趙爾楊,王 姍,孟 琰,施 磊,強(qiáng)冬霞

成釉細(xì)胞瘤是口腔頜面部常見(jiàn)的牙源性上皮腫瘤，約占牙源性腫瘤的60%。其臨床特點(diǎn)具有局部侵襲和復(fù)發(fā)及惡變的風(fēng)險(xiǎn)[1-6]。雖然屬于良性腫瘤，由于其自身的生物學(xué)特點(diǎn)，針對(duì)成釉細(xì)胞瘤局部侵襲性的研究成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。

成釉細(xì)胞瘤的病因并不完全清楚，可能來(lái)源于牙齒發(fā)育時(shí)期的各種牙源性上皮剩余例如：成釉器、Malassez上皮剩余、Serres上皮剩余、縮余釉上皮以及牙源性囊腫的襯里上皮。也有人認(rèn)為此瘤可能發(fā)生于口腔黏膜上皮[1-6]。

糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白質(zhì)(glycosylphosph-atidyl inositol-anchored protein, GPI-AP)與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān)[7-8]，同時(shí)參與T細(xì)胞的增殖。PIGK是一種GPI-錨定氨基轉(zhuǎn)移酶，由PIGK基因編碼，參與GPI-AP合成過(guò)程的調(diào)控，是實(shí)現(xiàn)GPI-AP功能的關(guān)鍵酶[9]。

PCNA只存在于正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用[10-12]。

本課題對(duì)45例成釉細(xì)胞瘤進(jìn)行回顧性分析,采用HE染色與免疫組織化學(xué)染色，觀察PIGK與PCNA在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院2017年1月—2018年12月期間收治的45例成釉細(xì)胞瘤患者的完整病例資料。其中男23例，女22例；年齡23～62歲，平均年齡45歲；發(fā)生于上頜骨14例，發(fā)生于下頜骨31例。

1.2 組織標(biāo)本HE染色與免疫組化染色

組織標(biāo)本用 10%的中性甲醛液固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。所有蠟塊進(jìn)行連續(xù)性切片，常規(guī)脫蠟，分別進(jìn)行 HE 染色與免疫組化染色(immumohistochemical staining，IHC)。步驟如下：(1)pH值為9.0的EDTA緩沖液微波加熱至95～98 ℃15 min，進(jìn)行石蠟組織的抗原修復(fù)，PBS沖洗3次。(2)3%H2O2室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次。(3)5%BSA(武漢博士德AR0004)封閉15 min。(4)切片分別滴加一抗PCNA(武漢博士德No:BM0104)(1∶200)、PIG-K(Santa Cruz sc:398611)(1∶200)，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次。(5)每張切片滴加1滴Polink-1(中杉金橋PV6002)，37 ℃下孵育30 min，PBS沖洗3次。(6)DAB(中杉金橋ZLI9018)顯色3 min左右，水洗以終止顯色反應(yīng)。(7)蘇木素復(fù)染5 min；乙醇梯度上行脫水；二甲苯透明；中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察結(jié)果，陽(yáng)性部位呈棕黃色或棕褐色，分布于細(xì)胞漿或細(xì)胞核。

1.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

在光學(xué)顯微鏡下，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野( ×400)，記錄每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比和染色強(qiáng)弱后取平均數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%；1分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占5%～25%；2 分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%；3分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50%～75%；4分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于75%。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)染色；1分為染色弱(淺黃色)；2分為中等強(qiáng)度染色(棕黃色)；3分為強(qiáng)染色(棕褐色)?？傇u(píng)分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積，乘積大于3為陽(yáng)性表達(dá)[13]。PIGK陽(yáng)性對(duì)照為口腔鱗狀細(xì)胞癌組織，PCNA為口腔抗體公司提供陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照為PBS代替一抗后進(jìn)行上述染色的結(jié)果。

染色面積評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0～4分，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0～3分，兩項(xiàng)內(nèi)容相乘，結(jié)果分布范圍：0～12分。所有免疫組化切片分為7個(gè)等級(jí)，即Ⅰ等級(jí)：<3分；Ⅱ等級(jí)：3分；Ⅲ等級(jí):4～5分；Ⅳ等級(jí)：6～7分；Ⅴ等級(jí)：8～9分；Ⅵ等級(jí)：10～11分；Ⅶ等級(jí)：12分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析分別統(tǒng)計(jì)PCNA與PIGK的陽(yáng)性表達(dá)與病理分型的關(guān)系，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析分別統(tǒng)計(jì)PCNA與PIGK之間的相關(guān)性，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理資料分析

按照2005年《WHO 牙源性腫瘤組織學(xué)分型》的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所選蠟塊進(jìn)行常規(guī)HE染色復(fù)查，明確診斷為濾泡型30例，叢狀型15例，單囊型4例，腫瘤侵犯包膜7例。

2.2 PCNA、PIGK蛋白在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)

本次研究中PCNA與PIGK染色情況的描述順序?yàn)椋撼捎约?xì)胞瘤常見(jiàn)病理分型(濾泡型、叢狀型、單囊型)、成釉細(xì)胞瘤的富細(xì)胞區(qū)域和成釉細(xì)胞瘤的外圍纖維結(jié)締組織區(qū)域。此過(guò)程伴隨PIGK陽(yáng)性表達(dá)逐漸加強(qiáng)。

PCNA在不同病理分型的成釉細(xì)胞瘤均有陽(yáng)性表達(dá)。濾泡型中(圖1a,d)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞主要出現(xiàn)在上皮島周邊細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖1b,e)。PIGK在同一部位連續(xù)切片的免疫組化染色呈現(xiàn)陰性表達(dá)(圖1c,f)。

a：成釉細(xì)胞瘤濾泡型(HE ×100)；b：PCNA在成釉細(xì)胞瘤濾泡型中呈陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100)；c：PIGK在成釉細(xì)胞瘤濾泡型中呈陰性表達(dá)(IHC ×100)；d：成釉細(xì)胞瘤濾泡型(HE ×200)；e：PCNA在成釉細(xì)胞瘤濾泡型中呈陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×200)；f：PIGK在成釉細(xì)胞瘤濾泡型中呈陰性表達(dá)(IHC ×200)

圖1PCNA與PIGK在濾泡型成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)

Fig.1Expression of PCNA and PIGK in ameloblastomawith follicular pattern

叢狀型中(圖2a)，PCNA陽(yáng)性表達(dá)出現(xiàn)在上皮條索外圍，星網(wǎng)狀層有輕度陽(yáng)性表達(dá)(圖2b)。PIGK在同一部位連續(xù)切片的免疫組化染色呈現(xiàn)陰性表達(dá)(圖2c)。

a：成釉細(xì)胞瘤叢狀型(HE ×100)；b：PCNA在成釉細(xì)胞瘤叢狀型中呈陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100)；c：PIGK在成釉細(xì)胞瘤叢狀型中呈陰性表達(dá)(IHC ×100)

圖2PCNA與PIGK在叢狀型成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)

Fig.2Expression of PCNA and PIGK in ameloblastomawith plexiform pattern

單囊型中(圖3a) PCNA陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果與以上兩病理分型相似(圖3b，3c)。

a：成釉細(xì)胞瘤單囊型(HE ×100)；b：PCNA在成釉細(xì)胞瘤單囊型中呈陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100)；c：PIGK在成釉細(xì)胞瘤單囊型中呈陰性表達(dá)(IHC ×100)

圖3PCNA與PIGK在單囊型成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)

Fig.3Expression of PCNA and PIGK in unicysticameloblastoma

從以上三種成釉細(xì)胞瘤病理分型中，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PIGK的陽(yáng)性表達(dá)，為此我們觀察了牙源性上皮的富細(xì)胞區(qū)域(圖4a，d，g)，這些區(qū)域并無(wú)典型的成釉細(xì)胞濾泡型或者叢狀型特征，但可見(jiàn)清晰的PCNA陽(yáng)性表達(dá)出現(xiàn)在細(xì)胞核中(圖4b，e，h)。PIGK在同一部位連續(xù)切片的免疫組化染色中偶可見(jiàn)極弱陽(yáng)性表達(dá)(圖4c,f,i)。

a、d、g為成釉細(xì)胞瘤濾泡型富細(xì)胞區(qū)(HE ×100,200,400)；b、e、h為PCNA在成釉細(xì)胞瘤濾泡型富細(xì)胞區(qū)陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100，200，400)；c、f、i為PIGK在成釉細(xì)胞瘤濾泡型富細(xì)胞區(qū)少有陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100,200,400)

圖4PCNA與PIGK在成釉細(xì)胞瘤富細(xì)胞區(qū)域中的表達(dá)

Fig.4Expression of PCNA and PIGK in ameloblastomawith abundant cells

最終，我們總結(jié)發(fā)現(xiàn)免疫組化染色中，PIGK的陽(yáng)性表達(dá)為3例，且為弱陽(yáng)性表達(dá)，其他均為陰性表達(dá)。這種表達(dá)現(xiàn)象可以出現(xiàn)在瘤體的牙源性上皮中，見(jiàn)圖5b，d。圖5a,c是PCNA在同一部位連續(xù)切片的免疫組化陽(yáng)性表達(dá)。同時(shí)，PIGK也出現(xiàn)在外周的纖維結(jié)締組織中(圖6b，d)。值得注意的是PCNA(圖6a，c)與PIGK(圖6b，d)陽(yáng)性表達(dá)都可出現(xiàn)在成釉細(xì)胞瘤間質(zhì)豐富區(qū)域，不同的是PCNA多數(shù)在牙源性上皮呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，而PIGK僅僅在腫瘤間質(zhì)中有清晰的陽(yáng)性表達(dá)。

a：PCNA在成釉細(xì)胞瘤濾泡型中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100)；b：PIGK在成釉細(xì)胞瘤濾泡型中呈弱陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100)；c：PCNA在成釉細(xì)胞瘤濾泡型中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×200)；d：PIGK在成釉細(xì)胞瘤濾泡型中呈弱陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×200)

圖5PCNA與PIGK在成釉細(xì)胞瘤免疫組化染色強(qiáng)度對(duì)比

Fig.5Immumohistochemical staining intensity comparisonbetween PCNA and PIGK in ameloblastom

a：成釉細(xì)胞瘤中，PCNA在牙源性上皮邊緣的纖維結(jié)締組織中出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100)，牙源性上皮無(wú)陽(yáng)性表達(dá)；b：PIGK在牙源性上皮邊緣的纖維結(jié)締組織中出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，牙源性上皮無(wú)陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100)；c：成釉細(xì)胞瘤中，PCNA在牙源性上皮邊緣的纖維結(jié)締組織中出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，牙源性上皮有陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100)；d：PIGK在牙源性上皮邊緣的纖維結(jié)締組織中出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，牙源性上皮無(wú)陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×100)

圖6PCNA與PIGK在成釉細(xì)胞瘤間質(zhì)中的陽(yáng)性表達(dá)

Fig.6Expression of PCNA andPIGK in stromaof ameloblastoma

PCNA的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1，PIGK的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表2。PCNA表達(dá)與病理分型不存在相關(guān)性(P>0.05)；PIGK表達(dá)與病理分型不存在相關(guān)性(P>0.05)。

表1 PCNA染色結(jié)果

表2 PIGK染色結(jié)果

2.3 PIGK與PCNA相關(guān)性

在現(xiàn)有病例中，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PIGK與PCNA共同表達(dá)于同一病例的情況，雖然通過(guò)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)PCNA與PIGK存在相關(guān)性(r=-0.306,P=0.041)(等級(jí)資料信息見(jiàn)表3)，但由于病例數(shù)限制和PIGK的極低陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)法認(rèn)定兩種蛋白在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

表3 Spearman分析等級(jí)相關(guān)資料

3 討 論

GPI錨定氨基轉(zhuǎn)移酶是一個(gè)家族蛋白，主要負(fù)責(zé)輔助多種真核生物大分子錨定于細(xì)胞膜上。GPI錨定氨基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物有五個(gè)亞基，分別為PIGU、PIGT、GPAA1、PIGS和PIGK[4]，在5個(gè)亞基中，PIGK(GPI18)在GPI蛋白功能發(fā)揮中扮演重要角色[9,14-19]。

PIGK可以通過(guò)催化內(nèi)切蛋白酶過(guò)程及酰胺化作用實(shí)現(xiàn)GPI轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的目的[14]。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PIGK在口腔癌變的過(guò)程中基因出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄增多的情況(未發(fā)表)，由此推測(cè)PIGK可能參與口腔黏膜上皮癌變過(guò)程。最近Dasgupta等也發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌和泌尿道上皮細(xì)胞癌病人都會(huì)出現(xiàn)PIGK低度表達(dá)的情況[20]。這些研究結(jié)果在一定程度上提示PIGK有可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞中不同蛋白的修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)功能，進(jìn)而改變細(xì)胞的功能狀態(tài)，參與細(xì)胞的侵襲遷移。成釉細(xì)胞瘤雖屬良性腫瘤，但其生長(zhǎng)具有局部侵襲性，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，本次研究以PCNA作為參考，了解成釉細(xì)胞瘤中牙源性上皮的增殖能力，對(duì)比觀察PIGK的表達(dá)情況。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，PCNA在不同病理分型的成釉細(xì)胞瘤中都呈現(xiàn)清晰的陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)結(jié)果集中出現(xiàn)在牙源性上皮的細(xì)胞核中。而與之對(duì)應(yīng)的PIGK幾乎沒(méi)有出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。在一例包膜侵犯的病例中，PIGK在牙源性上皮的外圍纖維結(jié)締組織中出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，這些陽(yáng)性細(xì)胞均出現(xiàn)在小血管周?chē)Ｒ虼宋覀兺茰y(cè)PIGK影響的細(xì)胞性質(zhì)改變可能與疾病的炎癥存在關(guān)聯(lián)。此外，我們?cè)趦衫秊V泡型成釉細(xì)胞瘤中觀察到PIGK呈現(xiàn)低表達(dá)，相比之下，帶有富細(xì)胞區(qū)的病例沒(méi)有出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，提示成釉細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)或惡變與腫瘤性的牙源性上皮細(xì)胞的自身性質(zhì)密切相關(guān)。為此推斷成釉細(xì)胞瘤易復(fù)發(fā)或者惡變的特點(diǎn)可能與腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞或腫瘤間質(zhì)炎癥性狀均存在相關(guān)性。這種推論需要更多的臨床病例及機(jī)制驗(yàn)證。

同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)PCNA作為增殖能力的標(biāo)記物，幾乎在本次研究的所有病例中都出現(xiàn)廣泛陽(yáng)性表達(dá)，這說(shuō)明PCNA在預(yù)判成釉細(xì)胞瘤是否復(fù)發(fā)或惡變方面可能不具有顯著特異性，PCNA在成釉細(xì)胞瘤中的非顯著特異性在其他研究中也有提及[21]。還需要隨訪資料的支持。

總結(jié)：本次研究中并未發(fā)現(xiàn)PIGK可以大量表達(dá)于成釉細(xì)胞瘤中，陽(yáng)性表達(dá)率較低，雖然這些腫瘤可能具有較強(qiáng)的增殖能力。因?yàn)镻CNA的表達(dá)水平很高且與PIGK之間的表達(dá)不存在相關(guān)性，因此PIGK表達(dá)對(duì)成釉細(xì)胞瘤局部侵襲的意義還需進(jìn)一機(jī)制研究加以證實(shí)。