劉文佳 黃光偉 黃 靜 梁雪松

(柳州兩面針股份有限公司，廣西 柳州 545001)

前言

斷血流來(lái)源于唇形科風(fēng)輪菜屬植物風(fēng)輪菜Clinopodiumchinense (Benth) O. Kuntze和蔭風(fēng)輪Clinopodiumpdycephalum (Vaniot) C. Y. WuetHsuan植物的干燥地上部分，為2015年版《中華人民共國(guó)藥典》收載的常用中藥, 具有涼血、止血之功效, 臨床上是一種止血良藥, 主要用于治療崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血、創(chuàng)傷出血、子宮肌瘤出血等出血癥[1]。斷血流所含成分比較復(fù)雜, 主要含有醉魚(yú)草皂苷Ⅳb[2,3]，香蜂草苷、橙皮苷、β甾醇[4]，異櫻花素-7-蕓香糖苷、芹菜素[5]、洋芹素[6]，熊果酸[7]、蒲公英賽醇[8]等成分, 其中三萜皂苷類(lèi)為其主要成分。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究和臨床試驗(yàn)證明, 其皂苷類(lèi)成分具有治療各種出血、單純性紫癜、原發(fā)性血小板減少性紫癜等作用[9-12], 其中醉魚(yú)草皂苷Ⅳb為有效成分之一。因此, 將斷血流中醉魚(yú)草皂苷Ⅳb最大限度地提取出來(lái)，對(duì)提取物功效具有重要現(xiàn)實(shí)意義的。

斷血流提取工藝有水提醇沉法、醇提法、加酶提取法[13]等，水提醇沉法、醇提法使用較為普遍。由于藥典未對(duì)斷血流藥材指標(biāo)成分進(jìn)行明確規(guī)定，對(duì)各研究的制備工藝條件優(yōu)劣無(wú)法判斷。因此本研究通過(guò)對(duì)中藥提取物生產(chǎn)的兩個(gè)重要階段提取和濃縮工藝進(jìn)行研究，進(jìn)行系統(tǒng)地考察了提取溶劑、提取時(shí)間各影響因素對(duì)斷血流指標(biāo)成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb提取的影響, 擬優(yōu)選出最佳制備工藝條件, 最大程度提高斷血流提取物指標(biāo)成分含量，以期為斷血流的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)和工藝參考。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品試劑

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52-98型，上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州萬(wàn)合儀器制造有限公司)；電子分析天平(METTLER TOLEDO，ML204型)；超聲波清洗機(jī)(功率250W，頻率50kHz，廣州維力超聲電子設(shè)備有限公司)。

1.2藥品試劑

斷血流藥材，柳州市桂中大藥房采購(gòu)；醉魚(yú)草皂苷IVb對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究所(批號(hào)：110782-200602，含量以99.5%計(jì))；甲醇為色譜純；超純?nèi)ルx子水；食用酒精。

2 指標(biāo)成分含量測(cè)定方法

2.1對(duì)照品溶液制備

稱(chēng)取醉魚(yú)草皂苷Ⅳb對(duì)照品0.0050g，精確至0.0001g，置于100mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻并使之溶解。此溶液濃度為50μg/mL，置于2～4℃保存。

2.2色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱，5μm，250×4.6mm；流動(dòng)相：甲醇-水，0min～5min，70%甲醇，5min～15min，70%～90%甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm；流速1.0mL/min；柱溫30℃。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

準(zhǔn)確移取2.1對(duì)照品溶液適量以甲醇稀釋配置標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液，制成濃度分別為2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL。在上述2.2的色譜條件，分別取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積(見(jiàn)圖1)。以醉魚(yú)草皂苷Ⅳb的濃度為X軸，其相應(yīng)的峰面積為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明：醉魚(yú)草皂苷Ⅳb在2.5μg/mL～20μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：Y=30.6701X+1.9054，r=0.9999。

圖1 醉魚(yú)草皂苷Ⅳb對(duì)照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.4樣品指標(biāo)成分含量測(cè)定

將斷血流藥材按各工藝條件提取，最后濃縮制備成1∶1的斷血流提取液(一份干藥材制成一份提取物)。精密稱(chēng)取0.1g提取液置于10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻后，用0.45μm濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)樣品溶液。在上述2.2的色譜條件，精密量取20μL注入高效液相色譜儀(樣品色譜圖如圖2所示)，記錄峰面積, 用回歸方程計(jì)算樣品制備成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量即得。

3 試驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1提取階段-單因素考察

3.1.1提取溶劑及濃度

在考慮實(shí)際生產(chǎn)及產(chǎn)品應(yīng)用的基礎(chǔ)上，選取水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇為提取溶劑，溶劑用量10倍，分別采用加熱回流提取1h。按2.4項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。由結(jié)果可知,用30%乙醇與50%乙醇提取及75%乙醇、與95%乙醇提取，其指標(biāo)成分含量接近，表明在30%乙醇至50%乙醇之間及在75%乙醇至95%乙醇之間其指標(biāo)成分提取率差別不大。綜合考慮成本，故選取水、30%乙醇、75%乙醇作為正交試驗(yàn)水平。

表1 不同提取劑濃度對(duì)斷血流提取物指標(biāo)成分影響

3.1.2料液比

稱(chēng)取100g藥材5份，分別按料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入75%乙醇溶液，加熱回流提取2次，每次時(shí)間2h，按2.4項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，醉魚(yú)草皂苷Ⅳb隨著提取溶劑用量的增大而增加，提取越完全。綜合成本考慮，故選用料液比1∶8、1∶10、1∶12作為正交試驗(yàn)水平。

表2 不同料液比對(duì)斷血流提取物指標(biāo)成分影響

3.1.3提取時(shí)間

稱(chēng)取100g藥材5份，加入10倍量75%乙醇溶液，加熱回流提取2次，提取時(shí)間分別按0.5、1.0、1.5、2.0、3.0h，按2.4項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，醉魚(yú)草皂苷Ⅳb隨著提取時(shí)間的增大而增加，1.5h后逐漸趨于平穩(wěn)。綜合成本考慮，故選用提取時(shí)間1.0、1.5、2.0h作為正交試驗(yàn)水平。

表3 不同提取時(shí)間對(duì)斷血流提取物指標(biāo)成分影響

3.1.4提取次數(shù)

稱(chēng)取100g藥材5份，加入10倍量75%乙醇溶液加熱回流提取1、2、3、4、5次，每次提取時(shí)間為1h，按2.4項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，醉魚(yú)草皂苷Ⅳb隨著提取次數(shù)的增加提取越完全，2次后逐漸趨于平穩(wěn)。綜合成本考慮，故選用提取次數(shù)1、2、3次作為正交試驗(yàn)水平。

表4 不同提取次數(shù)對(duì)斷血流提取物指標(biāo)成分影響

3.2提取階段-正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

3.2.1正交設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以指標(biāo)成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察提取溶劑濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)對(duì)提取工藝的影響。按 L9(34)正交表分別進(jìn)行加熱回流提取，按2.4項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并進(jìn)行測(cè)定。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表5，結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 實(shí)驗(yàn)因素水平表

表6 正交試驗(yàn)條件及結(jié)果

3.2.2正交試驗(yàn)結(jié)果分析

采用直觀分析，從表6中的極差計(jì)算結(jié)果可以看到，影響因素順序依次為 A>B>C>D，溶劑濃度(A)為主要因素，且A3>A1>A2，故選其最優(yōu)水平A3；料液比(B)為次要因素，且B3>B2>B1,故選其最優(yōu)水平B3；提取時(shí)間(C)C3>C2>C1，故選擇提取時(shí)間C3；提取次數(shù)(D)極差較小，從極差分析D2優(yōu)于D1與D3，故選擇提取次數(shù)D2。因此最佳提取工藝為A3B3C3D2，即以斷血流藥材12倍量的75%乙醇加熱回流提取2次，每次2.0h。

3.2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

稱(chēng)取3份斷血流藥材，每份100g，依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果的最佳提取工藝，平行實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)定提取液中指標(biāo)成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量。結(jié)果分別為668μg·g-1、689μg·g-1、697μg·g-1。由此可知，在最佳試驗(yàn)工藝條件下，提取物指標(biāo)成分含量相近，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3.3濃縮階段

以上述確定的最佳提取工藝條件對(duì)斷血流進(jìn)行提取，得到的提取液作為下述試驗(yàn)的樣品。

3.3.1濃縮方式

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用常壓加熱濃縮和減壓加熱濃縮(-0.08～-0.09MP)兩種濃縮方式，以提取物指標(biāo)成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量為依據(jù)，在60℃下濃縮2h，并進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)。按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如下表7所示。結(jié)果顯示，采用常壓加熱濃縮方式斷血流提取物中醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量較減壓加熱濃縮高23%左右；說(shuō)明在同樣的條件下，常壓加熱濃縮更有利于斷血流指標(biāo)成分留存。故選擇常壓加熱濃縮方式。

表7 不同濃縮方式對(duì)斷血流提取物指標(biāo)成分影響

3.3.2濃縮溫度

采用常壓加熱濃縮，分別控制濃縮溫度在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下，濃縮時(shí)間為2h；濃縮結(jié)束后按濃縮液的量換算成1∶1的提取物測(cè)定指標(biāo)成分含量。按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如下表8所示。結(jié)果顯示，隨著濃縮溫度的升高，斷血流提取物中醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量也隨之提高，溫度提高到90℃后，含量提高趨勢(shì)趨于平緩。因此，將濃縮溫度控制在90℃較為合適。在提取液提取工藝條件相同的條件下，提取液中醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量應(yīng)恒定在一定量，但卻出現(xiàn)隨著濃縮溫度上升醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量增加的情況，說(shuō)明斷血流提取液中存在其他與醉魚(yú)草皂苷Ⅳb結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，在高溫下轉(zhuǎn)變?yōu)樽眙~(yú)草皂苷Ⅳb，使其含量提高。

表8 不同濃縮溫度對(duì)斷血流提取物指標(biāo)成分影響

3.3.3濃縮時(shí)間

采用常壓加熱濃縮，分別控制濃縮時(shí)間為1h、2h、3h、4h、5h下，濃縮溫度為100℃；濃縮結(jié)束后按濃縮液的量換算成1∶1的提取物測(cè)定指標(biāo)成分含量。按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如下表9所示。結(jié)果顯示，斷血流提取物中醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量隨著濃縮時(shí)間的增大而提高，濃縮時(shí)間到4小時(shí)后，含量趨于平穩(wěn)。因此，綜合考慮生產(chǎn)效率幾能耗，將濃縮時(shí)間控制在4h較為合適。在提取液提取工藝條件相同的條件下，提取液中醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量應(yīng)恒定在一定量，但卻出現(xiàn)隨著濃縮時(shí)間上升醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量增加的情況，與隨濃縮溫度提高其含量也隨之提高一樣，說(shuō)明斷血流提取液中存在其他與醉魚(yú)草皂苷Ⅳb結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，濃縮時(shí)間延長(zhǎng)提高了轉(zhuǎn)化率，從而使醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量隨之提高。

表9 不同濃縮時(shí)間對(duì)斷血流提取物指標(biāo)成分影響

3.3.4驗(yàn)證試驗(yàn)

取在最佳提取工藝條件下提取的斷血流提取液3份，采用常壓加熱濃縮進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，控制濃縮時(shí)間為4h，濃縮溫度為90℃，最后將濃縮液調(diào)成1∶1的提取物；測(cè)定提取物中指標(biāo)成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量。結(jié)果分別為1702μg·g-1、1657μg·g-1、1715μg·g-1。由此可知，在采用常壓加熱濃縮，濃縮時(shí)間為4h，濃縮溫度為90℃時(shí)，提取物指標(biāo)成分含量較高且相近，表明該濃縮工藝穩(wěn)定可行。

3.4工藝對(duì)比試驗(yàn)

將本文研究得出的最佳提高斷血流提取物指標(biāo)成分提取濃縮工藝(A∶75%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12、加熱回流提取2次，每次2h；提取液采用常壓加熱濃縮，濃縮溫度為90℃，濃縮時(shí)間為4h。)與其它研究工藝(B：75%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶10、加熱回流提取2次，每次2.5h；提取液采用減壓加熱濃縮(-0.08～-0.09MP)，濃縮溫度為60℃，濃縮時(shí)間為3h。)對(duì)比。

取斷血流藥材6份，每份100g，按上述兩種工藝方法進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果如表10所示，采用工藝方法A制備斷血流提取物，其指標(biāo)成分較工藝方法B提高了3倍。結(jié)果表明，本文研究的斷血流提取濃縮工藝，能顯著的提高其指標(biāo)成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量。

表10 工藝對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了中藥斷血流提取物的制備工藝，以提高其指標(biāo)成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量為主要目的。對(duì)制備工藝的提取階段和濃縮階段進(jìn)行了考察，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取階段的最佳工藝：75%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12、加熱回流提取2次，每次2h；并對(duì)濃縮階段的濃縮方式選擇及其影響因素分別進(jìn)行了試驗(yàn)，得出了最佳濃縮工藝方法：采用常壓加熱濃縮，濃縮溫度為90℃，濃縮時(shí)間為4h；最后通過(guò)工藝對(duì)比試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明，本文研究的斷血流提取濃縮工藝，能顯著的提高其指標(biāo)成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量，較對(duì)比工藝含量提高了3倍，該工藝穩(wěn)定可行，適應(yīng)大生產(chǎn)要求。但斷血流提取物其標(biāo)成分醉魚(yú)草皂苷Ⅳb含量在濃縮階段隨濃縮條件變化而顯著變化的原因，還有待進(jìn)一步深入研究。