表達(dá)載體，利用熱激法分別轉(zhuǎn)化AGL-0根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定獲得陽(yáng)性單克隆菌，將其接種至LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)振蕩培養(yǎng)后離心積菌用滲透液重懸，用注射器吸取5 mL菌液侵染3周齡本氏煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，培養(yǎng)3 d后用SP8激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)（王晰等，2018）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 LcDFR1和LcDFR2基因克隆及序列分析結(jié)果

以紅花檵木葉片的cDNA第一鏈為模板，分別用特異引物DFR1-F/DFR1-R和DFR2-F/DFR2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得LcDFR1和LcDFR2基因cDNA序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示目標(biāo)擴(kuò)增條帶均約1100 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，其中LcDFR1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物還存在非特異性擴(kuò)增（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，LcDFR1和LcDFR2基因cDNA序列與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，包含完整ORF序列，其中LcDFR1基因ORF全長(zhǎng)為1014 bp，編碼337個(gè)氨基酸殘基（圖2），LcDFR2基因ORF全長(zhǎng)為993 bp，編碼330個(gè)氨基酸殘基（圖3）。

2. 2 同源性比對(duì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

將LcDFR1和LcDFR2氨基酸序列與其他植物的DFRs氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，包括葡萄（Vitis vini-fera）VvDFR（NP_001268144.1）、山核桃（Carya illinoinensis）CiDFR（QCT85679.1）、芍藥（Paeonia lactiflora）PlDFR（QIC54081.1）、牡丹（P. suffruticosa）PsDFR（AMW36065.1）、擬南芥（Arabidopsis thalia-na）AtDFR（NP_199094）、煙草（Nicotiana tabacum）NtDFR（NP_001312661）、玉米（Zea mays）ZmDFR（NP_001152467.2）和水稻（Oryza sativa）OsDFR（CAA 69253.1），結(jié)果如圖4所示。LcDFR1與LcDFR2的氨基酸序列相似性為77%，二者與其他物種DFRs氨基酸序列的相似性均較高，其中與葡萄、山核桃、擬南芥等雙子葉植物的DFRs氨基酸序列相似性為64%～84%，而與單子葉植物玉米和水稻的DFRs氨基酸序列相似性為58%～61%。通過與其他相關(guān)文獻(xiàn)（Lacombe et al.，1997;Li et al.，2017;Liu et al.，2019）中注釋的DFRs特征結(jié)合域氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LcDFR1和LcDFR2的氨基酸序列均包含有NADP結(jié)合域和底物結(jié)合域，且與底物特異性相關(guān)的2個(gè)氨基酸殘基高度保守（圖4）。由圖5可知，LcDFR1與牡丹和芍藥的DFRs聚為一類，而LcDFR2與煙草和番茄（Solanum lycopersicum）的DFRs聚為一類。

2. 3 LcDFR1和LcDFR2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

利用SWISS-MODEL對(duì)LcDFR1和LcDFR2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)二者均與葡萄的VvDFR（2c29.1.A）為同源模板，其中，LcDFR1蛋白與VvDFR（2c29.1.A）的氨基酸序列相似性達(dá)84.48%，GMQE達(dá)0.96，QMEAN為0.66，說明其與同源模板的匹配度較高，且三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其含有1個(gè)保守的NADP結(jié)合位點(diǎn)，但未預(yù)測(cè)到底物結(jié)合位點(diǎn)（圖6-A）;LcDFR2蛋白與VvDFR（2c29.1.A）的氨基酸序列相似性為79.27%，GMQE達(dá)0.95，QMEAN為0.52，說明匹配度也較高。此外，LcDFR2與LcDFR1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)重疊率高，空間結(jié)構(gòu)相似（圖6-B），但其三級(jí)結(jié)構(gòu)未預(yù)測(cè)到保守的NADP結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)。

2. 4 植物表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位結(jié)果

分別以DFR1-GFP-F/DFR1-GFP-R和DFR2-GFP-F/DFR2-GFP-R為引物，PCR擴(kuò)增出LcDFR1和LcDFR2基因的ORF序列，長(zhǎng)度在1000 bp左右（圖7-A和圖7-B），并將其與線性化的pCMBIA1305-GFP進(jìn)行連接，獲得重組植物表達(dá)載體35S：：LcDFR1-GFP和35S：：LcDFR2-GFP（圖8），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定及測(cè)序驗(yàn)證后，提取陽(yáng)性質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到AGL-0根癌農(nóng)桿菌，PCR鑒定出陽(yáng)性單克隆菌（圖7-C和圖7-D）。采用葉片注射法用將陽(yáng)性單克隆菌液侵染本氏煙草葉片下表皮，培養(yǎng)3 d培養(yǎng)后，利用Leica SP8激光共聚焦顯微鏡觀察煙草表皮細(xì)胞中的熒光信號(hào)，結(jié)果如圖9所示，LcDFR1和LcDFR2蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果比較相似，主要定位于煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

3 討論

紅花檵木是我國(guó)特有的觀花觀葉植物，而花青苷物質(zhì)形成分子機(jī)制研究是紅花檵木分子育種的核心內(nèi)容。DFR是植物花青苷物質(zhì)生物合成途徑后期的第一個(gè)關(guān)鍵酶，能引導(dǎo)底物二氫黃酮醇流向花青苷代謝途徑，對(duì)植物組織的顏色形成起關(guān)鍵作用。已有研究表明，馬鈴薯（De Jong et al.，2003;Zhang et al.，2009）、紫薯（Wang et al.，2013）、海棠（Tian et al.，2015）、牽牛花（Watanabe et al.，2017）等植物的DFRs在花青苷物質(zhì)生物合成途徑中是必需催化酶，若DFRs基因缺失或被干擾則會(huì)導(dǎo)致花青苷物質(zhì)合成障礙。在煙草中異源表達(dá)苜蓿（Xie et al.，2004）、玫瑰（Luo et al.，2016）、矮牽牛（Luo et al.，2016）、美麗葡萄（Zhu et al.，2018）、麝香蘭（Liu et al.，2019）等植物DFRs基因能顯著提升花青苷物質(zhì)的合成。

本研究克隆獲得LcDFR1和LcDFR2基因cDNA序列，分別編碼337和330個(gè)氨基酸殘基，與多種木本植物DFRs氨基酸序列長(zhǎng)度接近，包括葡萄VvDFR（337個(gè)氨基酸殘基）、楓香樹LfDFR（337個(gè)氨基酸殘基）和山核桃CiDFR（339個(gè)氨基酸殘基）。前人研究表明，DFRs作為NADP依賴的家族成員，其氨基酸序列N端有一段約含21個(gè)氨基酸殘基的NADP結(jié)合域特征序列（Lacombe et al.，1997;Li et al.，2017;Liu et al.，2019）。葡萄VvDFR的NADP結(jié)合域序列為VTGASGFIGSWLVMRLLERGY，LcDFR1和LcDFR2的NADP結(jié)合域序列與其相比分別存在1和3個(gè)氨基酸殘基的差異，說明不同物種DFRs的NADP結(jié)合域序列較保守。DFR的底物是二氫黃酮醇類，包括二氫槲皮素（DHQ）、二氫山奈酚（DHK）和二氫楊梅素（DHM）。DFR對(duì)底物的特異識(shí)別主要依賴于一段約28個(gè)氨基酸殘基的底物結(jié)合域序列，某個(gè)特定氨基酸殘基的變化均會(huì)導(dǎo)致該酶對(duì)底物識(shí)別的改變（Johnson et al.，2001;Chen et al.，2020）。如非洲菊（Gerbera jamesonii）GjDFR的N134突變?yōu)長(zhǎng)134，導(dǎo)致該酶只催化DHK、不催化DHQ和DHM;E145突變成L145則導(dǎo)致該酶徹底失去催化活性。紅蓋鱗毛蕨（Dryopteris erythrosora）DeDFR1和DeDFR2的底物特異識(shí)別氨基酸殘基之一為R（對(duì)應(yīng)于GjDFR的N134），決定了這2個(gè)酶只能催化DHK和DHQ，不能催化DHM（Chen et al.，2020）。雖然不同植物DFRs底物識(shí)別序列存在一定差異，但決定底物識(shí)別能力的2個(gè)氨基酸殘基保守性非常高，如VvDFR的N133和E144，這種情況也出現(xiàn)在LcDFR1和LcDFR2中。由于不同DFRs在催化底物時(shí)可能表現(xiàn)出不同的底物偏好性，如香雪蘭的3個(gè)FhDFRs和麝香蘭的MaDFR均偏好催化DHM，導(dǎo)致這2種植物花朵主要累積飛燕草色素而顯藍(lán)色（Li et al.，2017;Liu et al.，2019）。LcDFR1和LcDFR2對(duì)底物的偏好性還需進(jìn)一步通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)進(jìn)行探究。

本研究的LcDFR1和LcDFR2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，二者與葡萄的VvDFR（2c29.1.A）（Petit et al.，2007）晶體結(jié)構(gòu)相似性最高。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)是基于已有的同源蛋白晶體三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而獲得目標(biāo)蛋白的三維模型，比基于氨基酸序列進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果更復(fù)雜和多樣化。在VvDFR的晶體結(jié)構(gòu)中，NADP和DHQ位于三級(jí)空間結(jié)構(gòu)的催化腔中，且NADP配體與VvDFR蛋白上19個(gè)非連續(xù)氨基酸殘基相互作用（包括疏水作用、氫鍵等），而底物DHQ與VvDFR蛋白上8個(gè)非連續(xù)氨基酸殘基相互作用（Petit et al.，2007），完全不同于通過比對(duì)氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)中的NADP特征結(jié)合域（約21個(gè)連續(xù)氨基酸序列）和底物特征結(jié)合域（約27個(gè)連續(xù)氨基酸序列）（Li et al.，2017;Liu et al.，2019）。LcDFR1與VvDFR的氨基酸序列相似性為84%，高于LcDFR2與VvDFR的氨基酸序列相似性（79%），由于氨基酸序列相似性越高，蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)質(zhì)量越高，故LcDFR1的QMEAN為0.66，高于LcDFR2的QMEAN（0.52）。相比LcDFR2的預(yù)測(cè)結(jié)果，LcDFR1所形成的NADP結(jié)合空間結(jié)構(gòu)可能更接近于模板蛋白，因此僅LcDFR1預(yù)測(cè)到NADP結(jié)合位點(diǎn);二者底物結(jié)合位點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)可能與模板蛋白間均存在一定差異，造成底物結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)缺失。但蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果并不完全反映真實(shí)的蛋白結(jié)構(gòu)，蛋白配體/底物結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)缺失可能是由于數(shù)據(jù)庫(kù)中可用的DFR蛋白—配體結(jié)合晶體模型太少（僅有葡萄VvDFR），不能反映出特征結(jié)合位點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)及不同配體結(jié)合的多樣性，從而不利于LcDFR1和LcDFR2三級(jí)結(jié)構(gòu)中結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。今后應(yīng)通過構(gòu)建更多DFR蛋白—配體的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，以利于提高其他未知DFRs的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)LcDFR1和LcDFR2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果重疊率很高，但系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上二者被分到不同的分支中，其中LcDFR1與牡丹和芍藥聚為一類，而LcDFR2與煙草和番茄聚為一類，可能是由于進(jìn)化過程中產(chǎn)生了底物偏好性、催化能力等功能差異。

經(jīng)前人研究證實(shí)，花青苷物質(zhì)首先在細(xì)胞質(zhì)中合成，隨后通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或微自噬介導(dǎo)運(yùn)輸至液泡中（Gomez et al.，2011;Chanoca et al.，2015），推測(cè)DFR蛋白作為花青苷物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶，定位于細(xì)胞質(zhì)中。為進(jìn)一步驗(yàn)證DFRs亞細(xì)胞定位情況，本研究構(gòu)建植物表達(dá)載體35S：：LcDFR1-GFP和35S：：LcDFR2-GFP（GFP位于LcDFRs的C端，以避免其對(duì)N端位置NADP結(jié)合域的功能影響），通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入本氏煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，在SP8激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LcDFR1和LcDFR2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，與美麗葡萄VbDFR-GFP的亞細(xì)胞定位相同（Zhu et al.，2018），表明LcDFR1和LcDFR2是在細(xì)胞質(zhì)中催化底物，符合花青苷物質(zhì)合成的特點(diǎn)。今后可通過體內(nèi)、體外試驗(yàn)驗(yàn)證LcDFR1和LcDFR2的催化活性和底物特異性，從而進(jìn)一步分析其功能，為紅花檵木或其他觀賞植物的彩色育種提供參考。

4 結(jié)論

LcDFR1和LcDFR2在紅花檵木細(xì)胞質(zhì)中催化花青苷物質(zhì)的生物合成，但二者在進(jìn)化過程中產(chǎn)生底物偏好性、催化能力等功能差異

參考文獻(xiàn)：

李亞麗，李欣，肖婕，李瑞玲，楊華麗，孫勃，湯浩茹. 2018. 二氫黃酮醇-4-還原酶在花青素合成中的功能及調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，38（1）：187-196. [Li Y L，Li X，Xiao J，Li R L，Yang H L，Sun B，Tang H R. 2018. Function and regulation characterization of dihydroflavonol 4-reductase in anthocyanin biosynthesis[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，38（1）：187-196.]

彭閏珉，于曉英. 2012. 湖南檵木屬植物的園林應(yīng)用現(xiàn)狀調(diào)查與分析[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，18（6）： 152-155. [Peng R M，Yu X Y. 2012. Investigation and analysis of the landscape application present situation of Loropetalum in Hunan Province[J]. Tianjin Agricultural Sciences，18（6）：152-155.]

覃仁娟. 2014. 百合DFR基因克隆及功能初步鑒定[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué). [Qin R J. 2014. Cloning and functional initial charaterization of the gene encoding dihydroflavonol 4-reductase（DFR） from Lily[D]. Yaan：Sichuan Agricultural University.]

王晰，丁文杰，李婭，劉家偉，王良桂，岳遠(yuǎn)征. 2018. 長(zhǎng)筒石蒜花青素合成酶基因LlANS的克隆與表達(dá)分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，52（4）：611-617. [Wang X，Ding W J，Li Y，Liu J W，Wang L G，Yue Y Z. 2018. Cloning and expre-ssion analysis of anthocyanidin synthase（LlANS） in Lycoris longituba[J]. Journal of Henan Agricultural University，52（4）：611-617.]

周琳，王雁，任磊，彭鎮(zhèn)華. 2011. 牡丹二氫黃酮醇4-還原酶基因PsDFR1的克隆及表達(dá)分析[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，47（9）： 885-892. [Zhou L，Wang Y，Ren L，Peng Z H. 2011. Cloning and expression analysis of dihydroflavonol 4-reductase gene PsDFR1 from tree peony（Paeonia su-ffruticosa Andr.）[J]. Plant Physiology Journal，47（9）：885-892.]

Chanoca A，Kovinich N，Burkel B，Stecha S，Bohorquez-Restrepo A，Ueda T，Eliceiri K W，Grotewold E，Otegui M S. 2015. Anthocyanin vacuolar inclusions form by a microautophagy mechanism[J]. The Plant Cell，27（9）：2545-2559.

Chen X F，Liu W L，Huang X Y，F(xiàn)u H H，Wang Q X，Wang Y F，Cao J G. 2020. Arg-type dihydroflavonol 4-reductase genes from the fern Dryopteris erythrosora play important roles in the biosynthesis of anthocyanins[J]. PLoS One，15（5）：e0232090.

De Jong W S，De Jong D M，De Jong H，Kalazich J，Bodis M. 2003. An allele of dihydroflavonol 4-reductase associa-ted with the ability to produce red anthocyanin pigments in potato（Solanum tuberosum L.）[J]. Theoretical and App-lied Genetics，107（8）：1375-1383.

Gomez C，Conejero G，Torregrosa L，Cheynier V，Terrier N，Ageorges A. 2011. In vivo grapevine anthocyanin transport involves vesicle-mediated trafficking and the contribution of anthoMATE transporters and GST[J]. The Plant Journal，67（7）：960-970.

Gu Z Y，Chen H，Yang R N，Ran M H. 2018. Identification of DFR as a promoter of anthocyanin accumulation in poinsettia（Euphorbia pulcherrima，willd. ex Klotzsch） bracts under short-day conditions[J]. Scientia Horticulturae，236：158-165.

Johnson E T，Ryu S，Yi H，Shin B，Cheong H，Choi G. 2001. Alteration of a single amino acid changes the substrate specificity of dihydroflavonol 4-reductase[J]. The Plant Journal，25（3）：325-333.

Lacombe E，Hawkins S，van Doorsselaere J，Piquemal J，Goffner D，Poeydomenge O，Boudet A M，Grima-Pettenati J. 1997. Cinnamoyl CoA reductase，the first committed enzyme of the lignin branch biosynthetic pathway：Cloning，expression and phylogenetic relationships[J]. The Plant Journal，11（3）：429-441.

Li Y Q，Liu X X，Cai X Q，Shan X T，Gao R F，Yang S，Han T T，Wang S C，Wang L，Gao X. 2017. Dihydroflavonol 4-reductase genes from Freesia hybrida play important and partially overlapping roles in the biosynthesis of flavonoids[J]. Frontiers in Plant Science，8：428.

Liu H L，Lou Q，Ma J R，Su B B，Gao Z Z，Liu Y L. 2019. Cloning and functional characterization of dihydroflavonol 4-reductase gene involved in anthocyanidin biosynthesis of grape hyacinth[J]. International Journal of Molecular Sciences，20（19）：4743.

Luo P，Ning G H，Wang Z，Shen Y X，Jin H N，Li P H，Huang S S，Zhao J，Bao M Z. 2016. Disequilibrium of flavonol synthase and dihydroflavonol-4-reductase expre-ssion associated tightly to white vs. red color flower formation in plants[J]. Frontiers in Plant Science，6：1257.

Petit P，Granier T，dEstaintot B L，Manigand C，Bathany K，Schmitter J M，Lauvergeat V，Hamdi S，Gallois B. 2007. Crystal structure of grape dihydroflavonol 4-reductase，a key enzyme in flavonoid biosynthesis[J]. Journal of Molecular Biology，368（5）：1345-1357.

Santos-Buelga C，Mateus N，De Freitas V. 2014. Anthocyanins. Plant pigments and beyond[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，62（29）：6879-6884.

Tian J，Han Z Y，Zhang J，Hu Y J，Song T T，Yao Y C. 2015. The balance of expression of dihydroflavonol 4-reductase and flavonol synthase regulates flavonoid biosynthesis and red foliage coloration in crabapples[J]. Scientific Reports，5：12228.

Wang H X，F(xiàn)an W J，Li H，Yang J，Huang J R，Zhang P. 2013. Functional characterization of dihydroflavonol-4-reductase in anthocyanin biosynthesis of purple sweet potato underlies the direct evidence of anthocyanins function against abiotic stresses[J]. PLoS One，8（11）：e78484.

Watanabe K，Kobayashi A，Endo M，Sage-Ono K，Toki S，Ono M. 2017. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of the dihydroflavonol-4-reductase-B（DFR-B） locus in the Japanese morning glory Ipomoea（Pharbitis） nil[J]. Scientific Reports，7：10028.

Xie D Y，Jackson L A，Cooper J D，F(xiàn)erreira D，Paiva N L. 2004. Molecular and biochemical analysis of two cDNA clones encoding dihydroflavonol-4-reductase from Medicago truncatula[J]. Plant Physiology，134（3）：979-994.

Zhang Y F，Cheng S P，De Jong D，Griffths H，Halitschke R，De Jong W. 2009. The potato R locus codes for dihydroflavonol 4-reductase[J]. Theoretical and Applied Gene-tics，119（5）：931-937.

Zhu Y，Peng Q Z，Li K G，Xie D Y. 2018. Molecular cloning and functional characterization of a dihydroflavonol 4-reductase from Vitis bellula[J]. Molecules，23（4）：861.

（責(zé)任編輯 陳 燕）