傅慧靜 胡 霞 吳松青 王 榮 梁光紅 黃世國 張飛萍

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院 福州 350002)

木質(zhì)纖維素是林木蛀干害蟲幼蟲階段的主要營養(yǎng)來源，在該類昆蟲的生長發(fā)育進(jìn)程中起著重要作用(Jungetal.，2015；Petersonetal.，2015)。木質(zhì)素是木質(zhì)纖維素的主要成分(蔣挺大，2009；邱學(xué)青等，2013；De Gonzaloetal.，2016)，屬大分子物質(zhì)，性狀穩(wěn)定，不溶于水和絕大多數(shù)溶劑(陳躍輝，2013)，不能直接被昆蟲腸壁細(xì)胞吸收運(yùn)轉(zhuǎn)。許多研究表明，昆蟲腸道微生物在木質(zhì)素生物降解過程中扮演著重要角色，其通過產(chǎn)生多種胞外酶推動(dòng)木質(zhì)素裂解反應(yīng)，形成可被吸收的小分子物質(zhì)(Buggetal.，2011；Wangetal.，2013；Lotfi，2014；Harithetal.，2014)。木質(zhì)素過氧化物酶(lignin peroxidase,LiP)、錳過氧化物酶(manganese peroxidase,MnP)和漆酶(laccase,Lac)被認(rèn)為在木質(zhì)素降解過程中起重要作用，其活性反映了特定微生物的木質(zhì)素降解能力(陳躍輝，2013)。

長期以來，針對昆蟲腸道微生物產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的研究大多集中在真菌方面(喻云梅等，2005；彭木等，2014；Sanchez，2009)，但昆蟲腸道細(xì)菌也能夠降解木質(zhì)素。Delalibera 等(2005)在研究椴六點(diǎn)楔天牛(Saperdavestita)等昆蟲的腸道微生物多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，源于椴六點(diǎn)楔天牛幼蟲腸道中的細(xì)菌既能降解濾紙，也能降解羧甲基纖維素;Schloss等(2006)研究表明光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)腸道中的放線菌具有降解木質(zhì)素類化合物的能力；Park(2007)等研究了9種天牛腸道細(xì)菌群落的多樣性，并在松褐天牛(Monochamusalternatus)腸道內(nèi)細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的研究過程中分離得到具有木質(zhì)素酶活性的變形菌門細(xì)菌(Gammaproteobacteria)；袁俊超等(2015)以試材木質(zhì)纖維為唯一碳源，從天牛幼蟲的腸道微生物菌群中篩選出3株能夠降解木質(zhì)纖維的菌株，同時(shí)發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)能協(xié)同煙曲霉(Aspergillusfunigatus)提高對木質(zhì)素的降解效率；李成林(2015)從4種食木白蟻腸道中篩選出可轉(zhuǎn)化利用木質(zhì)素類化合物的共生細(xì)菌。

除此之外，細(xì)菌還存活于許多其他種類昆蟲的腸道中，如棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、家蠶(Bombyxmori)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、美洲大蠊(Periplanetaamericana)、蜜蜂(Apiscerana)、桑天牛(Aprionagermari)、綠步甲(Carabussmaragdinus)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)等(何正波等，2001；相輝等，2008；王振鵬，2009；黃勝威，2012；楊樂樂，2013；劉曉飛，2015；郭軍等，2015；Crudenetal.，1984；Xiaetal.，2013；Huetal.，2017)，其中一些腸道細(xì)菌已被證明能夠產(chǎn)生1,4-β-內(nèi)切葡聚糖酶、1,4-β-木聚糖酶、果膠酶、α-淀粉酶等，具有促進(jìn)昆蟲腸道消化吸收木質(zhì)纖維素、木聚糖、果膠和淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的功能(Dillonetal.，2004)，但有關(guān)腸道細(xì)菌通過產(chǎn)木質(zhì)素降解酶分解木質(zhì)素的研究則較少。

沙雷氏菌(Serratiaspp.)隸屬于變形細(xì)菌門(Proteobacteria)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，通常存在于動(dòng)植物、水、土壤和人體中。昆蟲也是該類細(xì)菌的宿存對象，如寬須蟻蝗(Myrmeleotettixpolpalis)、白蟻(Reticulitermeshesperus)、菜青蟲(Pierisrapae)、小菜蛾、南亞實(shí)蠅(Bactroceratau)、黑廣肩步甲(Calosomamaximoviczi)、華山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)和桑天牛等的腸道中均發(fā)現(xiàn)沙雷氏菌(金虹等，2005；姬小雪等，2009；李會(huì)平等，2012；夏曉峰等，2013；文竹等，2015；駱米娟等，2016；Thayer，1976)。有研究表明，該屬的一些種類具有木質(zhì)纖維素降解功能，如源于華山松大小蠹幼蟲腸道中的沙雷氏菌能夠分泌木質(zhì)纖維素酶(胡霞，2014)，Anand等(2010)發(fā)現(xiàn)液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)具有分泌木質(zhì)纖維素酶等多種胞外酶的能力，Perestelo等(1994)證實(shí)從堆肥中分離純化出的黏質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)具有降解木質(zhì)素的能力。然而有關(guān)昆蟲腸道沙雷氏菌木質(zhì)素降解功能的研究極少。

松褐天牛由于是松材線蟲病(Bursaphelenchusxylophilus)的主要傳播媒介而成為備受關(guān)注和危害極大的林木蛀干害蟲(陳順立等，1997；Zhaoetal.，2014)，其食物的主要成分為木質(zhì)纖維素。研究該蟲對木質(zhì)纖維素的吸收利用機(jī)制，有助于更好地理解其對寄主的適應(yīng)性(王健敏等，2012)。筆者在前期研究該蟲腸道微生物的過程中，采用以羧甲基纖維素鈉作為唯一碳源培養(yǎng)，結(jié)合剛果紅法篩選纖維素降解細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)了154株分別隸屬于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)8個(gè)屬的纖維素降解細(xì)菌，其中黏質(zhì)沙雷氏菌占比20.13%(胡霞等，2018)，屬于腸道優(yōu)勢細(xì)菌。為進(jìn)一步探索該菌的功能及其作用機(jī)制，筆者研究其對木質(zhì)纖維素主要成分木質(zhì)素的降解功能，測定了其產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的情況，以及不同體外培養(yǎng)條件對其產(chǎn)優(yōu)勢木質(zhì)素降解酶——木質(zhì)素過氧化物酶的影響，以期為深入理解松褐天牛與該菌的協(xié)同作用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 黏質(zhì)沙雷氏菌HX-3菌株分離自松褐天牛幼蟲腸道。松褐天牛幼蟲來源于福建省福州市連江縣琯頭鎮(zhèn)中榜水庫周邊的馬尾松(Pinusmassoniana)林(26.150°N，119.593°E)，并通過劈開馬尾松木段的方法收集(胡霞等，2018)，菌株低溫保存于實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 SOC培養(yǎng)基(胡霞，2014)：SOC 34 g；瓊脂12 g；蒸餾水1 000 mL。硫酸鹽木質(zhì)素產(chǎn)酶培養(yǎng)基(陳躍輝，2013)：KL(kraft lignin)3.0 g·L-1；(NH4)2SO42.0 g·L-1；K2HPO41.0 g·L-1；KH2PO41.0 g·L-1；MgSO40.2 g·L-1；CaCl20.1 g·L-1；FeSO40.05 g·L-1；MnSO40.02 g·L-1；pH7.0。該培養(yǎng)基中KL為唯一碳源。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 活化菌種 將經(jīng)過純培養(yǎng)得到的黏質(zhì)沙雷氏菌單菌落接種在無菌SOC培養(yǎng)基內(nèi)，置于30 ℃恒溫、避光的條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)，并作為后續(xù)木質(zhì)素降解試驗(yàn)的接種體。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將經(jīng)過活化后的黏質(zhì)沙雷氏菌接種于裝有70 mL硫酸鹽木質(zhì)素液體培養(yǎng)基的250 mL規(guī)格錐形瓶內(nèi)，200 r·min-1，30 ℃連續(xù)培養(yǎng)10天(Ahmad，2010)，每天定時(shí)定量取樣，并檢測其木質(zhì)素降解率與酶活性，3次重復(fù)。

1.2.3 黏質(zhì)沙雷氏菌對木質(zhì)素降解率的測定 以0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg·L-1的質(zhì)量濃度梯度配制木質(zhì)素磺酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在木質(zhì)素特征吸收峰280 nm處，分別檢測不同質(zhì)量濃度下各標(biāo)準(zhǔn)品的OD值(每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù) 3 次)，再以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，各質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立回歸分析直線方程(圖1)。每天于超凈工作臺(tái)內(nèi)，通過移液槍所吸取的液體培養(yǎng)基樣品，以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，取其上清液，測定各樣品在280 nm處的OD值(陳躍輝，2013；喬喬，2013)。最終依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求解出目標(biāo)菌株的木質(zhì)素質(zhì)量濃度，再代入下式計(jì)算出木質(zhì)素的降解率。

木質(zhì)素降解率=

圖1 木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of lignin

1.2.4 粗酶液的制備 取培養(yǎng)后的菌液，以4 ℃、10 000 r·min-1，離心5 min，取其上清液即為粗酶液。

1.2.5 黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶活性的測定 按照1.2.2的方法培養(yǎng)菌液發(fā)酵產(chǎn)酶，并于培養(yǎng)的第1—10天分別每日定時(shí)定量取樣以制備粗酶液。同時(shí)，以未接菌種的相同培養(yǎng)基作為空白對照(3次重復(fù))。酶活力為酶促反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)釋放出1 μmol產(chǎn)物所需的酶量，定義為1個(gè)酶活單位(U·L-1)(Kapichetal.，2004)。

木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性檢測：依據(jù)相關(guān)學(xué)者的研究，選用藜蘆醇法(Mingetal.，1988)。具體為：首先，借助酶標(biāo)儀設(shè)定30 ℃恒溫反應(yīng)條件，利用移液槍分別吸取2 mmol·L-1VA 30 μL、50 mmol·L-1酒石酸鈉緩沖液(pH 2.5)139和30 μL的粗酶液于酶標(biāo)板(CORNING，3590)上，隨后通過1 μL 0.4 mmol·L-1H2O2啟動(dòng)體系的反應(yīng)，并于310 nm的波長處讀取、記錄1 min內(nèi)體系OD值的變化。

錳過氧化物酶(MnP)活性檢測：參照Wariish等(1992)的相關(guān)研究，選用二價(jià)錳氧化法。首先，借助酶標(biāo)儀設(shè)定30 ℃恒溫反應(yīng)條件，利用移液槍分別吸取1 mmol·L-1MnSO430 μL、50 mmol·L-1丙二酸鈉緩沖液(pH 4.5)139 μL和粗酶液30 μL于酶標(biāo)板(CORNING，3590)上，隨后用1 μL 0.1 mmol·L-1H2O2啟動(dòng)體系的反應(yīng)，并于270 nm的波長處讀取、記錄1 min內(nèi)體系OD值的變化。

漆酶(Lac)活性檢測：參考Wolfenden等(1982)的研究，采用ABTS法。具體為：首先，借助酶標(biāo)儀設(shè)定30 ℃恒溫反應(yīng)條件，利用移液槍分別吸取1 mmol·L-1ABTS 30 μL和100 mmol·L-1的醋酸鈉緩沖液(pH5)140 μL于酶標(biāo)板(CORNING，3590)上，后續(xù)用粗酶液30 μL啟動(dòng)體系的反應(yīng)，并于420 nm的波長處讀取、記錄1 min內(nèi)體系OD值的變化。

1.2.6 不同培養(yǎng)條件對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)Lip活性的影響 結(jié)合1.2.3和1.2.5研究結(jié)果，選擇活性最高的優(yōu)勢木質(zhì)素降解酶——LiP為對象，并選取產(chǎn)酶高峰期第4天的17:00為取樣時(shí)間，測定不同培養(yǎng)條件對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)酶活性的影響，3次重復(fù)。

不同木質(zhì)素質(zhì)量濃度的影響：以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別設(shè)置9組不同濃度(質(zhì)量濃度)梯度的木質(zhì)素，具體為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、15.0、20.0 g·L-1。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

不同pH值的影響：以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，利用pH 計(jì)(上海奧豪斯儀器有限公司)通過1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)并設(shè)置7組不同的pH值處理，分別為pH4、5、6、7、8、9、10。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

不同氮源種類的影響：以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別設(shè)置2組不同的氮源種類：有機(jī)氮源、無機(jī)氮源，有機(jī)氮源具體為蛋白胨(peptone)、酵母膏(yeast extracts)、干酪素(casein)；無機(jī)氮源具體為(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl、尿素[CO(NH2)2]。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

不同酵母膏(氮源)濃度的影響：基于不同氮源種類影響的研究結(jié)果顯示酵母膏產(chǎn)LiP的活性最強(qiáng)，故而選取酵母膏為氮源，進(jìn)一步檢測不同氮源濃度對LiP酶活性的影響。同樣以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，利用電子分析天平稱取酵母膏以設(shè)置7組不同的濃度(質(zhì)量濃度)處理，具體為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 g·L-1。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

不同金屬離子濃度的影響：以硫酸鹽木質(zhì)素液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過電子分析天平稱取金屬化合物以分別設(shè)置5組不同的金屬離子濃度(質(zhì)量濃度)梯度處理，具體為Mg2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、K+。其中，MgSO4分別為0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g·L-1；CaCl2分別為0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 g·L-1；FeSO4分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20 g·L-1；MnSO4分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g·L-1；K2HPO4和KH2PO4的分別為0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 g·L-1。其余條件和方法同木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件，利用單因素方差分析對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；通過Duncan檢驗(yàn)作不同處理間的差異顯著性分析(P<0.05)；應(yīng)用PRISM 5.0與ORIGIN 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黏質(zhì)沙雷氏菌對木質(zhì)素的降解功能

通過10天的液體發(fā)酵培養(yǎng)，黏質(zhì)沙雷氏菌對硫酸鹽木質(zhì)素的降解情況見圖2。由圖可知，在木質(zhì)素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前4天，其木質(zhì)素降解率隨時(shí)間的延長而增加，只是前2天的累計(jì)降解率僅為10.90%；隨后在第4天達(dá)到降解高峰，單日降解率高達(dá)15.16%，并于維持3天的穩(wěn)定期后，累計(jì)降解率達(dá)到66.23%。第7天降解率開始銳減，且隨時(shí)間的推移降解率逐步降低，至第10天僅為3.98%，但累計(jì)降解率達(dá)到94.12%。上述結(jié)果說明，黏質(zhì)沙雷氏菌對木質(zhì)素具有顯著的降解能力。

圖2 松褐天牛幼蟲腸道黏質(zhì)沙雷氏菌木質(zhì)素降解率Fig.2 Rate on degrading lignin by S.marcescens in the larval gut of M.alternatus

2.2 黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶特性

黏質(zhì)沙雷氏菌在不同培養(yǎng)時(shí)期產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的情況見圖3。該菌在各階段產(chǎn)Lip酶的活性均最高，然后依次是MnP和Lac。對于Lip酶活性，初期伴隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移而逐漸上升，于第4天達(dá)到峰值(214.67 U·L-1)，并在第5天開始呈現(xiàn)下降趨勢，至第10天其活性僅為36.26 U·L-1；對于MnP酶活性，初期2天的酶活性處于快速增長的階段，隨后3天增長趨勢則相對緩慢，但仍維持在較高的活性狀態(tài)，最高峰出現(xiàn)在第5天，為145.47 U·L-1，而后開始逐步下降。Lac酶在整個(gè)培養(yǎng)期間的活性始終處于較低水平，且僅在培養(yǎng)的第3天出現(xiàn)1個(gè)小高峰，活性也只達(dá)到16.88 U·L-1。結(jié)合圖2和圖3可知，黏質(zhì)沙雷氏菌對木質(zhì)素的降解率與其產(chǎn)LiP、MnP2 種酶活性的日變化趨勢相近，二者均在前期隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而逐步升高，并均在第4—5天期間出現(xiàn)活性高峰期，隨后均逐步下降直至第10天。這說明黏質(zhì)沙雷氏菌主要通過產(chǎn)LiP、MnP2 種酶而實(shí)現(xiàn)其木質(zhì)素降解功能。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間松褐天牛幼蟲腸道黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)酶曲線Fig.3 Curves of enzyme production by S.marcescens in the larval gut of M.alternatus with different culture time

2.3 不同培養(yǎng)條件對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)Lip活性的影響

2.3.1 不同木質(zhì)素濃度的影響 不同木質(zhì)素濃度下LiP活性見圖4。黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP的活性受木質(zhì)素濃度影響顯著(F=530.59，df=8，P<0.001)。當(dāng)質(zhì)量濃度處于0～3 g·L-1之間時(shí)，LiP的活性隨木質(zhì)素濃度的增加而顯著提高，此后，伴隨濃度的進(jìn)一步增加，LiP的活性反而逐漸轉(zhuǎn)弱。當(dāng)木質(zhì)素質(zhì)量濃度為3 g·L-1時(shí)，酶活性達(dá)到峰值，且顯著大于其他濃度處理。但當(dāng)木質(zhì)素質(zhì)量濃度處于20 g·L-1時(shí)，酶活性卻明顯弱于除對照外的其他濃度處理。

圖4 不同木質(zhì)素濃度下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.4 LiP activity from S.marcescens cultured with different conditions of lignin concentration圖中垂直線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。下同。The vertical line represents the standard error,different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.The same below.

2.3.2 不同pH值的影響 不同pH值對LiP活性的影響見圖5。不同pH值對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP的活性存在極顯著差異(F=596.67，df=6，P<0.001)。處于偏酸性條件下的LiP活性顯著超出偏堿性條件下的酶活性，當(dāng)pH值為5時(shí)的LiP活性最大(344.63 U·L-1)，且明顯比其他pH值處理領(lǐng)先；此外，而在pH≥8后的3個(gè)處理中，LiP活性均顯著低于其他pH值處理，說明堿性環(huán)境不利于黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP。

圖5 不同pH下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.5 LiP activity from S.marcescens cultured with different pH conditions

2.3.3 不同氮源的影響 由圖6可知不同氮源培養(yǎng)條件下LiP的活性情況：在有機(jī)氮源組中，蛋白胨、干酪素與酵母膏之間對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP活性的影響具有顯著差異(F=169.29，df=2，P<0.05)，當(dāng)?shù)礊榻湍父鄷r(shí)，LiP活性最強(qiáng)(1 080.23 U·L-1)；氮源為干酪素時(shí)，LiP活性最弱(400.74 U·L-1)。在無機(jī)氮源組中，(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl與CO(NH2)2之間對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP活性的影響也存在顯著性差異(F=212.17，df=3，P<0.05)，其中氮源為CO(NH2)2時(shí)的LiP活性最強(qiáng)(374.07 U·L-1)，而氮源為 (NH4)2SO4時(shí)的LiP活性最弱(207.20 U·L-1)。從整體看來，有機(jī)氮源組的酶活性顯然強(qiáng)于無機(jī)氮源組，進(jìn)一步表明有機(jī)氮源更適于黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP。

圖6 不同氮源下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.6 LiP activity from S.marcescens cultured with different sources of nitrogen

2.3.4 不同酵母膏(氮源)濃度的影響 不同酵母膏濃度對LiP活性的影響見圖7。酵母膏濃度對LiP活性具有顯著影響(F=437.83，df=6，P<0.05)。在1～5 g·L-1范圍內(nèi)，LiP活性隨酵母膏濃度增加而逐漸增大，尤其質(zhì)量濃度為5 g· L-1的LiP活性最高，達(dá)633.63 U·L-1，顯著高于其他各濃度處理；質(zhì)量濃度為1 g·L-1的LiP活性最低(237.84 U·L-1)。

圖7 不同酵母膏質(zhì)量濃度下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.7 LiP activity from S.marcescens cultured with different mass concentration of yeast extract

2.3.5 不同濃度金屬離子的影響 黏質(zhì)沙雷氏菌在各金屬離子不同濃度培養(yǎng)條件下產(chǎn)LiP活性如圖8。從圖可知，Mg2+濃度對該菌產(chǎn)LiP活性的影響達(dá)到顯著水平(F=399.94，df=5，P<0.05)，質(zhì)量濃度為0.20 g·L-1時(shí)的活性最高，達(dá)221.31 U·L-1，顯著高于其他各濃度處理；但當(dāng)質(zhì)量濃度處于1.00 g·L-1時(shí)的活性最低，僅為64.20 U·L-1，顯著小于其他處理。

對于Ca2+，不同濃度之間差異顯著(F=206.63，df=5，P<0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0～0.40 g·L-1時(shí)，隨著Ca2+濃度增加，LiP活性逐漸上升，在質(zhì)量濃度為0.40 g·L-1時(shí)的LiP活性最高(401.35 U·L-1)，顯著高于其他各濃度處理。

對于Fe2+，各濃度間也存在顯著性差異(F=288.14，df=4，P<0.05)，當(dāng)質(zhì)量濃度處于0.15 g·L-1時(shí)，酶活性最強(qiáng)(448.04 U·L-1)，且明顯強(qiáng)于其他各處理。而當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.15 g·L-1時(shí)，酶活性則顯著降低，且當(dāng)質(zhì)量濃度為0.20 g·L-1時(shí)的活性最低，僅為200.19 U·L-1，顯著低于其他各處理。

對于Mn2+，不同濃度對LiP活性也具有顯著影響(F=238.61，df=5，P<0.05)，當(dāng)質(zhì)量濃度處于0.04 g·L-1時(shí)的酶活性最強(qiáng)(376.73 U·L-1)，且顯著強(qiáng)于其他各處理。但當(dāng)Mn2+質(zhì)量濃度大于0.04 g·L-1后，酶活性卻迅速降低，并在質(zhì)量濃度處于0.10 g·L-1時(shí)的酶活性僅為171.95 U·L-1。

對于K+，各濃度之間存在顯著的差異(F=770.84，df=5，P<0.05)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0 g·L-1時(shí)，LiP活性最高(459.15 U·L-1)，顯著高于其他處理，并在質(zhì)量濃度0～5.00 g·L-1范圍內(nèi)，LiP活性隨著濃度增加而逐漸降低。

3 討論

黏質(zhì)沙雷氏菌在硫酸鹽木質(zhì)素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，對木質(zhì)素的累計(jì)降解率高達(dá)94.12%。這一結(jié)果證實(shí)來源于松褐天牛幼蟲腸道中的黏質(zhì)沙雷氏菌具備降解木質(zhì)素的功能，且該菌培養(yǎng)期間處于第4天時(shí)對木質(zhì)素的降解率最高(15.16%)，這可能因?yàn)榕囵B(yǎng)初期為菌體細(xì)胞急劇增長的對數(shù)期，該時(shí)期的細(xì)菌又恰恰是細(xì)胞生長代謝活動(dòng)最為旺盛的時(shí)期，而kraft木質(zhì)素正好作為菌株生長和代謝的唯一碳源被消耗利用，并為其后續(xù)的生長、發(fā)育、繁殖等生命活動(dòng)提供能量。

圖8 不同Mg2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、K+離子質(zhì)量濃度下黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性Fig.8 LiP activity from S.marcescens cultured with different concentrations of Mg2+,Ca2+,Fe2+,Mn2+,K+

作為高分子聚合物的木質(zhì)素直接進(jìn)入單細(xì)胞細(xì)菌體內(nèi)存在一定的難度，故不少細(xì)菌往往會(huì)選擇通過分泌一系列胞外氧化酶這一與真菌相仿的方式完成對木質(zhì)素的生物降解(Ramachandraetal.,1988；Buggetal.,2011；Charles，2013；Harithetal.,2014)。引起木質(zhì)素降解的實(shí)質(zhì)是由于在C—C鍵裂解的最初階段能夠致使木質(zhì)素脫甲基形成含苯氧基自由離子，而這一氧化過程需要多種酶的協(xié)同作用(Deetal.,2016)。目前，國內(nèi)外多方面的研究資料表明主要有3種酶參與木質(zhì)素的降解，分別為LiP、MnP和Lac(Wangetal.,2013；Harithetal.,2014)。因而，這3種酶活性的強(qiáng)弱能在一定程度上衡量微生物降解木質(zhì)素的能力。

本研究說明黏質(zhì)沙雷氏菌能夠通過分泌LiP、MnP和Lac實(shí)現(xiàn)對木質(zhì)素的生物降解，其中LiP與MnP具有較高的活性，但Lac的活性在整個(gè)培養(yǎng)過程中始終處于較低的水平，僅在培養(yǎng)的第3天出現(xiàn)小高峰(16.88 U·L-1)，明顯低于LiP、MnP。而前兩者分別在培養(yǎng)第4天與第5天的活性達(dá)到峰值(LiP：214.67 U·L-1；MnP：145.47 U·L-1)，且其隨時(shí)間的變化趨勢與該菌對木質(zhì)素的降解率相吻合，這既說明黏質(zhì)沙雷氏菌可通過分泌LiP與MnP 2種胞外酶實(shí)現(xiàn)其木質(zhì)素降解功能，同時(shí)也證明并非每種菌都依賴這3種酶降解木質(zhì)素的說法(王靖等，2008)。

對特定種類的微生物，其木質(zhì)素降解功能與其宿存的微生態(tài)環(huán)境如微量元素、環(huán)境pH值、誘導(dǎo)劑、氮源種類及其濃度等密切相關(guān)(高大文等，2005；喬喬，2013；徐海濤，2014；Mikaelyanetal.,2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素濃度、pH值、氮源種類、氮源濃度與金屬離子及其濃度對黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP活性均具有顯著影響，進(jìn)而影響著其對木質(zhì)素的降解功能。當(dāng)木質(zhì)素處于低濃度時(shí)，細(xì)菌降解木質(zhì)素的反應(yīng)速率與木質(zhì)素濃度之間基本呈正相關(guān)。然而，隨著木質(zhì)素濃度增大，反應(yīng)速率卻不再上升(金劍等，2010)，本研究中也存在類似情況，即該菌產(chǎn)LiP的活性并不伴隨木質(zhì)素濃度增加而增強(qiáng)，由此可見木質(zhì)素濃度與LiP活性之間并不是呈現(xiàn)出淺顯的線性關(guān)系，濃度越大并非對酶活性的提高越有優(yōu)勢。究其原因很可能是因木質(zhì)素濃度增加而導(dǎo)致降解環(huán)境隨之變得黏稠，阻礙體系內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的流通與氣體的流動(dòng)，由此造成高濃度木質(zhì)素條件下細(xì)菌的生長效果反而不如低濃度時(shí)理想，從而表現(xiàn)為高濃度時(shí)的酶活性不強(qiáng)。

pH值是影響微生物產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的重要因素，如節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶的最佳pH值為7(張慶芳等，2014)，斜臥青霉菌P6(PenicilliumdocumbensP6)產(chǎn)LiP的最適pH為4.0(楊金水等，2004)，而本研究中發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌處于偏酸性環(huán)境中LiP活性較強(qiáng)，且最佳pH值為5，這同學(xué)者Ahmad(2010)所提出的觀點(diǎn)“微生物產(chǎn)LiP在低pH時(shí)效果更佳”不謀而合。已有多方面的研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素降解酶的合成與活性的強(qiáng)弱受培養(yǎng)基環(huán)境的pH影響較深。無論過高還是過低的pH值，均會(huì)顯著影響酶的活性(張慶芳等，2014)，這在本研究的分析中也得到了進(jìn)一步的證實(shí)。

針對不同氮源對黃曲霉LDY(AspergillusflavusLDY)降解木質(zhì)素影響的研究表明，有機(jī)氮源的降解效果均劣于無機(jī)氮源(喬喬，2013)。本研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更適于黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)LiP，這說明不同微生物對不同種類氮源的利用能力具有差異。此外，秦嶺細(xì)粘束孢(Leptographiumqinlingensis)對寄主華山松金屬離子的營養(yǎng)具有高度選擇性(蒲曉娟等，2008)。而在本研究的分析中也發(fā)現(xiàn)不同金屬離子濃度對于黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)Lip活性具有顯著影響，對Mg2+、Mn2+與K+離子來說，處于高濃度時(shí)LiP活性顯然不如低濃度時(shí)的強(qiáng)，表現(xiàn)為抑制作用；而對于Ca2+與Fe2+，則表現(xiàn)為高濃度促進(jìn)作用。以上結(jié)果說明黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)Lip時(shí)對于不同金屬離子的營養(yǎng)需求不同，進(jìn)而可能進(jìn)一步表現(xiàn)出對寄主樹木營養(yǎng)的選擇性。

本文為深入了解松褐天牛對寄主植物的營養(yǎng)適應(yīng)機(jī)制提供了基礎(chǔ)依據(jù)。然而，關(guān)于該蟲腸道內(nèi)的其他微生態(tài)環(huán)境條件、該菌在寄主腸道內(nèi)產(chǎn)其他種類酶的情況以及與其他種類微生物的協(xié)同作用等，還有待于進(jìn)一步地探索。

4 結(jié)論

黏質(zhì)沙雷氏菌具有較強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力，可通過產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶實(shí)現(xiàn)其對木質(zhì)素的降解功能；培養(yǎng)基中木質(zhì)素濃度、pH值、氮源種類及其濃度、金屬離子及其濃度等對該菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶的活性均有顯著影響。