華金雙，邵素菊，鄭 潔，何竹青，楊京京，胡曉京，田 麗，徐 寧

(河南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450046)

逆針灸是指在無病或者疾病即將發(fā)生之時，運用針刺、艾灸的方法來提高機體的免疫力，從而防止疾病的發(fā)生，達到治未病的作用。治未病理論包括未病養(yǎng)生，防病于先；欲病救萌，防微杜漸；已病早治，防其傳變；瘥后調(diào)攝，防其復發(fā)等[1]。它包涵養(yǎng)生保健、疾病的預防和阻斷、康復等全方位的預防保健體系[2]。臨床發(fā)現(xiàn)過敏性哮喘易控制，但纏綿難愈，發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢，給家庭和社會造成沉重的負擔[3]，因此對哮喘的預防顯得尤為重要。在哮喘發(fā)作前，采用適當?shù)姆椒ㄗ钄嗷驕p輕哮喘的發(fā)生發(fā)展，對防治哮喘具有重大意義。課題組前期研究[4-5]表明：逆針灸可以啟動機體內(nèi)源性的保護機制，抵抗隨后可能發(fā)生的疾病損害，具有預保護作用。本研究通過觀察逆針灸對過敏性哮喘大鼠血清白介素(IL-10)含量和肺組織原癌基因fos(c-fos)和jun(c-jun)、轉(zhuǎn)錄因子T-bet蛋白表達的影響，探討逆針灸對過敏性哮喘大鼠的預保護機制，為治未病理論提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康雄性SPF級SD大鼠40只，體質(zhì)量160～180 g，由河南省實驗動物中心提供。動物合格證號為SCXK(豫)2017-0001。動物使用許可證號為SYXK(豫)2015-0005。實驗過程中對動物的處置嚴格遵守中國科學技術部2006年發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。動物自由飲水和攝食，定期更換墊料。室溫為20 ℃～22 ℃，濕度60%～70%，通風良好。剔除疾病、意外死亡等不符合實驗要求者。

1.2 試劑與儀器

卵蛋白(OVA)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，批號20180521；氫氧化鋁干粉，上海麥克林生化科技有限公司，批號20180411；0.9%氯化鈉注射液，河南科倫藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號A18020101-2；T-bet一抗，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，批號BA1711)； c-jun一抗、c-fos一抗，均為北京博奧森生物技術有限公司，批號依次是bs-0670R， bs-10172R。無菌針灸針，直徑0.25 mm、長度13 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品, 批號212160613；細艾條，南陽漢醫(yī)艾絨有限責任公司產(chǎn)品，批號2016-11-20；晶體管超聲霧化器，鞍山市無限電一廠產(chǎn)品； RM2015型切片機，德國Leica公司產(chǎn)品；BX43型光學顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組與模型的建立

在水和標準飼料充足條件下飼養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、逆針組和逆灸組。

除正常對照組外，其余各組動物均以新鮮配制的質(zhì)量分數(shù)為100 g/L的復合OVA抗原溶液(每升抗原液中含有OVA 100 g，氫氧化鋁干粉100 g)1 mL進行腹腔注射致敏。在實驗的第1天和第8天各注射1次，使大鼠致敏。第15天，將大鼠置于密閉的霧化箱內(nèi)，由壓縮霧化器噴入質(zhì)量分數(shù)為10 g/L的卵蛋白溶液20 min激發(fā)哮喘，每天1次，連續(xù)7 d。7 d后，按如下標準判斷模型是否成功：霧化初期大鼠表現(xiàn)為煩躁不安，抓耳撓腮，呼吸急促，活動頻繁；后期大鼠出現(xiàn)俯伏不動，毛發(fā)無光澤，反應遲鈍、萎靡不振。

1.4 各組大鼠的處理方法

逆針組：造模的同時，在致敏階段給予隔天1次的針刺干預，連續(xù)2周；激發(fā)階段給予每天1次的針刺干預，連續(xù)1周。取穴：肺俞(雙)、大椎、風門(雙)、足三里。采用直徑0.25 mm、長度13 mm針灸針，大椎直刺5 mm，風門、肺俞直刺6 mm，足三里直刺7 mm。每次20 min，每隔10 min行針1次,平補平瀉法。若適逢給予大鼠致敏或激發(fā)，則先針刺后致敏或激發(fā)。

逆灸組：造模的同時，在致敏階段給予隔天1次的溫和灸干預，連續(xù)2周；激發(fā)階段給予每天1次的艾灸干預，連續(xù)1周。取穴：肺俞(雙)、大椎、風門(雙)、足三里。持細艾條行溫和灸，艾條距離上述穴位2～3 cm，每次灸20 min。若適逢給予大鼠致敏或激發(fā)，則先艾灸后致敏或激發(fā)。

正常對照組用生理鹽水代替卵蛋白。正常對照組和模型對照組每天給予抓握刺激，不做任何治療。

1.5 檢測指標

1.5.1 標本取材

最后1次治療結(jié)束后24 h內(nèi)用質(zhì)量分數(shù)100 g/L的 水合氯醛3.5 μL/g腹腔注射麻醉大鼠，脫頸椎處死大鼠，迅速打開胸腹腔，暴露出腹主動脈，用10 mL注射器抽取血液3～5 mL，置于普通試管，靜置30 min，以3 000 r/min離心10 min，取上清，-20 ℃保存。取右肺中下葉，用4 ℃生理鹽水將其漂洗干凈，立即放入新鮮配制的40 g/L 多聚甲醛溶液中固定24 h以上，用石蠟包埋，切片，待用于肺組織免疫組化檢測。

1.5.2 IL-10含量

采用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血清IL-10含量，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 肺組織c-fos、c-jun、T-bet蛋白表達

采用免疫組織化學檢測肺組織c-fos、c-jun、T-bet蛋白表達。

石蠟組織切片，切片用二甲苯脫蠟3次，各10 min，依次在無水乙醇、體積分數(shù)950 mL/L酒精、800 mL/L酒精、750 mL/L酒精中浸泡，蒸餾水脫蠟至水化。將切片放入檸檬酸鹽修復液中，高壓修復2 min，在室溫條件下自然冷卻，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加30 g/L 雙氧水(即內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑)，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加一抗，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗，37 ℃避光20 min后，放入PBS中洗3次，每次5 min。配制DAB顯色液，滴加到切片上，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察，測定陽性免疫染色強度及面積，結(jié)果采用平均光密度(MOD)表示。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況對比

正常對照組大鼠活動靈活，飲食、飲水正常，無其他異常表現(xiàn)。模型對照組大鼠激發(fā)期間出現(xiàn)噴嚏、呼吸急促、喘息等癥狀的頻次較多，反應遲鈍，行動緩慢，飲食量減少，大便干稀不調(diào)。逆針組和逆灸組大鼠呼吸急促、噴嚏、喘息等癥狀的頻次較模型對照組明顯減少，反應較靈敏，飲食飲水量逐漸增加。

2.2 各組大鼠血清IL-10含量對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠IL-10含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，逆針組和逆灸組IL-10含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與逆灸組對比，逆針組IL-10含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

組 別nIL-10/(μg·L-1)正常對照組1046.18±4.26模型對照組1025.86±3.08??逆針組1035.80±2.44??##△逆灸組1031.30±3.02??##

注：與正常對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，##P<0.01；與逆灸組對比，△P<0.05。

2.3 各組大鼠肺組織c-fos、c-jun和T-bet蛋白表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠c-fos、c-jun和T-bet平均光密度值升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，逆針組和逆灸組c-fos、c-jun平均光密度值降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而T-bet平均光密度值略呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。逆針組和逆灸組兩組之間3個指標對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

組 別nc-fosc-junT-bet正常對照組100.028±0.0110.019±0.0070.019±0.007模型對照組100.056±0.014??0.058±0.010??0.034±0.010??逆針組100.043±0.008?#0.044±0.011?#0.025±0.009逆灸組100.042±0.006?#0.043±0.013?#0.033±0.011

注：與正常對照組對比，*P<0.05,**P<0.01，；與模型對照組對比，#P<0.05。

3 討 論

過敏性哮喘是由嗜酸粒細胞、淋巴細胞等多種細胞參與的慢性氣道炎癥疾病，常表現(xiàn)為以支氣管平滑肌收縮為主的過敏反應性癥狀和Th2型炎癥反應[6]。哮喘發(fā)作時Th2型細胞功能亢進，Th1型細胞被抑制。研究報道：轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3是影響Thl與Th2細胞分化的關鍵決定因子[7]。幼稚的T細胞通過轉(zhuǎn)錄因子T-bet分化成Th1細胞。T-bet能夠阻斷或抑制Th2的分化信號，還能誘導已經(jīng)定向分化的Th2細胞向相反的Thl方向轉(zhuǎn)化，對哮喘具有保護作用。研究發(fā)現(xiàn)：氣道轉(zhuǎn)染T-bet基因可以使Th1型細胞因子的分泌量增加，從而抑制小鼠的哮喘反應[8]。在過敏性疾病中，多種轉(zhuǎn)錄因子與Th2分化有關，其中活化蛋白-1(AP-1)對哮喘的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸起到重要作用。AP-1是由c-fos和c-jun組成的異源二聚體，c-fos 、c-jun 均屬于即刻早期基因。c-fos基因是mys家族的一員，編碼核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。Fos蛋白與Jun蛋白結(jié)合后，形成異源二聚體(AP-1)復合體，主要參與Th2細胞分化，并可調(diào)節(jié)Th2細胞下游因子的表達。研究表明：c-fos可使氣道上皮細胞受損，釋放多種炎性介質(zhì)和細胞因子，加重炎性反應，同時氣道上皮的修復又進一步導致氣道狹窄，因此c-fos、c-jun 參與哮喘的氣道炎癥、氣道重塑以及氣道高反應性等過程，進一步誘發(fā)和加重哮喘[9-12]。近年來發(fā)現(xiàn)IL-10是一種重要的免疫負調(diào)節(jié)因子, 主要由Th2 細胞、單核/巨噬細胞等產(chǎn)生，具有很強的炎癥抑制作用。IL-10 可能是通過抑制T細胞增殖和分泌細胞因子，并抑制抗原提呈細胞的作用和特異性IgE分泌而減輕哮喘的炎癥反應[13]。IL-10 基因啟動子區(qū)多態(tài)性與哮喘的發(fā)病、病情的嚴重程度有關[14]。研究證實哮喘患者血中IL-10水平明顯降低[15]，分析可能是當IL-10含量降低時，它對促炎因子IL-2、IL-5等的抑制作用減弱，使后者活性增強；同時，使IgE分泌增加，從而促進了哮喘變態(tài)反應性炎癥加重。

本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致：與正常對照組對比，哮喘模型對照組大鼠血清IL-10含量明顯降低，c-fos、c-jun、T-bet平均光密度值明顯升高，說明哮喘的發(fā)生發(fā)展與Th2型細胞亢進密切相關，在哮喘發(fā)作時Th2型細胞因子占優(yōu)勢。經(jīng)過逆針和逆灸后，哮喘大鼠血清IL-10含量明顯升高，c-fos、c-jun平均光密度值明顯降低，提示逆針灸能抑制哮喘大鼠氣道炎癥反應，減輕向Th2細胞的偏移，其糾正Th1/Th2失衡的作用機制可能與上調(diào)抑炎因子IL-10含量和抑制c-fos、c-jun蛋白表達有關。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，逆針組和逆灸組對Th1的特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet蛋白的調(diào)節(jié)作用不明顯，具體原因尚需進行深入探討。

臨床研究表明，艾灸健康人背部肺俞穴可以明顯提高其肺功能。動物實驗[16]發(fā)現(xiàn)，對哮喘小鼠提前給予蛇床子素預處理，可有效抑制小鼠氣道炎癥和黏液分泌，減少細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)，對哮喘小鼠具有預保護作用。這和本實驗研究結(jié)果方向一致，說明在哮喘大鼠欲發(fā)而未發(fā)階段，提前給予一定的適宜刺激，可以調(diào)動機體的潛能，啟動內(nèi)源性保護機制，提高機體內(nèi)在的抗病與應變能力，抑制各種炎癥相關因子的分泌，從而減輕哮喘癥狀，對預防和緩解哮喘的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。