羅青，楊玉珍，王國(guó)霞，陳剛

(鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450044)

隨著人們生活水平的提高及消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，食用菌的營(yíng)養(yǎng)和健康價(jià)值逐漸受到人們的關(guān)注，從食用菌出發(fā)進(jìn)行復(fù)合調(diào)味品的研究也逐漸增多[1]。

在諸多食用菌中，金針菇與杏鮑菇是兩種常見(jiàn)且應(yīng)用廣泛的菌類(lèi)。金針菇又名樸菇，隸屬于真菌門(mén)，擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌目，口蘑科，金錢(qián)菌屬。它被稱(chēng)之為智力菇，因其中所含賴(lài)氨酸和精氨酸比較多，分別達(dá)1.024%和1.231%[2]，可以促進(jìn)兒童的智力發(fā)育。杏鮑菇又稱(chēng)刺芹側(cè)耳，其中所含精氨酸和谷氨酸含量很高，同時(shí)，這兩種菌類(lèi)都具有促進(jìn)腸胃消化,降血脂,降低膽固醇,防止心血管疾病,增強(qiáng)機(jī)體免疫能力,抗氧化,抗病毒等藥用功效[3,4]。其中金針菇多糖是金針菇中所含的主要有效生物活性成分，它具有抑制腫瘤、抗癌和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[5]，同樣在杏鮑菇中也含有豐富的多糖類(lèi)物質(zhì)，具有降血糖和非常強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用[6,7]。因此，可以將兩種菌類(lèi)在食品、調(diào)味品等工業(yè)中加以應(yīng)用，如功能型調(diào)味品的開(kāi)發(fā)，會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。

目前食用菌功能型復(fù)合調(diào)味品可利用菌絲體發(fā)酵液做成調(diào)味汁[8]，但大多采用的都是單一食用菌，如香菇醬油、草菇老抽等[9]，而將兩種或兩種以上的食用菌用于調(diào)味品的發(fā)酵生產(chǎn)還很少見(jiàn)[10]?；旌习l(fā)酵是指采用兩種或多種微生物在協(xié)同作用下共同完成某發(fā)酵過(guò)程。目前在食用菌方面進(jìn)行混合發(fā)酵的研究還較少，其中苗敬芝等[11]曾研究過(guò)靈芝和金針菇混合發(fā)酵-蘆薈復(fù)合保健飲料，結(jié)果表明，保健飲料口感好，營(yíng)養(yǎng)也比較全面，遠(yuǎn)高于純種發(fā)酵。食用菌的混合發(fā)酵也將會(huì)加大應(yīng)用研究[12]。本課題試驗(yàn)將對(duì)金針菇和杏鮑菇這兩種大型真菌的菌絲體進(jìn)行混合發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化混合發(fā)酵的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，并對(duì)兩者混合發(fā)酵液多糖產(chǎn)生情況進(jìn)行探究，可為金針菇和杏鮑菇功能型復(fù)合調(diào)味品產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌種

杏鮑菇母種；金針菇母種，生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

馬鈴薯(超市購(gòu)買(mǎi))；葡萄糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖、果糖(均為分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、黃豆粉、酵母粉(均為生化試劑)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaNO3、NH4NO3、Na2SO4、MgSO4、K2SO4、FeSO4、CuSO4、KH2PO4(均為分析純)：天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司；蒽酮、80%硫酸(均為分析純)：上海展云化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)：去皮馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；瓊脂20 g；自來(lái)水1000 mL；pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g；碳源20 g；氮源20 g；KH2PO42 g；無(wú)機(jī)鹽1 g；清水10000 mL；pH自然。

所有培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌，121 ℃，20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DRP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 常州市賽維思環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺(tái) 蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司；TS-100B恒溫?fù)u床 上海安競(jìng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金針菇、杏鮑菇菌種活化

將金針菇和杏鮑菇的試管菌種挑取1環(huán)接種到新鮮的PDA平板培養(yǎng)基上，于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，待菌絲長(zhǎng)出備用。

1.3.2 菌絲體量的測(cè)定

將發(fā)酵液用濾紙過(guò)濾留菌絲體于濾紙上，自然晾干菌絲團(tuán)明水后于電子天平上稱(chēng)重。

1.3.3 單因素試驗(yàn)——混合發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中保持其他成分不變，分別加入葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉5種不同的碳源[13]，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作，用鑷子各取1 cm正方形大小的杏鮑菇和金針菇菌絲塊接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，再做兩組各自單獨(dú)接入金針菇和杏鮑菇菌絲塊作為對(duì)照。每組3個(gè)重復(fù)。放置到110 r/min搖床于26 ℃培養(yǎng)，每隔7 d進(jìn)行菌絲重量測(cè)量，培養(yǎng)21 d后對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行多糖含量測(cè)定。根據(jù)菌絲量變化和多糖含量變化確定最佳碳源。

1.3.4 單因素試驗(yàn)——混合發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

在確定最適碳源營(yíng)養(yǎng)后，發(fā)酵液中其他成分不變，將培養(yǎng)基中的氮源分別添加蛋白胨、NaNO3、NH4NO3、黃豆粉、酵母粉10 g[14]，同1.3.3法接種培養(yǎng)和測(cè)定，篩選出金針菇杏鮑菇混合發(fā)酵的最佳氮源。

1.3.5 單因素試驗(yàn)——混合發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化

同1.3.3方法培養(yǎng)分別添加NaSO4、MgSO4、K2SO4、FeSO4、CuSO4作為無(wú)機(jī)鹽參考，篩選出金針菇杏鮑菇混合發(fā)酵的最佳無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)。

1.3.6 單因素試驗(yàn)——混合發(fā)酵條件溫度的優(yōu)化

將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定在20,22,24,26,28 ℃，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)量和多糖濃度，篩選出金針菇杏鮑菇混合發(fā)酵的最佳溫度。

1.3.7 單因素試驗(yàn)——混合發(fā)酵條件轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

將金針菇杏鮑菇發(fā)酵液培養(yǎng)轉(zhuǎn)速設(shè)置為70,90,110,130,150 r/min 5個(gè)梯度進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)量和多糖濃度，篩選出金針菇杏鮑菇混合發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速。

1.3.8 多糖濃度測(cè)定

分別取0.1 g/L的葡萄糖溶液0.01,0.02,0.03,0.04,0.06,0.08,0.1,0.12 mL用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，分別加入6 mL蒽酮試劑，每個(gè)試管加完之后一起浸入沸水浴中，試管口加上蓋子以防止蒸發(fā)。沸水浴15 min取出，用自來(lái)水冷卻，于620 nm比色。以同樣處理的重蒸餾水為空白，進(jìn)行比色，以糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=5.7433x+0.0097,R2=0.9956，見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

取樣品1 mL，加入6 mL蒽酮試劑，同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，比色測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算含量。

1.3.9 正交試驗(yàn)

將單因素試驗(yàn)所得的最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，采用三因素三水平進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同碳源對(duì)混合菌絲的生長(zhǎng)影響

(a)蔗糖

(b)果糖

(c)麥芽糖

(d)葡萄糖

(e)淀粉

(f)碳源

由圖2可知，不同碳源對(duì)混合發(fā)酵及單獨(dú)菌液發(fā)酵的影響中，麥芽糖、蔗糖為碳源時(shí)對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響最大，菌絲重量增加最顯著，21 d培養(yǎng)菌絲重量達(dá)到(7.32±0.39) g，綜合其影響的顯著性,各碳源的影響排列順序?yàn)辂溠刻?蔗糖>果糖>葡萄糖>淀粉，而且數(shù)據(jù)明顯表明混合發(fā)酵的菌絲增加量要比純種發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)增加量高。

2.1.2 不同氮源對(duì)混合菌絲生長(zhǎng)的影響

(a)黃豆粉

(b)蛋白胨

(c)酵母粉

(d)NH4NO3

(e)NaNO3

(f)氮源

由圖3可知，不同氮源對(duì)混合發(fā)酵和純種發(fā)酵的影響皆有不同，混合發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)的比較快，其中蛋白胨對(duì)菌絲的生長(zhǎng)速率影響最大，21 d培養(yǎng)菌絲重量達(dá)(6.31±0.25) g，以蛋白胨為氮源時(shí)混合發(fā)酵的菌絲重量增加最大，其次是黃豆粉和NH4NO3，兩者差別不太大。綜合各種氮源的影響排列順序?yàn)榈鞍纂?黃豆粉>NH4NO3>酵母粉>NaNO3。

2.1.3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)混合菌絲生長(zhǎng)的影響

(a)FeSO4

(b)CuSO4

(c)K2SO4

(d)Na2SO4

(e)MgSO4

(f)無(wú)機(jī)鹽

由圖4可知，不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)混合發(fā)酵和純種發(fā)酵的影響也各有不同，同樣是混合發(fā)酵的菌絲生長(zhǎng)量要比純種發(fā)酵快，其中FeSO4對(duì)菌絲的生長(zhǎng)速率影響最大，21 d培養(yǎng)菌絲重量達(dá)(7.32±0.05)g，各種無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲的生長(zhǎng)影響的主次順序?yàn)镕eSO4>K2SO4>CuSO4>MgSO4>Na2SO4。

2.1.4 溫度對(duì)混合發(fā)酵液的影響

(a)20 ℃

(b)22 ℃

(c)24 ℃

(d)26 ℃

(e)28 ℃

(f)溫度

由圖5可知，不同溫度對(duì)混合發(fā)酵的影響要比純種發(fā)酵的影響大，其中在26 ℃時(shí)菌絲的生長(zhǎng)最快，21 d培養(yǎng)菌絲重量達(dá)(5.88±0.32) g，兩邊均呈下降趨勢(shì)，分析其原因發(fā)現(xiàn)低溫條件下菌絲生長(zhǎng)緩慢，而溫度過(guò)高也會(huì)抑制菌絲的生長(zhǎng)[16]。

2.1.5 轉(zhuǎn)速對(duì)混合發(fā)酵液的影響

(a)70 r/min

(b)90 r/min

(c)110 r/min

(d)130 r/min

(e)150 r/min

(f)轉(zhuǎn)速

由圖6可知，不同轉(zhuǎn)速對(duì)混合發(fā)酵種菌絲生長(zhǎng)的影響也要比純種發(fā)酵的影響大，其中轉(zhuǎn)速為110 r/min時(shí)菌絲的生長(zhǎng)速率最大，21 d培養(yǎng)菌絲重量達(dá)(6.11±0.17) g。在搖床過(guò)程中高轉(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致菌絲過(guò)密[17]，且容易污染，相反，低轉(zhuǎn)速又會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳導(dǎo)和溶氧量，不利于混合菌絲的生長(zhǎng)[18]。

2.2 多糖濃度測(cè)定結(jié)果

(a) 不同碳源發(fā)酵液的多糖濃度

(b) 不同氮源發(fā)酵液的多糖濃度

(c) 不同無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵液的多糖濃度

(d) 不同溫度發(fā)酵液的多糖濃度

(e) 不同轉(zhuǎn)速發(fā)酵液的多糖濃度

由圖7可知，金針菇和杏鮑菇混合發(fā)酵液的多糖濃度大部分是高于其純種發(fā)酵液含量的，由圖7各條件下多糖的濃度可以看出菌絲的最高生長(zhǎng)量與多糖最大濃度并不統(tǒng)一，如果以多糖濃度為參考指標(biāo)，發(fā)酵液產(chǎn)出多糖濃度最高的條件為：碳源為果糖時(shí)多糖濃度最高為(3.08±0.03)%，氮源為蛋白胨時(shí)多糖濃度最高為(3.21±0.02)%，無(wú)機(jī)鹽為MgSO4時(shí)多糖濃度最高為(3.39±0.09)%，溫度為26 ℃時(shí)多糖濃度最高為(3.39±0.01)%，轉(zhuǎn)速為130 r/min時(shí)多糖濃度最高為(3.39±0.03)%。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment %

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可知不同碳源比例對(duì)混合發(fā)酵中菌絲的生長(zhǎng)有很大的影響，根據(jù)極差分析結(jié)果得出，碳源在整個(gè)實(shí)驗(yàn)因素中影響最大，其次為氮源，最后是無(wú)機(jī)鹽，碳源和氮源很接近。比較K值可得出最佳配方A2B2C2，即碳源果糖含量為2%、氮源蛋白胨含量為2%、無(wú)機(jī)鹽MgSO4含量為0.5%。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)不同碳源、氮源、溫度、轉(zhuǎn)速、無(wú)機(jī)鹽的篩選，得到金針菇與杏鮑菇混合發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)量最高的條件：麥芽糖為碳源，蛋白胨為氮源，無(wú)機(jī)鹽為FeSO4，溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為110 r/min。金針菇與杏鮑菇混合發(fā)酵多糖含量最高的發(fā)酵條件：果糖為碳源，蛋白胨為氮源，無(wú)機(jī)鹽為MgSO4，溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min。本研究表明混合發(fā)酵生長(zhǎng)效果要比純種發(fā)酵生長(zhǎng)速度快多，發(fā)酵液多糖含量混合菌也要高于純種發(fā)酵的多糖含量。

本試驗(yàn)利用金針菇和杏鮑菇混合液體發(fā)酵培養(yǎng)的互利協(xié)同作用，很大地提高了金針菇和杏鮑菇單一發(fā)酵的生產(chǎn)價(jià)值，可以在食用菌復(fù)合調(diào)味品的研究中進(jìn)行應(yīng)用，其中多糖含量的增加可以進(jìn)一步提高調(diào)味品的保健功能[19]，而發(fā)酵速度的增加可以縮短調(diào)味品生產(chǎn)發(fā)酵周期。該試驗(yàn)研究為今后食用菌相關(guān)食品、調(diào)味品工業(yè)等方面的開(kāi)發(fā)利用提供了新的技術(shù)支持。