張斌　韓敏　相德才　劉韶娜　沙茜　張桂生　趙智勇　趙彥光

摘要：【目的】明確自然抵抗相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1基因（Nramp1）多態(tài)性對(duì)其在滇陸豬群體各組織中表達(dá)的影響，從分子遺傳學(xué)角度闡述滇陸豬不同基因型個(gè)體對(duì)疫病免疫的遺傳差異，為其抗病育種選育提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎肞CR對(duì)27頭滇陸豬Nramp1基因進(jìn)行擴(kuò)增，以DNASTAR 5.0進(jìn)行序列比對(duì)分析及多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)檢測(cè);同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Nramp1基因在滇陸豬各組織中的相對(duì)表達(dá)量，并運(yùn)用SPSS 19.0分析Nramp1基因多態(tài)性對(duì)其在滇陸豬群體各組織中表達(dá)的影響?！窘Y(jié)果】在滇陸豬Nramp1基因第5外顯子、第5內(nèi)含子和第6外顯子上分別發(fā)現(xiàn)SNP1（T→C）、SNP2（A→G）和SNP3（G→A）等3個(gè)SNPs位點(diǎn)，都只存在2種基因型，且SNP1位點(diǎn)和SNP3位點(diǎn)在試驗(yàn)豬群體中屬于低度多態(tài)[多態(tài)信息含量（PIC）/雜合度（He）<0.25）]，SNP2位點(diǎn)屬于中度多態(tài)（0.25

關(guān)鍵詞： 滇陸豬;自然抵抗相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1基因（Nramp1）;多態(tài)性位點(diǎn)（SNPs）;基因型;組織差異表達(dá)

中圖分類號(hào)： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）01-0202-07

Abstract：【Objective】To clarify the effect of polymorphism of natural resistance-related macrophage protein 1 gene （Nramp1） on its expression in tissues of Dianlu pig， aiming at elaborating the genetic differences of different genotypes of Dianlu pigs on disease immunity from the perspective of molecular genetics， and providing a reference for disease resistance breeding. 【Method】The Nramp1 gene of 27 Dianlu pigs were amplified by PCR，and the sequence alignment analy-sis and the polymorphic sites（SNP）were detected with DNASTAR 5.0. Meanwhile， the real-time quantitative fluorescence PCR（qPCR） was used to detect the relative expression of the Nramp1 gene in tissues of Dianlu pigs， and the SPSS 19.0 was used to analyze the effect of Nramp1 gene polymorphism on its expression in the tissues of Dianlu pig. 【Result】Three SNPs of SNP1 （T→C）， SNP2 （A→G） and SNP3 （G→A） were found on the 5th exon， 5th intron and 6th exon of the Nramp1 gene in Dianlu pig， respectively. There were only two genotypes in each polymorphism. The SNP1 and SNP3 were at low polymorphism [polymorphism information content（PIC）/heterozygosity（He） <0.25] and SNP2 was at mo-derate polymorphism （0.25<PIC/He<0.5） in the experimental population. There were significant differences in the relative expression of the Nramp1 gene among the tissues of Dianlu pigs（P<0.05， the same below）， that showing lung>liver>spleen>heart. In addition， the tissue-differential expression of the Nramp1 gene in different genotype groups of Dianlu pig was also different， especially the Nramp1 gene expression in the liver of homozygous group at SNP2 was significantly lower than that of heterozytous group， indicating that the variation of the Nramp1 gene polymorphism site had significant effect on its expression in the tissues of Dianlu pig. 【Conclusion】The variation of the Nramp1 gene SNP can influence Nramp1 gene expression change in the tissues of Dianlu pig， thereby affecting the immune response reaction of Dianlu pig body. SNP2 site can be used as a molecular marker for disease resistance breeding in Dianlu pig.

Key words： Dianlu pig; natural resistance-related macrophage protein 1 gene（Nramp1）; polymorphic sites（SNPs）; genotype; tissue differential expression

Foundation item：Yunnan Key Research and Development Project（2018BB003）;Yunnan Application and Basic research Project（2017FD055，2018FD001）; Basic Research Project of Yunnan Animal Science and Veterinary Institute（2019RW012）

0 引言

【研究意義】滇陸豬是云南省自主培育成功的新品種，具有產(chǎn)子多、肉質(zhì)好、生長(zhǎng)速度較快、母性強(qiáng)及瘦肉率高等優(yōu)勢(shì)（國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)，2011），但在大規(guī)模集約化養(yǎng)殖過(guò)程中其面臨的問(wèn)題也逐漸凸顯，尤其是各種流行病害（豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病和豬支原體肺炎等）對(duì)其養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的危害。針對(duì)相關(guān)疫病的發(fā)生與流行雖然可通過(guò)疫苗免疫進(jìn)行預(yù)防，但在免疫力選擇下會(huì)不斷產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)致病性菌（毒）株（Escudero et al.，2007;張雪花等，2018），且這些病原體極易污染并長(zhǎng)期存在而難以清除。因此，迫切需要對(duì)滇陸豬實(shí)施抗病育種選育，為促進(jìn)其養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展提供保障?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自然抵抗相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1基因（Nramp1）是Vidal等（1993，1996）在近交小鼠中發(fā)現(xiàn)的一段較保守基因序列，是Nramp基因家族成員之一。豬Nramp1基因由15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成（Wu et al.，2007），且有研究發(fā)現(xiàn)該基因第6個(gè)內(nèi)含子NdeⅠ限制性位點(diǎn)的多態(tài)性變異不僅與豬免疫功能存在顯著相關(guān)性（Wu et al.，2008），還與仔豬腹瀉的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)（趙生國(guó)等，2013;古少波等，2017;羅興等，2017）。此外，Ding等（2014）采用PCR-RFLP對(duì)皖南黑豬、淮豬和渭豬的Nramp1基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明該基因的g.130 C>T位點(diǎn)和g.657 A>G位點(diǎn)變異與單核細(xì)胞百分比、中間細(xì)胞百分比及CD4/CD8 T淋巴細(xì)胞等血液免疫性狀相關(guān)。戴超輝等（2017）從細(xì)胞水平探討Nramp1基因與仔豬腹瀉的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬腸道上皮細(xì)胞經(jīng)不同大腸桿菌刺激后，Nramp1基因在腸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)量呈不同倍數(shù)的上調(diào)變化。Wen等（2018）對(duì)豬的Nramp1蛋白結(jié)構(gòu)及其氨基酸序列進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約克夏豬與藏豬存在抗病性差異，其原因可能是約克夏豬Nramp1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域及三級(jí)結(jié)構(gòu)與藏豬Nramp1蛋白相比存在顯著差異?？梢?jiàn)，Nramp1基因可作為豬分子抗病育種的候選基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，有關(guān)Nramp1基因的抗病性雖然已從DNA或mRNA層面在不同豬品種上得到驗(yàn)證，但有關(guān)其DNA多態(tài)性與mRNA表達(dá)量的相關(guān)性尚無(wú)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)PCR擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)等方法分析Nramp1基因多態(tài)性變化對(duì)Nramp1基因在滇陸豬群體各組織中表達(dá)的影響，旨在從分子遺傳學(xué)角度闡述滇陸豬不同基因型個(gè)體對(duì)疫病免疫的遺傳差異，為其抗病育種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

以隨機(jī)挑選不同母本的6月齡滇陸豬為試驗(yàn)材料，共27頭，采集其耳組織，置于裝有75%酒精的離心管中，-70 ℃保存。同時(shí)對(duì)27頭滇陸豬進(jìn)行屠宰，采集其心臟、肝臟、脾臟和肺臟等組織樣品，立即置于裝有RNA Save液的離心管中，-70 ℃保存。

1. 2 滇陸豬Nramp1基因多態(tài)性檢測(cè)

1. 2. 1 基因組DNA提取及檢測(cè) 參照天根生化科技（北京）有限公司的組織DNA提取試劑盒說(shuō)明，提取滇陸豬耳組織樣品的基因組DNA，并以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行提取效果檢測(cè)。

1. 2. 2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank已公布的豬Nramp1全基因序列（NC_010457.5），采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增滇陸豬Nramp1基因的特異性引物（F1：5'-TTCCAGCCCAACAGTGTAGG-3'和R1：5'-CTTT CATTGCCAGGTCCCCT-3'），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度689 bp，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1. 2. 3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析 對(duì)27頭滇陸豬耳組織DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25.0 μL，包含Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板（約50 ng）2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后送至中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司進(jìn)行單向（正向）測(cè)序，再以DNASTAR 5.0進(jìn)行序列比對(duì)分析及多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)。

1. 3 滇陸豬Nramp1基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

1. 3. 1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 使用從天根生化科技（北京）有限公司購(gòu)買的TRNzol-A+ Reagent提取27頭滇陸豬組織樣品中的總RNA，并參照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明將以上總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 3. 2 引物設(shè)計(jì) 以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，依據(jù)GenBank已公布的豬Nramp1基因mRNA（NM_213821.2）和GAPDH基因mRNA（NM_001206359.1）序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（表1）。

1. 3. 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 對(duì)27頭滇陸豬組織RNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.0 μL，包含2×Super Real PreMix Plus 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA模板（約含100 ng）1.0 μL，ddH2O 4.5 μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)定陰性對(duì)照。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，并繪制熔解曲線。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010計(jì)算目的基因多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度（He）及多態(tài)信息含量（PIC）（表2）;使用2-△△Ct法換算目的基因在各組織中的相對(duì)表達(dá)量，并以SPSS 19.0對(duì)目的基因的組織差異表達(dá)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 滇陸豬Nramp1基因PCR擴(kuò)增及序列分析結(jié)果

以滇陸豬耳組織基因組DNA為模板，用F1/R1特異引物擴(kuò)增滇陸豬Nramp1基因的第5外顯子、第5內(nèi)含子及第6外顯子等序列，擴(kuò)增獲得的基因片段（圖1）與預(yù)期結(jié)果一致，且無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)，測(cè)序結(jié)果顯示目的基因序列長(zhǎng)度為689 bp。

對(duì)27份滇陸豬Nramp1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與GenBank已公布的豬Nramp1基因序列吻合，即確定為豬Nramp1基因序列。經(jīng)SeqMan程序分析發(fā)現(xiàn)有3個(gè)多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)（SNP1、SNP2和SNP3），分別位于第5外顯子（T→C）、第5內(nèi)含子（A→G）和第6外顯子（G→A）上，且這3個(gè)SNPs位點(diǎn)都只存在2種基因型（圖2），即SNP1位點(diǎn)為純合基因型（TT）時(shí)，SNP3位點(diǎn)也為純合基因型（GG）;SNP1位點(diǎn)為雜合基因型（TC）時(shí)，SNP3位點(diǎn)也為雜合基因型（GA）。

2. 2 滇陸豬Nramp1基因SNP位點(diǎn)的遺傳分布情況

由表3可知，滇陸豬Nramp1基因SNP1、SNP2和SNP3等3個(gè)SNP位點(diǎn)在試驗(yàn)豬群體中的優(yōu)勢(shì)基因型分別是TT型（0.78）、AG型（0.56）和GG型（0.78），優(yōu)勢(shì)等位基因型分別是T（0.89）、A（0.72）和G（0.89）。進(jìn)一步計(jì)算各SNPs位點(diǎn)的He和PIC，發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)滇陸豬群體中位于Nramp1基因外顯子區(qū)域的SNP1和SNP3位點(diǎn)屬于低度多態(tài)（PIC/He<0.25），而位于內(nèi)含子區(qū)域的SNP2位點(diǎn)屬于中度多態(tài)（0.25

2. 3 滇陸豬Nramp1基因在各組織中的相對(duì)表達(dá)量

對(duì)提取的所有組織樣品總RNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品的總RNA濃度均在400 ng/μL以上，且OD260/OD280在1.8～2.0，說(shuō)明提取獲得的滇陸豬組織樣品總RNA濃度和完整性均滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。由圖3可看出，目的基因和內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線單一，即這2個(gè)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效果良好，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物生成。

以Nramp1基因在耳缺號(hào)為025的滇陸豬心臟中的平均Ct為對(duì)照，計(jì)算Nramp1基因在滇陸豬各組織中的相對(duì)表達(dá)量。由圖4可知，Nramp1基因在滇陸豬心臟、肝臟、脾臟和肺臟等組織均有表達(dá)，且在各組織間的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異（P<0.05，下同），具體表現(xiàn)為肺臟>肝臟>脾臟>心臟。

2. 4 不同基因型對(duì)Nramp1基因在滇陸豬群體中表達(dá)的影響

由圖5-A可知，在滇陸豬SNP1（或SNP3）位點(diǎn)純合（TT或GG）群體中，Nramp1基因在肺臟中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于在心臟、肝臟和脾臟中的相對(duì)表達(dá)量，在肝臟和脾臟中的相對(duì)表達(dá)量又顯著高于在心臟中的相對(duì)表達(dá)量，但在肝臟和脾臟中的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P>0.05，下同）;在滇陸豬SNP1（或SNP3）位點(diǎn)雜合群體（TC或GA）中，Nramp1基因的相對(duì)表達(dá)量也表現(xiàn)為肺臟>肝臟>脾臟>心臟，與純合群體不同的是Nramp1基因在肝臟中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于在心臟和脾臟中的相對(duì)表達(dá)量，而在心臟和脾臟中的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。由圖5-B可知，在滇陸豬SNP2位點(diǎn)純合群體（AA）中，Nramp1基因在各組織中的表達(dá)規(guī)律與在滇陸豬SNP1（或SNP3）位點(diǎn)純合群體中的表達(dá)趨勢(shì)一致;在滇陸豬SNP2位點(diǎn)雜合群體（AG）中，Nramp1基因在各組織間的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異。

Nramp1基因在不同基因型滇陸豬群體間的組織差異表達(dá)情況如圖6所示。由圖6-A可知，在滇陸豬SNP1（或SNP3）位點(diǎn)各基因型群體間，Nramp1基因在純合群體各組織中的相對(duì)表達(dá)量與在雜合群體各組織中的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著差異。由圖6-B可知，在滇陸豬SNP2位點(diǎn)各基因型群體間，Nramp1基因在純合群體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于在雜合群體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量，但在2個(gè)群體其他3個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著差異。

3 討論

趙生國(guó)等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，在大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克、甘肅黑豬和合作豬Nramp1基因的第2外顯子和第6內(nèi)含子上各存在1個(gè)SNP位點(diǎn)，且這2個(gè)SNPs位點(diǎn)與仔豬腹瀉密切相關(guān)。戴超輝等（2017）研究表明，以大腸桿菌刺激豬腸道上皮細(xì)胞后Nramp1基因表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明Nramp1基因在大腸桿菌侵染機(jī)體的過(guò)程中發(fā)揮重要免疫調(diào)控作用。古少波等（2017）采用PCR-RFLP對(duì)八眉豬和煙臺(tái)豬Nramp1基因第6內(nèi)含子的NdeⅠ酶切位點(diǎn)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該SNP位點(diǎn)存在AB和BB 2種基因型，其中AB基因型是這2個(gè)豬群中的優(yōu)勢(shì)基因型，也是母豬群體腹瀉的易感基因型。羅興等（2017）對(duì)大白仔豬斷奶前的腹瀉進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Nramp1基因第6內(nèi)含子NdeⅠ酶切多態(tài)性位點(diǎn)AA型或AB型個(gè)體腹瀉頻率、腹瀉指數(shù)均顯著高于BB型個(gè)體?？梢?jiàn)，Nramp1基因是與豬疾病免疫相關(guān)的重要候選基因，其多態(tài)性差異導(dǎo)致豬個(gè)體對(duì)疫病的免疫效力不同，可能是Nramp1基因多態(tài)性對(duì)其mRNA表達(dá)有顯著影響所致（夏小慧等，2012）。

本研究對(duì)滇陸豬Nramp1基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在Nramp1基因的第5外顯子、第5內(nèi)含子和第6外顯子上分別檢測(cè)出SNP1（T→C）、SNP2（A→G）和SNP3（G→A）等3個(gè)SNPs位點(diǎn);鄭王山等（2015）對(duì)藏豬、甘肅黑豬、大白豬、約克夏豬和杜洛克豬等5個(gè)豬種的Nramp1基因進(jìn)行全序列測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，在Nramp1基因的第5外顯子檢測(cè)出A→T、C→A和G→A等3個(gè)SNPs位點(diǎn)，第5內(nèi)含子未檢測(cè)出SNP位點(diǎn)，第6外顯子檢測(cè)出1個(gè)SNP位點(diǎn)（G→A），說(shuō)明Nramp1基因多態(tài)性還存在品種差異。本研究對(duì)滇陸豬Nramp1基因的組織差異表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nramp1基因在心臟、肝臟、脾臟和肺臟等組織中均有表達(dá)，與其在豬（Zhang et al.，2000）、藏豬（應(yīng)三成和張義正，2007）、野交雜種豬（陳赫書(shū)和劉娣，2009）和家兔（鄺良德等，2013）中的表達(dá)模式一致;Nramp1基因在滇陸豬各組織間的表達(dá)量均存在顯著差異，具體表現(xiàn)為肺臟>肝臟>脾臟>心臟，但與其在藏豬（應(yīng)三成和張義正，2007）、野交雜種豬（陳赫書(shū)和劉娣，2009）和家兔（鄺良德等，2013）中的組織差異表達(dá)結(jié)果不一致，說(shuō)明Nramp1基因的組織表達(dá)在不同群體或物種中存在一定差異。本研究還分析了Nramp1基因多態(tài)性變異對(duì)其在滇陸豬不同組織中表達(dá)的影響，結(jié)果表明Nramp1基因在滇陸豬不同基因型群體中表現(xiàn)出的組織差異表達(dá)也不同;此外，Nramp1基因在SNP2位點(diǎn)純合群體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于在雜合群體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量，說(shuō)明Nramp1基因SNP位點(diǎn)變異對(duì)Nramp1基因在滇陸豬組織中的表達(dá)有顯著影響。因此，在今后的滇陸豬育種工作中應(yīng)盡量篩選攜帶AG基因型的個(gè)體，以提高豬群體對(duì)疫病的免疫力。

4 結(jié)論

Nramp1基因SNP位點(diǎn)變異能影響Nramp1基因在滇陸豬各組織中的表達(dá)變化，從而影響機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中SNP2位點(diǎn)可作為滇陸豬抗病育種的分子標(biāo)記。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）