王智亨，左婕，王夢(mèng)琪，朱少軍，劉奕杉

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）兒童口腔科-口腔預(yù)防科，新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊（830054）

1 材料和方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)液、PBS緩沖液、胎牛血清及2.5 g/L胰蛋白酶、opti-MEM、雙抗（Hyclone，美國(guó)）；谷氨酰胺和Ⅰ型膠原酶溶液（Gibco，美國(guó)）；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸（Sigma，美國(guó)）；lipofectamine 3000（Invitrogen，美國(guó)）；miR-214-3p mimics（5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3′，5′-GCCUGUCUGUGCCUGCUGUUU-3′）、miR-214-3p inhibitor（5′-CUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3′）和染料法Hairpin-it miRNAs定量和U6校準(zhǔn)qRT-PCR試劑盒（吉瑪，上海）；熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RIPA裂解液、ECl顯色液、AP顯色液（Thermo，德國(guó)）；RUNX-2抗體、β-actin抗體、β-catenin抗體、山羊抗兔熒光二抗（Abcam，美國(guó)）、兔抗鼠熒光二抗（中杉金橋，中國(guó)），茜素紅（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 牙囊細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取3～4日齡SD大鼠的乳鼠（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（新）2013-0002，新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）脫頸處死，75%酒精浸泡5 min，取雙側(cè)下頜骨，PBS沖洗，洗凈血液，剝除頜骨多余肌肉組織，置于裝有α-MEM的培養(yǎng)皿中，顯微手術(shù)器械剝離牙胚，體視顯微鏡下剝離牙胚表面牙囊，剪碎，吸取置15 mL離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清，置2 mL胰酶于離心管中重懸組織碎片。將離心管至于37℃水浴鍋中震蕩5 min，加入4 mLⅠ型膠原酶。將離心管至于37℃搖床中，200 r/min消化35min。置4 mL完全培養(yǎng)基終止消化，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清。以10 mL完全培養(yǎng)基（含有15%FBS、1%雙抗及1%谷氨酰胺，以α-MEM配制）重懸離心管底部細(xì)胞團(tuán)塊，至于培養(yǎng)瓶中放入37℃，含有飽和濕度及體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，12～15 h換液，雙向差速傳代法純化牙囊細(xì)胞，此前本課題組已進(jìn)行鑒定［10］，傳代至第3～4代備用。

1.3 轉(zhuǎn)染與成骨誘導(dǎo)

轉(zhuǎn)染前一天取3～4代牙囊細(xì)胞接種于6孔板中，確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h內(nèi)可生長(zhǎng)至70%，棄去原培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，每孔加入完全培養(yǎng)基1.5 mL待用。每孔取250μL Opti-MEM與4μL Lipofectamin 3000混合5 min，250μL Opti-MEM與5μL miR-214 mimics（miR-214 mimics組），miR-214 inhibitor（miR-214 inhibitor組），混合5 min，將兩種混合液混合20 min，滴入孔板，輕晃混勻。5 h后更換成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%FBS、0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50 mg/L維生素C的α-MEM培養(yǎng)液），每2日換液。

1.4 RNA提取及qRT-PCR

1.4.1 轉(zhuǎn)染效率及成骨誘導(dǎo)后miR-214的表達(dá) 轉(zhuǎn)染1、2、3 d后，提取miR-214 mimics組、miR-214 inhibitor組和DFCs組（正常DFCs）細(xì)胞，利用Trizol提取總RNA，qRT-PCR檢測(cè)miR-214。以上3組成骨誘導(dǎo)7 d，利用Trizol提取總RNA，進(jìn)行qRTPCR。逆轉(zhuǎn)錄條件：采用20μL體系，溫度設(shè)置為25℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃保存。PCR反應(yīng)條件為：20μL體系，溫度設(shè)置為：預(yù)變性95℃3 min，PCR反應(yīng)95℃12 s，62℃40 s，40個(gè)循環(huán)。引物見(jiàn)表1。

1.4.2 成骨相關(guān)基因的檢測(cè) 上述3組經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d的細(xì)胞，利用Trizol提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用Syber Green檢測(cè)試劑盒將所得的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，qRTPCR進(jìn)行成骨相關(guān)基因：成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runtrelated transcription factor-2，RUNX-2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨粘連蛋白（osteonectin，OSN）的檢測(cè)。均采用20μL體系，引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為：PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃5 s；60℃10 s，45個(gè)循環(huán)。

表1 qRT-PCR目的基因引物序列Table 1 qRT-PCR target gene primer sequence

1.5 蛋白免疫印跡

上述3組成骨誘導(dǎo)7 d，培養(yǎng)皿使用PBS沖洗3次后，加入細(xì)胞裂解液，置于冰上30 min；用細(xì)胞刮刀仔細(xì)刮擦六孔板底，將刮取的細(xì)胞碎片吸入預(yù)冷的微量離心管中，超聲裂解細(xì)胞；將獲得的細(xì)胞裂解液離心5 min（4℃120 000 r/min），取上清用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，100℃煮沸蛋白5 min使其變性，冰上冷卻，短暫離心后備用。制膠，電泳后80 mA轉(zhuǎn)膜條件2 h，封閉2 h后，以脫脂牛奶稀釋RUNX-2、βcatenin、β-actin一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min。二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，β-catenin、β-actin使用ECL發(fā)光劑液顯色，RUNX-2使用AP顯色液顯色蛋白凝膠成像系統(tǒng)分析樣品中目標(biāo)蛋白的相對(duì)含量。

1.6 茜素紅染色

將miR-214 mimics組、miR-214 inhibitor組、DFCs組細(xì)胞接種于30 mm培養(yǎng)皿中，成骨誘導(dǎo)14 d，棄去培養(yǎng)液，使用PBS沖洗3次，用多聚甲醛固定細(xì)胞，茜素紅染液染色5 min，ddH2O漂洗3次，倒置顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 牙囊細(xì)胞的分離培養(yǎng)

原代細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中10 d可生長(zhǎng)至80%～90%，經(jīng)雙向差速法提純3～4代可得純化的牙囊細(xì)胞（圖1）。

Figure 1 Primary DFCs and DFCs purified to the third generation by bidirectional differential passaging圖1 原代DFCs及經(jīng)雙向差速傳代法提純至第三代的DFCs

2.2 qRT-PCR

2.2.1 轉(zhuǎn)染效果 經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)染1 d，miR-214 inhibitor組miR-214表達(dá)受抑制，較正常DFCs下降43倍（P＜0.01），miR-214 mimics組表達(dá)上調(diào)41倍（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染2 d及轉(zhuǎn)染3 d，miR-214的轉(zhuǎn)染效果逐漸弱化（P＜0.05）（圖2）。

Figure 2 Expression of miR-214 1,2 and 3 days after transfection of the miR-214 mimics and miR-214 inhibitor圖2 轉(zhuǎn)染miR-214 mimics及miR-214 inhibitor后1、2、3 d miR-214表達(dá)情況

2.2.2 成骨誘導(dǎo)后miR-214的表達(dá) 成骨誘導(dǎo)7 d，miR-214 mimics組miR-214的表達(dá)較正常DFCs組高22倍（P＜0.01），而miR-214 inhibitor組miR-214的表達(dá)低于正常DFCs組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.2.3 成骨誘導(dǎo)后成骨相關(guān)基因的表達(dá) miR-214 mimics組，成骨相關(guān)基因ALP、OSN及RUNX-2的mRNA表達(dá)均低于正常DFCs組，但僅ALP在兩組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而miR-214 inhibitor組成骨相關(guān)基因OSN及RUNX-2、ALP的mRNA表達(dá)均高于DFCs組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

Figure 3 Expression of miR-214 after 7 days of osteogenesis induction after the transfection of the miR-214 mimics and miR-214 inhibitor圖3 轉(zhuǎn)染miR-214 mimics及miR-214 inhibitor并成骨誘導(dǎo)7 d miR-214的表達(dá)情況

Figure 4 Expression of ALP,OSN,RUNX-2 after 7 days of osteogenesis induction after the transfection of the miR-214 mimics and miR-214 inhibitor圖4 轉(zhuǎn)染miR-214 mimics及miR-214 inhibitor并成骨誘導(dǎo)7 d ALP、OSN、RUNX-2 mRNA表達(dá)情況

2.3 免疫蛋白印跡結(jié)果

miR-214 mimics組，RUNX-2、β-catenin的蛋白表達(dá)均低于miR-214 inhibitor組，但miR-214 mimics組及miR-214 inhibitor組RUNX-2、β-catenin的蛋白表達(dá)均高DFCs組（圖5）。

Figure 5 Expression of RUNX-2 andβ-catenin after 7 days of osteogenesis induction in the miR-214 mimics,miR-214 inhibitor，DFCs groups圖5 miR-214 mimics組、miR-214 inhibitor組、DFCs組成骨誘導(dǎo)7 d RUNX-2、β-catenin蛋白的表達(dá)情況

2.4 茜素紅染色結(jié)果

成骨誘導(dǎo)14 d，經(jīng)茜素紅染色可明顯觀察到，miR-214 mimics組鈣化結(jié)節(jié)明顯少于DFCs組，而miR-214 inhibitor組的鈣化結(jié)節(jié)卻明顯多于DFCs組（圖6）。

Figure 6 Images of mineralized nodules by alizarin red staining after 14 days of osteogenesis induction in the 3 groups圖6 成骨誘導(dǎo)14 d 3組礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色圖片

3討論

牙囊在牙齒萌出過(guò)程中的作用是不可替代的，在形成牙齒萌出通道，提供牙齒萌出的動(dòng)力中發(fā)揮了不可替代的作用，具體表現(xiàn)為牙囊方的破骨現(xiàn)象以及根方的成骨現(xiàn)象［11-12］。經(jīng)典的Wnt通路對(duì)成骨分化的調(diào)控取決于細(xì)胞的類型，以及成骨分化的階段［13-14］，在本研究中發(fā)現(xiàn)了Wnt/βcatenin經(jīng)典通路對(duì)于牙囊細(xì)胞的成骨分化早期的促進(jìn)作用，而不是抑制。

Wang等［15］通過(guò)切除大鼠卵巢建立骨質(zhì)疏松模型，發(fā)現(xiàn)其骨組織miR-214高表達(dá)，在后肢卸載小鼠卸載模型中，其成骨細(xì)胞中miR-214水平較基線小鼠更高。在體內(nèi)注射antagomir-214（miR-214拮抗劑）后，發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。其體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也得出了相同的結(jié)論。并發(fā)現(xiàn)miR-214與轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）呈負(fù)相關(guān)，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告法證明了ATF4是miR-214的靶基因。類似的結(jié)果在Yao等［16］的研究中也得以證明，其利用牙周膜干細(xì)胞的干細(xì)胞特性進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)miR-214的表達(dá)在成骨誘導(dǎo)后下調(diào)，而ATF4的表達(dá)下調(diào)。將miR-214 inhibitor（miR-214抑制劑）轉(zhuǎn)染至牙周膜干細(xì)胞后行成骨誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的成骨基因表達(dá)上調(diào)，而ATF4表達(dá)上調(diào)，這與本研究的結(jié)果一致。同樣，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也有力的證明了這一點(diǎn)，有研究建立小鼠的脛骨骨折模型并定期注射agomir-214及antagomir-214，發(fā)現(xiàn)agomir-214組中小鼠骨折愈合狀況差于antagomir-214組，且Western-blot實(shí)驗(yàn)顯示β-catenin的表達(dá)也受到抑制［17］。miR-214對(duì)于β-catenin的抑制作用還體現(xiàn)在其對(duì)于調(diào)節(jié)人毛囊干細(xì)胞的增殖與分化中［18］。除此之外，有研究還發(fā)現(xiàn)抑制miR-214可以促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1的成活以及其細(xì)胞外基質(zhì)的形成，而細(xì)胞外基質(zhì)的形成是礦物質(zhì)積累以及成骨現(xiàn)象的基礎(chǔ)［19］。已有用于治療骨質(zhì)疏松的研究表明，通過(guò)納米粒子向骨吸收表面?zhèn)魉蚢nti-miR-214可以改善骨微結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量［20-21］。本研究證明了牙囊細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)后其β-catenin表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-214 mimics的牙囊細(xì)胞其成骨分化受到抑制，β-catenin的表達(dá)呈現(xiàn)抑制的現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitor的牙囊細(xì)胞與之相反。說(shuō)明miR-214對(duì)于牙囊細(xì)胞的成骨分化起這抑制的作用，其中有可能是通過(guò)下調(diào)β-catenin的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究有一定的不足之處，未能進(jìn)一步檢測(cè)Wnt/β-catenin通路下游基因的表達(dá)，因此未能完全闡述miR-214抑制DFCs成骨分化的確切機(jī)制。

進(jìn)一步明確miR-214對(duì)于牙囊的調(diào)控作用，將有助于預(yù)防及治療牙齒萌出障礙，更好造福于患者。