洪軍，李文玉，衛(wèi)夏怡，吉冰潔，王少霞，毛銳

(河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院 河南省水體污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 平頂山 467036)

隨著人們生活水平的不斷提高和安全營養(yǎng)食品的興起，人們越來越強(qiáng)調(diào)食品的純天然性和安全性。但肉類食品和調(diào)味品的防腐保鮮方面大多還是以添加化學(xué)防腐保鮮劑為主[1]，因此，尋求綠色、天然、安全的食品防腐保鮮劑以減少食源性致病菌的污染顯得尤為重要。作為生物源的食品防腐保鮮劑和調(diào)味品主要來源于微生物和動(dòng)植物的天然產(chǎn)物，如Nisin、殼聚糖、迷迭香提取物、香辛料提取物等[2,3]。

迷迭香是一種重要的唇形科香草植物，主要含有鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚等活性物質(zhì)。因具有較強(qiáng)的抗氧化和抗菌特性，迷迭香及其提取物被廣泛地應(yīng)用于肉制品、果蔬、水產(chǎn)品等食品防腐保鮮領(lǐng)域以及功能性食品和調(diào)味品中等[4]。石榴皮作為一種中藥材，其活性物質(zhì)主要包括多酚、黃酮、生物堿等[5]，石榴皮提取物具有很好的抗氧化、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化和廣譜的抗菌功效，可用于水果、植物油、肉類和調(diào)味品醬油等中起到防腐保鮮作用[6-8]。Zhuang等研究表明，石榴皮提取物能延緩感官品質(zhì)和肉色的惡化，抑制腐敗菌的生長，并能降低TVB-N的含量和ATP相關(guān)化合物的降解，使魚片的貨架期延長2 d左右，有望成為一種有前景的水產(chǎn)品防腐劑。賁浩使用石榴皮單寧、柚皮苷、大蒜素等復(fù)合保鮮劑作用于冷卻雞肉將其保鮮期延長至4 d[9]。覃宇悅等研究表明殼聚糖-石榴皮提取物復(fù)合膜是一種兼具抗菌和抗氧化效果的保鮮膜，能有效延長豬肉餅的保質(zhì)期，較單一組合效果好，并能改善豬肉餅的品質(zhì)[10]。

這些包含石榴皮的保鮮劑作用于冷卻肉中保質(zhì)期較短，有些制備工藝較復(fù)雜，為了更好發(fā)揮其防腐保鮮作用，本研究擬通過石榴皮醇提物對5種食源性致病菌的抑菌作用進(jìn)行分析，選擇適宜濃度進(jìn)行單一或與其他生物源天然保鮮劑復(fù)合作用于冷卻雞肉，觀察其保鮮效果，為石榴皮復(fù)合保鮮劑的應(yīng)用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

供試藥物：石榴皮，購于平頂山市新城區(qū)國大藥房中藥材店；脂溶性迷迭香提取物、殼聚糖、Nisin，購于試劑公司。

供試菌種：腸炎沙門氏菌腸炎亞種ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115、李斯特氏菌、大腸桿菌ATCC25922、副溶血性弧菌ATCC17802，河南城建學(xué)院生科院課題組保存。

主要儀器：高速粉碎機(jī)、超聲波清洗儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)凱氏定氮儀、紫外分光光度計(jì)、pH計(jì)等。

1.2 石榴皮的提取及抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.1 石榴皮提取物制備

超聲輔助醇提物制備：將石榴皮烘干，用高速粉碎機(jī)粉碎并過60目篩，稱取適量藥粉，按1∶25的料液比加入60%的食用乙醇，在200 W、50 ℃條件下超聲1 h，重復(fù)2～3次，然后真空抽濾，收集濾液[11,12]。

超聲輔助水提物制備：稱取適量藥粉，按1∶25的料液比加入蒸餾水，在200 W、70 ℃條件下超聲1 h, 然后將提取液用真空抽濾除去藥渣，并收集濾液。

在pH 2、溫度35 ℃條件下，用2%～3%活性炭脫色35 min，將過濾后的提取液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 g/mL。使用前在200 W、40 ℃條件下超聲除菌30 min，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩４藵舛扔?jì)算方法為石榴皮質(zhì)量/濃縮液體積。

1.2.2 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

分別取100 μL活化好的食源性致病菌(腸炎沙門氏菌腸炎亞種ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115、李斯特氏菌、大腸桿菌ATCC25922以及副溶血性弧菌ATCC17802)稀釋至菌液濃度為107CFU/mL進(jìn)行涂布。然后用打孔器在標(biāo)記的位置進(jìn)行打孔，在孔內(nèi)加入制備好的80 μL藥液(石榴皮單一提取物或與其他食品添加劑復(fù)合物)，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h，每組設(shè)3個(gè)平行，測定抑菌圈的直徑。抑菌圈直徑=測量所得直徑-打孔器直徑(8 mm)。

1.3 石榴皮提取物對冷卻雞肉保鮮測定

1.3.1 保鮮劑組成及制備方法

第一組：0.025 g/dL Nisin+1 g/dL殼聚糖(溶解于1%的醋酸溶液中)+0.03 g/dL迷迭香提取物+0.25 g/mL石榴皮粗提物；配制方法：取1 g/mL石榴皮提取物25 mL，依次加入0.03 g脂溶性迷迭香提取物干粉、0.025 g Nisin，攪拌均勻后，再加入用1%醋酸完全溶解的殼聚糖溶液，余量用無菌水補(bǔ)充即制備成復(fù)合保鮮劑。用前在200 W、40 ℃條件下超聲除菌30 min。

第二組：0.25 g/mL石榴皮粗提物；對照組：無菌水。

1.3.2 肉樣處理方法及指標(biāo)測定

取新鮮雞胸脯肉在6～8 h內(nèi)將雞肉中心溫度冷卻至4 ℃，將配制好的復(fù)合保鮮劑均勻涂抹于肉樣表面，超凈工作臺(tái)紫外照射30 min，用無菌紗布吸干多余的水分，然后用無菌真空包裝袋進(jìn)行包裝，于4 ℃冰箱保存。每組設(shè)3個(gè)平行，分別在第0，2，4，6，8，10，12，14，16，18天取樣進(jìn)行感官評定、TVB-N、TBARS、pH值、微生物總數(shù)測定。感官評定參照GB 2707-2016進(jìn)行，評價(jià)表見表1；TVB-N的測定參照GB 5009.228-2016進(jìn)行；TBARS的測定參考范碧琴[13]的方法進(jìn)行；pH值的測定參考Wulf等[14]的方法進(jìn)行，參考標(biāo)準(zhǔn)：新鮮肉pH 5.8～6.2，次鮮肉pH 6.3～6.6，變質(zhì)肉pH>6.7；微生物指標(biāo)的測定參照GB 4789.2-2016進(jìn)行。

表1 感官評定表Table 1 Sensory evaluation

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出，結(jié)果由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 石榴皮水提物對5種食源性致病菌的抑菌圈大小Table 2 Inhibition zone size of water extracts from pomegranate peel on five food-borne pathogenic bacteria

表3 石榴皮醇提取物對5種食源性致病菌的抑菌圈大小Table 3 Inhibitory zone size of alcohol extracts from pomegranate peel against five food-borne pathogenic bacteria

由表2和表3可知，1 g/mL濃度的石榴皮水提物對5種食源性致病菌均有抑菌作用，但較同濃度的醇提物效果差，此結(jié)果表明不同提取方法對抑菌作用不同，可能是提取物中所含的主要成分有差別引起的。石榴皮醇提物除了對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為0.5 g/mL外，其余4種菌的MIC為0.25 g/mL。此結(jié)果與熊素英等通過不同方法獲得的石榴皮水、醇提取液對細(xì)菌、酵母、霉菌均有抑菌效果,對細(xì)菌的抑制效果最好，醇提物抑菌效果優(yōu)于水提物，最低抑菌濃度為50%相一致[15]。為了達(dá)到更好的保鮮效果，將石榴皮醇提物分別與迷迭香、殼聚糖、Nisin進(jìn)行復(fù)合，觀察其抑菌活性，結(jié)果表明石榴皮醇提物能與其他3種物質(zhì)進(jìn)行混合，無明顯拮抗作用，且有一定的疊加協(xié)同效果，見表4。

表4 石榴皮提取物與其他天然保鮮劑復(fù)合后對5種食源性致病菌的抑菌圈大小Table 4 Inhibition zone size of pomegranate peel extractscombined with other natural preservatives on fivefood-borne pathogenic bacteria

續(xù) 表

2.2 不同提取物對冷卻雞肉保鮮效果

2.2.1 不同處理組對雞肉冷藏期間TVB-N值的影響

TVB-N(揮發(fā)性鹽基氮)指動(dòng)物性食品由于酶和細(xì)菌的作用，在肉類腐敗過程中，使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)，TVB-N含量是衡量肉類腐敗變質(zhì)的重要指標(biāo)之一，表明TVB-N含量越高，肉類新鮮度越低。

圖1 不同處理組對雞肉冷藏期間TVB-N值的影響Fig.1 Influence of different treatment groups on TVB-N values of chicken during refrigerated storage

由圖1可知，隨著冷藏時(shí)間的延長，各組數(shù)值也在逐漸增大，在第8天對照組的TVB-N值已經(jīng)超過國家規(guī)定的鮮肉標(biāo)準(zhǔn)(15 mg/100 g)，第二組(單一石榴皮粗提物)則在第12天時(shí)已經(jīng)超過鮮肉標(biāo)準(zhǔn)，第一組在第18天時(shí)仍小于15 mg/100 g，表明第一組對于TVB-N數(shù)值的增長有良好的抑制作用。此結(jié)果表明，含石榴皮粗提物復(fù)合組的保鮮效果較單一石榴皮粗提物好。

2.2.2 不同處理組對雞肉冷藏期間TBARS值的影響

圖2 不同處理組對雞肉冷藏期間TBARS值的影響Fig.2 Influence of different treatment groups on TBARS values of chicken during refrigerated storage

由圖2可知，隨著時(shí)間的延長，各組的肉樣均發(fā)生了不同程度的脂肪氧化，對照組的TBARS值增長最為明顯，第6天時(shí)對照組值為0.603 mg/100 g，超過了鮮肉標(biāo)準(zhǔn)0.5 mg/100 g，而第一組的TBARS值僅為0.3 mg/100 g，直至第16天超過鮮肉標(biāo)準(zhǔn)；第二組在第8天時(shí)為0.504 mg/100 g，超過鮮肉標(biāo)準(zhǔn)。此結(jié)果表明，0.25 g/mL石榴皮提取物具有一定的抗脂肪氧化能力，較對照組延長2 d以上，但是與其他添加劑配合效果更佳，可延長10 d左右。

2.2.3 不同處理組對雞肉冷藏期間pH值的影響

圖3 不同處理組對雞肉冷藏期間pH值的影響Fig.3 Influence of different treatment groups on pH values of chicken during refrigerated storage

由圖3可知，在雞肉冷藏初期，各組的pH值均有一定下降，對照組從第4天開始上升，各處理組均從第6天開始上升，對照組的數(shù)值明顯大于各處理組，在第8天時(shí)超出一級鮮肉標(biāo)準(zhǔn)(5.8～6.2)，由于存在殼聚糖溶解在1%醋酸的保鮮劑配方可能會(huì)對pH值產(chǎn)生一定的影響，第一組的pH值相對各組一直較低，在第12天時(shí)開始呈下降趨勢。這可能是因?yàn)殡u肉在貯藏初期，大量的乳酸和磷酸的酸性物質(zhì)的產(chǎn)生導(dǎo)致pH值下降。而隨著貯藏時(shí)間的増長，由蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的多肽及氨基酸的增多導(dǎo)致pH值上升，上升程度代表著肉類的變質(zhì)程度。此結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組均較對照組效果好，但石榴皮復(fù)合保鮮劑效果更佳。

2.2.4 不同處理組對雞肉冷藏期間菌落總數(shù)的影響

圖4 不同處理組對雞肉冷藏期間菌落總數(shù)的影響Fig.4 Influence of different treatment groups on total number of bacterial colony of chicken during refrigerated storage

由圖4可知，在雞肉冷藏期間，菌落總數(shù)一直呈持續(xù)增長狀態(tài)，對照組的數(shù)據(jù)增長趨勢明顯大于處理組，第8天對照組的菌落總數(shù)為1.9×106CFU/g，已超過鮮肉菌落總數(shù)的判定標(biāo)準(zhǔn)(106CFU/g)，第二組在第10天時(shí)超過了判定標(biāo)準(zhǔn)，而第一組的菌落總數(shù)相對較小，可知石榴皮復(fù)合保鮮劑相對單一石榴皮保鮮劑在肉樣上的抑菌效果更好。分析原因可能是石榴皮中的多酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)等抑制了部分細(xì)菌的生長，但是與Nisin、殼聚糖和迷迭香復(fù)合后，充分發(fā)揮了4種成分間協(xié)同增效的作用，更好抑制了微生物的生長，也抑制了蛋白質(zhì)的分解速度，此結(jié)果也與TVB-N含量、感官評定的結(jié)果相吻合。

2.2.5 冷卻雞肉貯藏期間感官評定結(jié)果

隨著肉類放置時(shí)間的延長，肉類在腐敗變質(zhì)時(shí)，因其組織成分的分解，使肉在色澤、氣味、彈性、粘度方面發(fā)生異常，感官質(zhì)量明顯下降。因感官指標(biāo)的變化要早于理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)，因此感官指標(biāo)的變化狀況可以作為肉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要依據(jù)。

表5 冷卻雞肉貯藏期間感官評定結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of chicken during refrigerated storage

由表5可知，在各組的感官評定結(jié)果中，第一組綜合評定結(jié)果要優(yōu)于其余各組，其次是單一石榴皮(第二組)。但因石榴皮提取物中含有一定的顏色，目前脫色效果不夠理想，對肉的色澤稍微有影響，但復(fù)合保鮮劑第一組在氣味、彈性方面明顯優(yōu)于對照組。第8天時(shí)對照組已經(jīng)出現(xiàn)明顯的腐敗臭味，肉色暗紅，表面粘手，肉色彈性很差；隨著保存時(shí)間的延長，第二組的各項(xiàng)感官評定結(jié)果也逐漸下降，由此可知在各處理組中第一組的保鮮效果較好。

3 結(jié)論

由體外抑菌實(shí)驗(yàn)可知，石榴皮粗提物單一或復(fù)合物均對5種食源性致病菌的抑菌效果較好，且與其他生物源食品添加劑具有一定的協(xié)同作用。石榴皮復(fù)合物對冷卻雞肉的保鮮效果明顯優(yōu)于對照組和單一石榴皮提取物，可將保鮮期延長10～12 d，0.25 g/mL石榴皮粗提物組將保鮮期延長4～5 d。此天然復(fù)合保鮮劑充分利用了各天然防腐保鮮劑的抑菌性、抗氧化性和成膜性，充分發(fā)揮了保鮮劑之間的協(xié)同增效作用，不僅可以增強(qiáng)其保鮮效果，而且具有調(diào)味增香、營養(yǎng)保健功能，延長了產(chǎn)品貨架期，從而減少其對冷卻肉品質(zhì)的影響，提高其應(yīng)用的安全性。根據(jù)此復(fù)合配方的功能，也可應(yīng)用于調(diào)味品的防腐保鮮。