劉夢涵 熊結青 楊儒文

摘 ? ? ?要：主要論述了麩皮培養(yǎng)基中不同淀粉含量對產黑曲霉孢子的速度、質量、數量的影響。試驗結果表明，麩皮培養(yǎng)基中的淀粉含量能夠提高黑曲霉菌絲生長速度，但是不利于黑曲霉產孢速度。麩皮培養(yǎng)基中的淀粉含量對麩曲孢子數量及孢子質量沒有影響，培養(yǎng)基中的水分及氮源含量，影響黑曲霉孢子的著生，對麩曲孢子總數影響顯著。

關 ?鍵 ?詞：淀粉;黑曲霉;孢子;質量;產量

中圖分類號：TQ 016.1 ? ? ?文獻標識碼： A ? ? ?文章編號： 1671-0460（2020）02-0357-04

Abstract： The effect of different starch content in bran medium on the yield， quality and quantity of aspergillus Niger spores was investigated. The results showed that high starch content in bran medium could improve the growth rate of aspergillus niger， but could restrain the sporulation rate of aspergillus niger. The content of starch in the bran medium had no effect on the number and quality of spores， while the content of water and nitrogen in the medium affected the initiation of aspergillus Niger spores and the total number of spores.

Key words： Starch; Aspergillus niger; Spores; Quality; Production

檸檬酸是有機酸中第一大酸，由于該產品具有物理、化學等方面的性能。檸檬酸廣泛應用于食品行業(yè)，也可應用于醫(yī)藥、電子、化學、石油、皮革、紡織、建筑等各個領域[1，2]。我國是檸檬酸生產大國，截止2018年產量已達177萬t，2010-2015年均增長率為2.9%;表觀消費量從2010年的104萬t增長到2015年的118萬t，年均增長率為2.6%，出口占60%。

檸檬酸發(fā)酵通常用黑曲霉二級發(fā)酵的方式，即先培養(yǎng)大量的成熟孢子，再將成熟的孢子做成孢子懸浮液，接入種子罐培養(yǎng)，種子罐培養(yǎng)合格后再接入發(fā)酵罐進行發(fā)酵產酸。黑曲霉孢子制備過程比較復雜。合格的黑曲霉菌種需要經過分離、篩選，選育出高產菌株，然后再進行斜面培養(yǎng)，最后再進行三角瓶逐級擴大培養(yǎng)，制備過程繁瑣，工作量大，從菌種選育到合格的成熟麩曲，制備周期至少需要30 d以上[1]。

所以黑曲霉孢子質量、產量是保證檸檬酸產量的關鍵因素。而營養(yǎng)因素對黑曲霉生長和產孢的影響是大規(guī)模生產檸檬酸的前提。碳源、氮源、維生素等營養(yǎng)物質是黑曲霉種子生長的所必須的營養(yǎng)物質和能量來源[3]。

作為微生物的營養(yǎng)物質，它能夠在細胞外或者直接被水解成小分子物質，通過細胞膜進入細胞，進入細胞后，在胞內酶的作用下，經過化學變化后組成細胞的原生質和細胞結構組成物質，為細胞生命活動提供能量[4]。

麩皮中淀粉含量豐富，淀粉是大多數微生物可以利用的碳源物質，可以為黑曲霉生長提供足夠的碳源。通常生產用水淘洗至淀粉含量極低的麩皮作為黑曲霉產孢的培養(yǎng)基。

麩皮作為黑曲霉產孢培養(yǎng)基具有以下幾個優(yōu)勢：（1）天然基質，不僅淀粉含量豐富，其他氮源等他營養(yǎng)物質也非常豐富; （2） 麩皮價格低廉，投資少;（3）麩皮作為黑曲霉產孢的載體，表面積大，孢子附著量多，利于增加黑曲霉產孢量。

1 ?實驗部分

試驗儀器設備

試驗所需的儀器設備見表1所示。

1.2 ?試驗菌種

本試驗使用的菌種由中糧生物化學（安徽）股份有限公司提供。

1.3 ?試驗原輔材料

糖化酶、玉米粉、麩皮、a-淀粉酶（耐高溫）、等材料均由中糧生物化學（安徽）股份有限公司提供。

1.4 ?試驗方法

1.4.1 ?PDA平板制備

取200 g去皮土豆，切成1 cm方塊的小丁，加1 000 mL水，水浴鍋內煮沸，500 W條件下，保持30 min。紗布過濾后，冷卻備用[5]。

在1 000 mL土豆汁中添加20 g葡萄糖，18g瓊脂粉，水浴鍋內溶解，待瓊脂完全溶解后，進行高壓蒸汽滅菌121 ℃×20 min。滅菌結束后取出冷卻至50 ℃左右，在無菌凈化臺上倒平板。待平板凝固后放入35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中空白培養(yǎng)48 h，檢查無染菌后，備用[3]。

1.4.2 ?搖瓶培養(yǎng)基制備

按照25%玉米粉調漿， 添加2%α-淀粉酶，攪拌均勻后放在水浴鍋中，95 ℃條件下，液化大約2 h，碘試不變藍即為液化合格。取部分的液化液不過濾，再取一部分液化液用濾布過濾出清液，再將液化液、液化清液按照一定比例混合，檢測混合液總糖。按照每瓶40 mL裝液量分裝搖瓶，不補水。121 ℃×20 min條件下滅菌[6]，備用。

1.4.3 ?麩皮培養(yǎng)基制備

取過16目篩的新鮮大片麩皮，按麩皮∶水=1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入自來水（單位質量，淀粉含量由高到低），拌勻至無干粉又無結團現(xiàn)象。作為對照的麩皮淘洗至水清、水分控制在70%左右。分別將上述不同配方的培養(yǎng)基分裝至1 000 mL三角瓶內，每種配方分裝6瓶，每瓶裝培養(yǎng)基45 g左右。分裝后的三角瓶棉塞塞上后用牛皮紙包扎。0.15 MPa，121 ℃條件下，滅菌60 min。滅菌后的麩皮，由于含有淀粉，容易結塊。所以待麩皮培養(yǎng)基冷卻后，將結塊的麩皮進行打散，備用。

不同配方培養(yǎng)基中淀粉含量檢測情況見表2。

1.5 ?接種

在無菌室內，無菌凈化臺上，火焰下方，每一瓶麩皮培養(yǎng)基分別接入1-2環(huán)黑曲霉孢子，接種量控制相同。

1.6 ?培養(yǎng)

接種后的三角瓶，放置于生化培養(yǎng)箱內。培養(yǎng)箱溫度設定35～37 ℃、濕度40%～60%。培養(yǎng)24 h后麩皮培養(yǎng)基表面開始長出白色小菌落，布滿麩皮表層，這時開始翻曲一次，使培養(yǎng)基疏松、透氣，并鋪平瓶底。繼續(xù)培養(yǎng)，以后，每隔12 h翻曲。麩曲生長至36～48 h，白色菌絲生長達到生長旺盛期，此時產生熱量最大，麩曲結塊比較嚴重。如果此時不及時翻曲，容易造成燒曲[6]。所以，36～48 h期間，翻曲的時候，一定要將結塊打散，并將麩曲平鋪瓶底。

此階段沒有產生孢子。當麩曲培養(yǎng)到48 h以后，開始產生零星孢子，72 h開始布滿整個三角瓶，此時翻曲停止。繼續(xù)培養(yǎng)至10 d左右，孢子成熟后即可進行下步試驗。

1.7 ?孢子計數

1.7.1 ?配制0.2%吐溫溶液

吸管吸取2 mL吐溫-80加入1 000 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至1 000 mL，加入轉子在磁力攪拌器上攪勻。

1.7.2 ?洗孢子

用量筒量取上述200 mL吐溫溶液在通風櫥中輕輕地沿瓶壁倒入被測麩曲瓶中，充分搖勻，用紗網過濾。再用200 mL吐溫溶液逐步清洗過濾后的麩皮上的孢子，直至麩皮洗白既可。將洗好的孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌均勻。

1.7.3 ?稀釋

取上述孢子懸浮液4 mL于100 mL容量瓶內，加入純凈水定容至100 mL。將稀釋后的孢子懸浮液放在超聲清洗機內超聲10 min。

1.7.4 ?孢子計數

血球計數板是一塊特制的，帶有網格的特殊載玻片，載玻片上有4個槽組成3個平臺。其中中間被一短槽分成兩個部分，每部分上面各刻有方格網，每個方格網總共有九個大格，中間的一大格作為計數用，叫計數區(qū)。計數區(qū)的刻度分為有兩類：一類是計數區(qū)為16個大方格，而每個大方格又被分成25個小方格（一般稱為16×25）;另一類是一個計數區(qū)是25個大方格，而每個大方格又被分成16個小方格（一般稱為25×16）。

目前使用的血球計數板規(guī)格為25×16。計數區(qū)總共有400個小方格，計數區(qū)邊長1 mm，計數區(qū)的面積為l mm2，所以每個小方格的面積為1/400 mm2。蓋上蓋玻片后，計數區(qū)的高度為0.1 mm，所以每個計數區(qū)的體積為0.1 mm3，每個小方格的體積為1/4 000 mm3。

取潔凈的血球計數板一塊，在計數區(qū)上蓋上一塊蓋玻片，先沾少量水使蓋玻片固定在血球計數板上。

將孢子懸浮液搖勻，用膠頭滴管吸取少量，從計數板平臺兩側的溝槽內快速滴入一小滴（孢子容易沉淀，滴定時一定要快速，而且滴定量不宜過多），讓孢子懸浮液利用液體表面張力填滿計數區(qū)，不要有氣泡產生，并用濾紙吸去溝槽中溢出的多余孢子懸浮液。

靜置片刻，待孢子沉降到計數板上，不再隨液體移動。將血球計數板置于顯微鏡載物臺上，并夾穩(wěn)，先在150倍顯微鏡下找到計數區(qū)后，再轉換600倍顯微鏡觀察，調整粗細螺旋，視野清晰，開始計數。

選擇處于4個角上的4個方格和中間的一個方格（每個大方格中有16個小方格），計數，數得5個大方格中的孢子總數N1。

重復上述，操作5次，又可分別得到孢子總數、N2、N3、N4、N5、N6。

計算：

孢子總數（個）=（N1 + N2 + N3 + N4 + N5 + N6）×400×10 000×25×400/（6×80）或 5個大格總數×5×10 000×稀釋倍數。

2 ?結果與分析

2.1 ?不同淀粉含量對黑曲霉生長的影響

黑曲霉屬于半只菌綱，只進行無性繁殖即由孢子發(fā)芽開始到新孢子形成、成熟為一個生活周期。黑曲霉孢子在液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)，6～8 h開始出芽，逐漸形成菌絲，進一步形成菌球。但是，黑曲霉孢子在固體培養(yǎng)基上，也是先出芽，長出很多芽，逐漸長成菌絲。很快，菌絲開始分枝。由于黑曲霉菌絲有橫隔，是多細胞結構[7]。當足細胞長出分生孢子梗時，梗的頂端泡囊開始聚集，并與原生質膜融合，使頂端逐漸膨大形成頂囊。頂囊上面長出二層小梗，接著小梗上長出成鏈的孢子。這樣，黑曲霉菌絲就不斷生長，孢子也就不斷產生，直至培養(yǎng)基營養(yǎng)耗盡為止[5，8]。

本次試驗中，觀察黑曲霉生長狀態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)84 h以前，淀粉含量高的麩皮培養(yǎng)基菌絲生長快且菌絲長，84 h以后淀粉含量低的培養(yǎng)基孢子產生快。分析認為，在每克培養(yǎng)基中，淀粉含量高的麩皮培養(yǎng)基中，碳源含量豐富，可以為細胞生長提供足夠的能量，可以促進黑曲霉菌絲生長，但是由于本試驗中淀粉含量高的培養(yǎng)基結團嚴重，通氣性差，不利于黑曲霉孢子著生，所以淀粉含量高可以促進菌絲生長但是對產孢子速度不利。

2.2 ?不同淀粉含量對黑曲霉的孢子的影響

采用血球計數板方法計數，計數結果見表3。

從表3可以看出，淀粉含量15.56%配方的孢子數最少，淀粉含量13.36%配方的孢子數最多，淀粉含量9.26%配方的孢子數最少。初步分析，孢子數最多的配方培養(yǎng)基中，不僅淀粉含量高達15.56%（干基）。由于培養(yǎng)基中淀粉含量過多，導致培養(yǎng)基淀粉結團嚴重，導致黑曲霉生長過程中結塊不易打散，產生的熱量不能散發(fā)出去，導致黑曲霉燒曲嚴重，進而影響黑曲霉產孢量。而淀粉含量13.36%的配方孢子數最多，初步分析，此時培養(yǎng)基中的淀粉含量即碳源含量能夠滿足黑曲霉生長，而且由于淀粉含量較低，培養(yǎng)基疏松，不易結團，而且利于黑曲霉代謝產生的熱量散發(fā)出去。另外，由于同等重量的培養(yǎng)基中麩皮含量最多，而孢子產量隨麩皮量即麩皮表面積（在一定范圍內）的增加而增加。但是淀粉含量9.26%的麩皮培養(yǎng)基，淘洗后丟失的不僅僅是淀粉，同時也會損失其他有利于黑曲霉生長的營養(yǎng)物質，所以導致培養(yǎng)結束的孢子數淀粉含量高的麩曲較少，但是比淀粉含量15.56%的麩曲孢子數多。