胡秀虹，黃意，湯承浩，韋國(guó)蘭，王翔,2*

(1.凱里學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011；2.黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心，貴州 凱里 556011)

微生物的生長(zhǎng)繁殖是導(dǎo)致袋裝腌制蔬菜腐敗變質(zhì)的主要原因[1-3]，故在生產(chǎn)中采取一種有效的微生物控制措施至關(guān)重要。目前，可用于食品生產(chǎn)中微生物控制的方法主要有添加防腐保鮮劑、微波殺菌、輻照滅菌、包裝保鮮、熱力殺菌、超高壓技術(shù)、冷藏保鮮等[4-9]。不過(guò)，有些方法如熱力殺菌、微波殺菌、高壓滅菌等盡管能延長(zhǎng)蔬菜的貨架期，但經(jīng)處理后也會(huì)導(dǎo)致有些蔬菜制品的品質(zhì)如風(fēng)味、色澤及脆硬度變差。輻照滅菌技術(shù)主要是通過(guò)輻照誘變微生物，擾亂其代謝及酶反應(yīng)，最終導(dǎo)致微生物死亡，但輻照設(shè)備昂貴，使其在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中受到了極大的限制。食品防腐劑是一類能抑制微生物生長(zhǎng)繁殖，防止食品腐敗變質(zhì)，從而延長(zhǎng)食品保質(zhì)期的添加劑，因其抑菌效果好、廉價(jià)、易得且使用簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，目前仍是許多食品廠家的首選[10-13]。

近年來(lái)，復(fù)配型防腐劑成為現(xiàn)代食品工業(yè)研究的熱點(diǎn)課題。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合防腐劑不僅能減少防腐劑的用量，還能增強(qiáng)抑菌效果[14，15]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，姜紹通等對(duì)復(fù)合防腐劑在腌制蔬菜中腐敗細(xì)菌的抑制效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，乳酸鏈球菌素、脫氫醋酸鈉、尼泊金復(fù)合酯鈉進(jìn)行復(fù)配后對(duì)腌制蔬菜中的腐敗菌有較顯著的抑制作用。孫磊以腌制蔬菜的保鮮、保質(zhì)為目的，將3種防腐劑EDTA、苯甲酸鈉和脫氫乙酸鈉進(jìn)行復(fù)配，結(jié)果表明，添加復(fù)合防腐劑的腌制蔬菜在維持理化性質(zhì)的穩(wěn)定性和良好的衛(wèi)生方面效果最佳。王征征等[16]以腌制大頭菜中篩選得到的7種致腐菌為研究對(duì)象，考察了苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、山梨酸鉀、亞硫酸鈉、EDTA的抑制作用，并探討了防腐劑復(fù)配對(duì)大頭菜中致腐菌的抑制效果，結(jié)果表明，苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉對(duì)大頭菜中致腐菌有明顯的抑制作用，且復(fù)配后抑制效果更佳。

目前，關(guān)于腌制蔬菜的防腐保鮮研究還較少，腌制韭菜根的防腐鮮有報(bào)道。此外，據(jù)相關(guān)報(bào)道不難發(fā)現(xiàn)，不同防腐劑對(duì)同一種腐敗菌的抑制效果有明顯差異，同一種防腐劑對(duì)不同種屬腐敗菌的抑菌效果也存在明顯差異。故本研究在前人的基礎(chǔ)上以腐敗腌制韭菜根中分離篩選到的腐敗菌為研究對(duì)象，考察EDTA、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉的抑制效果，并進(jìn)行了防腐劑復(fù)配及應(yīng)用研究，旨在得到一種高效的復(fù)合防腐劑，為腌制韭菜根生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

低糖腌制韭菜根：貴州省黔東南州麻江縣某有限公司；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、苯甲酸鈉、焦亞硫酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉：食品級(jí)，南通奧凱生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；從脹袋韭菜根中分離篩選的5株腐敗細(xì)菌：巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、萵苣不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlactucae)、解淀粉芽孢桿菌(Paenibacillusamylolyticus)、土楊芽孢桿菌(Bacillustoyonensis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)，凱里學(xué)院黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；肉湯培養(yǎng)基(加入20 g瓊脂為固態(tài))，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-CZ11D恒溫?fù)u床培養(yǎng)振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器有限公司；BIO-BRI酶標(biāo)儀 成都百樂(lè)科技有限公司；LOZX-50KBS立式蒸汽壓力滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái) 上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱、BGZ-246電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 單一防腐劑對(duì)韭菜根中腐敗菌的抑制作用

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[17]，4種防腐劑的最大添加量見(jiàn)表1。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，防腐劑的名稱及實(shí)際添加量見(jiàn)表2。按表2的防腐劑添加濃度將各防腐劑添加到肉湯培養(yǎng)基中，分別接種對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的腐敗菌，使其菌液初始濃度為500 CFU/mL，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)12 h測(cè)定腐敗菌的生長(zhǎng)情況。另外，以不加防腐劑不接種的肉湯培養(yǎng)基為空白組，以不加防腐劑但接種的為對(duì)照組。

表1 防腐劑的最大使用濃度Table 1 The maximum use concentration of preservatives g/kg

表2 防腐劑的添加質(zhì)量濃度Table 2 The additive mass concentration of preservatives g/kg

1.4 復(fù)合防腐劑對(duì)韭菜根中腐敗菌的抑制作用

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)腐敗菌有良好抑制作用的防腐劑質(zhì)量濃度進(jìn)行復(fù)配，進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)采用正交表L4(23)，因素及水平見(jiàn)表3。

表3 復(fù)合防腐劑正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal test for compound preservatives g/kg

1.5 應(yīng)用試驗(yàn)

將優(yōu)化后的復(fù)合防腐劑，按照配方要求加入腌制韭菜根中，包裝后于紫外燈下滅菌20 min。以不加防腐劑的腌制韭菜根為對(duì)照，將其置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 測(cè)定其細(xì)菌總數(shù)。細(xì)菌總數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行，以lg(CFU/g)表示[18]。同時(shí)進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)，感官質(zhì)量評(píng)價(jià)：參照GB 2714—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 醬腌菜》，分別從腌制韭菜根的組織結(jié)構(gòu)、色澤、風(fēng)味等方面對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組樣品進(jìn)行評(píng)分[19]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表4。

表4 腌制韭菜根產(chǎn)品在貯藏期間的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Sensory evaluation standard of pickled leek roots products during storage

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

腐敗菌生長(zhǎng)的測(cè)定采用比濁法，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的OD600值。用腐敗菌的抑制率評(píng)價(jià)防腐劑的抑制效果：根據(jù)OD600值，計(jì)算抑制率，并利用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，SPSS 25進(jìn)行方差分析。將抑制率轉(zhuǎn)化為概率值，利用Excel 2010計(jì)算出各防腐劑的IC50值。抑菌率的計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單一防腐劑對(duì)腐敗菌的抑菌效果

2.1.1 苯甲酸鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果

苯甲酸鈉對(duì)5種腐敗菌的抑菌率見(jiàn)圖1。

由圖1可知，苯甲酸鈉在低濃度下對(duì)5種腐敗菌具有普遍較好的抑制效果。當(dāng)苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為0.2 g/kg時(shí)，對(duì)Bacilluscereus，Bacillusmegaterium，Acinetobacterlactucae，Paenibacillusamylolyticus和Bacillustoyonensis的抑制率分別為81.34%、70.15%、79.39%、66.26%和64.03%。隨著苯甲酸鈉質(zhì)量濃度的繼續(xù)上升，抑制率增長(zhǎng)緩慢。顯然，苯甲酸鈉可單獨(dú)使用，也可考慮與其他防腐劑復(fù)合使用。

圖1 苯甲酸鈉對(duì)腐敗菌的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of sodium benzoate on putrefactive bacteria

2.1.2 山梨酸鉀對(duì)腐敗菌的抑制效果

山梨酸鉀對(duì)5種腐敗菌的抑制率見(jiàn)圖 2。

圖2 山梨酸鉀對(duì)腐敗菌的抑菌效果Fig.2 Bacteriostatic effect of potassium sorbate on putrefactive bacteria

由圖 2可知，山梨酸鉀對(duì)Bacilluscereus，Acinetobacterlactucae，Paenibacillusamylolyticus具有良好的抑制效果，當(dāng)山梨酸鉀質(zhì)量濃度為0.3 g/kg時(shí)，該3種菌的抑菌率均可達(dá)到89%。但山梨酸鉀對(duì)Bacillusmegaterium，Bacillustoyonensis的抑制率相對(duì)較差，當(dāng)苯甲酸納的質(zhì)量濃度升至0.5 g/kg時(shí)抑菌率才能達(dá)到70%。故在食品防腐中建議與其他防腐劑進(jìn)一步復(fù)配。

2.1.3 脫氫乙酸鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果

脫氫乙酸鈉對(duì)5種腐敗菌的抑制率見(jiàn)圖3。

圖3 脫氫乙酸鈉對(duì)腐敗菌的抑菌效果Fig.3 Bacteriostatic effect of sodium dehydroacetate on putrefactive bacteria

由圖3可知，脫氫乙酸鈉對(duì)Bacillustoyonensis，Acinetobacterlactucae的抑制效果最好，最高可達(dá)91.23%和93.52%；其次是Bacilluscereus，可高達(dá)80.7%；對(duì)Bacillusmegaterium，Paenibacillusamylolyticus的生長(zhǎng)抑制較弱，高濃度(0.5 g/kg)下抑制率分別為64.00%和70.85%。綜上分析，不建議單獨(dú)使用脫氫乙酸鈉，但可考慮與其他防腐劑復(fù)合使用。

2.1.4 EDTA對(duì)腐敗菌的抑制效果

EDTA對(duì)5種腐敗菌的抑菌率見(jiàn)圖4。

圖4 EDTA對(duì)腐敗菌的抑菌效果Fig.4 Bacteriostatic effect of EDTA on putrefactive bacteria

由圖4可知，EDTA對(duì)5種腐敗菌的抑制效果均不是很理想。當(dāng)EDTA的質(zhì)量濃度為0.25 g/kg時(shí)，對(duì)Bacilluscereus，Bacillusmegaterium，Acinetobacterlactucae，Paenibacillusamylolyticus和Bacillustoyonensis的抑菌率趨于最大，分別為86.98%、70.29%、83.58%、57.24%、54.92%。由此可知，EDTA無(wú)論是作為單一防腐劑還是復(fù)合防腐劑成分都不是最好的選擇。

2.1.5 防腐劑對(duì)腐敗菌的抑制中濃度

將抑菌率轉(zhuǎn)化為概率值，算出抑制中濃度(IC50)，見(jiàn)表5。

表5 防腐劑對(duì)腐敗菌的抑制中濃度(IC50)Table 5 Medium concentration (IC50) of inhibition ofpreservatives on putrefactive bacteria

由表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同防腐劑對(duì)5種腐敗菌的抑制效果明顯不同。分析數(shù)據(jù)可知，苯甲酸鈉的IC50為 0.0233～0.0999 g/kg，對(duì)5種菌的抑制效果依次為Bacilluscereus>Acinetobacterlactucae>Bacillusmegaterium>Paenibacillusamylolyticus>Bacillustoyonensis。脫氫乙酸鈉的 IC50為0.0353～0.2342 g/kg，對(duì)5種菌的抑制效果依次為Acinetobacterlactucae>Bacillustoyonensis>Paenibacillusamylolyticus>Bacilluscereus>Bacillusmegaterium；山梨酸鉀的IC50為0.0238～0.3203 g/kg，對(duì)5種菌的抑制效果依次為Paenibacillusamylolyticus>Acinetobacterlactucae>Bacilluscereus>Bacillusmegaterium>Bacillustoyonensis；EDTA 的 IC50為0.1422～0.3872 g/kg，對(duì)5種菌的抑制效果依次為；Bacilluscereus>Acinetobacterlactucae>Bacillusmegaterium>Paenibacillusamylolyticus>Bacillustoyonensis。一般 IC50越大越安全，抑制效果越差。

綜上，由表5中IC50值可知，4種防腐劑的抑制效果由高到低為：苯甲酸鈉>脫氫乙酸鈉>山梨酸鉀>EDTA，這與相關(guān)研究報(bào)道基本一致。綜合分析，選擇苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉進(jìn)行復(fù)配，通過(guò)正交試驗(yàn)考察復(fù)配的最佳配方。

2.2 復(fù)合防腐劑的正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bacillusmegaterium，Bacillustoyonensis及Paenibacillusamylolyticus是對(duì)該兩種防腐劑抗性較強(qiáng)的菌種，故選用這3種菌的抑制率作為正交試驗(yàn)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，然后對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6～表8。

通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析結(jié)果，可以得出各因素對(duì)巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)抑制效果的顯著水平：苯甲酸鈉對(duì)Bacillusmegaterium抑制效果影響極為顯著，脫氫乙酸鈉對(duì)Bacillusmegaterium抑制效果顯著，因素主次順序?yàn)锳>B，直觀分析和計(jì)算最佳水平組合為A2B2，即添加苯甲酸鈉質(zhì)量濃度0.2 g/kg，脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度0.3 g/kg時(shí)對(duì)Bacillusmegaterium的抑制效果最好，抑制率達(dá)到了97.60%。試驗(yàn)還得出因素對(duì)土揚(yáng)芽孢桿菌(Bacillustoyonensis)抑制效果的顯著水平：苯甲酸鈉抑制效果不顯著，脫氫醋酸鈉抑制效果顯著，因素主次順序?yàn)?B>A，計(jì)算分析最佳水平組合為 B2A2，即脫氫乙酸鈉濃度為 0.3 g/kg，苯甲酸鈉濃度為 0.2 g/kg時(shí)，對(duì)Bacillustoyonensis的抑制率可達(dá)98.11%。此外，各因素對(duì)解淀粉芽孢桿菌(Paenibacillusamylolyticus)抑制效果的顯著水平：苯甲酸鈉和脫氫醋酸鈉的抑制效果均顯著，因素主次順序?yàn)锽>A，計(jì)算分析最佳水平組合為 B2A2，即脫氫乙酸鈉濃度為 0.3 g/kg，苯甲酸鈉濃度為 0.2 g/kg時(shí)，對(duì)Paenibacillusamylolyticus的抑制率可達(dá)93.18%。綜上，可確定復(fù)合防腐劑最佳配方應(yīng)為A2B2。即苯甲酸鈉質(zhì)量濃度0.2 g/kg，脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度0.3 g/kg。

注：X1表示復(fù)合防腐劑對(duì)Bacillusmegaterium的正交試驗(yàn)結(jié)果；X2表示復(fù)合防腐劑對(duì)Bacillustoyonensis的正交試驗(yàn)結(jié)果?！?”為差異顯著；“**”為差異極顯著。

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 8 Analysis of variance of orthogonal test results

注：X3表示復(fù)合防腐劑對(duì)Paenibacillusamylolyticus的正交試驗(yàn)結(jié)果；“*”為差異顯著，“**”為差異極顯著。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照復(fù)合防腐劑的最佳配方，添加相應(yīng)防腐劑到腐敗菌培養(yǎng)液中進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在A2B2組合下，復(fù)合防腐劑對(duì)Bacilluscereus的抑制率達(dá)到98.93%，對(duì)Bacillusmegaterium的抑制率達(dá)到97.75%，對(duì)Acinetobacterlactucae的抑制率達(dá)到99.87%，對(duì)Paenibacillusamylolyticus的抑制率達(dá)到94.21%，對(duì)Bacillustoyonensis的抑制率達(dá)到98.19%。

2.4 應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)合防腐劑處理前后腌制韭菜根中細(xì)菌總數(shù)變化趨勢(shì)見(jiàn)圖5。

圖5 復(fù)合防腐劑處理前后腌制韭菜根中細(xì)菌總數(shù)變化趨勢(shì)Fig.5 Change trend of total bacteria in pickled leek roots before and after treatment with compound preservatives

由圖5可知，對(duì)照組在儲(chǔ)藏期間第15天，其細(xì)菌總數(shù)大于1×103CFU/g，到第30天，細(xì)菌總數(shù)已超2×105CFU/g，開(kāi)始腐敗。而添加復(fù)合防腐劑時(shí)，腌制韭菜根中的細(xì)菌總數(shù)在30 d內(nèi)一直處于170 CFU/g以下。對(duì)比對(duì)照組，處理組有很高的保鮮度，說(shuō)明復(fù)合防腐劑對(duì)于腌制韭菜根有很好的保鮮效果。

復(fù)合防腐劑處理前后腌制韭菜根的感官評(píng)價(jià)分值見(jiàn)圖6。

圖6 復(fù)合防腐劑處理前后腌制韭菜根的感官評(píng)價(jià)分值Fig.6 Sensory evaluation score of pickled leek roots before and after treatment with compound preservatives

由圖6可知，處理組在第30天，感官評(píng)價(jià)得分仍有7.7分，而對(duì)照組的感官評(píng)價(jià)得分只有4.8分，這進(jìn)一步說(shuō)明了復(fù)合防腐劑具有良好的保鮮效果。

3 結(jié)論

單一防腐劑的篩選試驗(yàn)表明，4種防腐劑對(duì)5種腌制韭菜根中的腐敗菌：Bacillusmegaterium，Acinetobacterlactucae，Paenibacillusamylolyticus，Bacillustoyonensis，Bacilluscereus具有不同程度的抑制作用，抑制效果依次為苯甲酸鈉>脫氫乙酸鈉>山梨酸鉀>EDTA。

復(fù)合防腐劑的正交試驗(yàn)結(jié)果分析，得出在苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為0.2 g/kg，脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度為0.3 g/kg的復(fù)配下，復(fù)合防腐劑對(duì)腌制韭菜根中主要致腐菌的抑制率達(dá)94.2%～99.9%。進(jìn)一步將復(fù)合防腐劑應(yīng)用到腌制韭菜根中，于30 ℃下恒溫儲(chǔ)藏30 d，結(jié)果證實(shí)其具有較好的防腐保鮮作用，達(dá)到了延長(zhǎng)保質(zhì)期的目的。該復(fù)合防腐劑有望在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用。