王曉梁,劉東超,徐日升,陳海昇
Fe2+和Fe3+對長莖葡萄蕨藻生長、鐵含量和生理特性的影響
王曉梁1,2,劉東超1,2,徐日升1,2,陳海昇1,2
(1. 廣東海洋大學水產(chǎn)學院,廣東 湛江 524088;2. 廣東省藻類養(yǎng)殖及應用工程技術中心,廣東 湛江 524025)
【】探索兩種無機鐵對長莖葡萄蕨藻()的生長、鐵含量及生理特性的影響。分別以三氯化鐵(FeCl3)和硫酸亞鐵(FeSO4)作為鐵源,采用單因素實驗方法,研究在不同濃度Fe2+、Fe3+條件下,長莖葡萄蕨藻的生長、光合色素含量、鐵含量、兩種過氧化酶(CAT、T-SOD)活性,以及總蛋白、維生素C和可溶性糖含量。在水體中無論是添加Fe2+還是Fe3+,藻體的特定生長率(SGR)、光合色素含量、鐵含量、過氧化物酶活性和維生素C含量均顯著高于對照組(< 0.05)。藻體的鐵含量隨著培養(yǎng)液中鐵離子濃度的升高而增加,以Fe2+和Fe3+處理后,藻體鐵最高值分別可達到1 522.54 μg/g和1 373.93 μg/g,增幅為1 369.34%和1 225.92%;藻體維生素C最高質(zhì)量分數(shù)分別可達15.41 μg/mg和12.89 μg/mg,增幅為107.56%和73.58%。Fe2+實驗組對藻體的可溶性糖含量有顯著影響(< 0.05)。實驗藻體的總蛋白含量顯著低于對照組(< 0.05)。藻體在3 mg/L Fe2+或者6 mg/L Fe3+的條件下,長莖葡萄蕨藻生長最佳,其營養(yǎng)品質(zhì)可得以改善。
長莖葡萄蕨藻;生長;鐵含量;抗氧化酶;營養(yǎng)成分
長莖葡萄蕨藻(),俗稱海葡萄,是一種大型食用綠藻,主要生長在潮間帶海區(qū)、水流較緩的沙地或礁石[1]。它不僅富含多種人體所需的氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素[2-4],還含有多種活性成分,在治療痛風、抗病毒與癌癥等方面具有較高的醫(yī)藥價值[5-7]。
鐵是人體的一種必需微量元素,主要在細胞代謝和氧的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要生理作用[8-9]。人體所需的鐵主要通過食物鏈獲取,而自然食物中鐵含量通常不能滿足人體需要。據(jù)統(tǒng)計,缺鐵性貧血依舊是一個世界性的公共健康問題[10],有必要在食物中補充鐵來滿足人體的生理需要,以蒸煮谷物植物為主食的人群更需補鐵[11-12]。目前增加膳食中鐵供給途徑主要有直接補充、食物強化、飲食多樣化、作物生物強化(包括育種與施肥)[11]。許多學者根據(jù)作物生物強化的原理開展了許多經(jīng)濟作物的富鐵研究,而作為功能食品的藻類的消費不斷增加[13],因此研究開發(fā)富鐵的藻類功能食品有重要價值。目前,關于食用藻類的富鐵研究僅見鈍頂螺旋藻()和小球藻()等微藻的報道[14-15],而大型食用海藻類富鐵研究鮮有報道。
長莖葡萄蕨藻為公眾喜愛的一種高端生鮮美食。筆者研究Fe2+、Fe3+兩種無機鐵對長莖葡萄蕨藻的生長、富鐵量和生理特性的影響,旨在為生產(chǎn)富鐵的長莖葡萄蕨藻,開發(fā)新型長莖葡萄蕨藻功能食品提供參考。
實驗用長莖葡萄蕨藻藻種購自深圳市藍汀鼎執(zhí)生物科技有限公司,培養(yǎng)于廣東海洋大學水產(chǎn)學院藻類實驗室。
暫養(yǎng)條件:溫度(26±1)℃,照度(2 000±100)lx,光暗周期12 L:12 D,營養(yǎng)鹽為0.5 mmol/L 的NaNO3溶液和0.1 mmol/L的KH2PO4溶液,海水鹽度30±1,連續(xù)充氣培養(yǎng),換水周期為7 d[16]。
挑選長勢良好的長莖葡萄蕨藻,剪取25 mm左右的直立枝作為實驗對象,用干凈海水反復沖洗后,將直立枝放入滅菌不加營養(yǎng)鹽的海水中進行適應培養(yǎng)1 d。
實驗用鐵化合物為1 g/L FeCl3溶液、1 g/L FeSO4溶液。全部藥品均為分析純(AR)。
采用1.5 L的方形開口塑料盒作為培養(yǎng)盒,添加1 L過濾滅菌自然海水,分別加入1 mL的NaNO3溶液與1 mL的KH2PO4溶液作為營養(yǎng)鹽。根據(jù)預實驗結(jié)果,2種價態(tài)(Fe2+和Fe3+)的鐵濃度分別設置為0(對照組)、3、6、9、12 mg/L。選取暫養(yǎng)后健康的直立枝,稱取質(zhì)量(0),隨機分至各組,每組放置5棵直立枝,每個實驗組設置3個平行組。
培養(yǎng)條件:不充氣,其他條件與暫養(yǎng)條件一致。連續(xù)培養(yǎng)7 d,每天觀測生長狀況,7 d后取出。
對培養(yǎng)結(jié)束后的藻體進行充分沖洗,去除表面的鐵溶液,用吸水紙吸干表面水分,稱取質(zhì)量(m),計算藻體的特定生長率(SGR)[16]。
將藻體烘干,研磨制成藻粉,進行硝化,用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測其含鐵量(Fe)[17]。
按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書要求,將藻體進行剪切、勻漿、稀釋等,測其光合色素含量、過氧化氫酶(CAT)活力、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、總蛋白(TP)含量、維生素C(VC)含量和可溶性糖含量。
SGR = [100 ln(m/0)] /;
Fe= (待測樣濃度-空白濃度)測/測;
(Chl-a)=[13.95(665nm)-6.88(649nm)]測/測;
(Chl-b)=[24.96(649nm)-7.32(665nm)]測/測;
(類胡蘿卜素) = {[1 000(470nm) - 2.05×(Chl-a) - 114.8(Chl-b)] / 245}測/測。
式中,SGR為特定生長率(%·d-1),0為初始藻體質(zhì)量(g),m為最終藻體質(zhì)量(g);測為待測樣硝化處理后的體積(L),測為待測樣的質(zhì)量(g)。
總蛋白質(zhì)量濃度= (待測OD值 -空白OD值) / (標準OD值-空白OD值) × 標準品質(zhì)量濃度(0.524 g/L)× 稀釋倍數(shù),標準品質(zhì)量濃度0.524 g/L,在= 595 nm處測量。
CAT活力= (對照OD值-測定OD值) × 271 × 1 /(60×取樣量)/ 待測樣本蛋白濃度,在= 405 nm處測量。
T-SOD活力= (對照OD值-測定OD值) / 對照OD值 / 50% ×(反應液總體積 / 取樣量)/ 待測樣本蛋白濃度,在= 550 nm處測量。
VC質(zhì)量分數(shù)= (待測OD值-空白OD值) / (標準OD值 -空白OD值) × 標準品質(zhì)量濃度× 稀釋倍數(shù)(4倍) / 待測樣本蛋白濃度,標準品質(zhì)量濃度6 μg/mL,在= 536 nm處測量。
可溶性糖質(zhì)量分數(shù)= (待測OD值 -空白OD值) /(標準OD值- 空白OD值)× 標準品質(zhì)量濃度× 稀釋倍數(shù)/ 待測樣本蛋白濃度,標準品質(zhì)量濃度100 μg/mL,在= 620 nm處測量。
采用IBM SPSS Statistics 19軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。通過單因素方差分析和Duncan多重比較對數(shù)據(jù)進行顯著性檢測(< 0.05),每組濃度結(jié)果,按照三組均值±標準誤用GraphPad Prism制圖。
兩種無機鐵對長莖葡萄蕨藻SGR的影響見圖1。圖1可見,隨著Fe2+或Fe3+濃度的升高,長莖葡萄蕨藻的特定生長率均呈先升后降變化趨勢。當Fe2+質(zhì)量濃度為3 mg/L時,長莖葡萄蕨藻的特定生長率最大,為4.670%·d-1,F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為6 mg/L時,藻體SGR最大,為5.627%·d-1,且均與對照組(2.746 %·d-1)有顯著差異(< 0.05)。
可見,在實驗濃度范圍內(nèi),無論添加Fe2+還是Fe3+,均可促進長莖葡萄蕨藻的生長。最適添加的Fe2+質(zhì)量濃度為3 mg/L,F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為6 mg/L。
凡含有一個相同字母則組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)
圖2可見,所有加鐵實驗組的藻體葉綠素a含量均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(< 0.05);鐵濃度變化對藻體葉綠素b含量影響不顯著(> 0.05);所有加鐵組藻體的類胡蘿卜素含量均值均高于對照組,但在Fe2+實驗組中僅3 mg/L和6 mg/L兩組差異有統(tǒng)計學意義(< 0.05),在Fe3+中,除9 mg/L外,其余3組藻體的類胡蘿卜素含量均與對照組差異有統(tǒng)計學意義(< 0.05)。
可見,兩種無機鐵主要對長莖葡萄蕨藻葉綠素a和類胡蘿卜素的含量變化有顯著影響,對葉綠素b含量影響不顯著。
兩種無機鐵對長莖葡萄蕨藻富鐵量的影響見表1。表1可見,隨著鐵離子濃度的升高,長莖葡萄蕨藻的富鐵量呈升高趨勢,與對照組差異有統(tǒng)計學意義(< 0.05)。當添加Fe2+時,除6 mg/L和9 mg/L兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(> 0.05)外,其他各組間差異有統(tǒng)計學意義(< 0.05),在12 mg/L時,藻體富鐵量達到最高值,為1 522.540 μg/g,各組增幅分別為528.80%、901.71%、1 080.21%、1 369.34%。當添加Fe3+時,各組間差異有統(tǒng)計學意義(< 0.05),在12 mg/L時,藻體富鐵量達到最高值,為1 373.932 μg/L,各組增幅分別為402.06%、581.89%、903.08%、1225.92%。
綜合分析,在實驗濃度范圍內(nèi),長莖葡萄蕨藻對兩種價態(tài)的鐵均有較強的富集能力。在相同濃度下,F(xiàn)e2+實驗組比Fe3+實驗組的藻體富鐵量略高。
凡含有一個相同字母則組間差異無統(tǒng)計學意義(>0.05)
The date with a same letter indicate no significant difference between them (> 0.05)
圖2不同的無機鐵濃度下長莖葡萄蕨藻光合色素含量變化
Fig.2 Changes of photosynthetic pigments content inunder different concentrations of inorganic iron
表1 不同的無機鐵濃度下長莖葡萄蕨藻富鐵量
注:凡含有一個相同字母則組間差異無統(tǒng)計學意義(>0.05)
Note: The date with a same letter indicate no significant difference between them (> 0.05)
兩種無機鐵對長莖葡萄蕨藻抗氧化酶CAT、T-SOD活力的影響見圖3。圖3可見,F(xiàn)e2+處理組的藻體CAT活性顯著高于對照組(< 0.05)。Fe3+處理組,除3 mg/L組別外,其余處理組藻體的CAT活性顯著高于對照組(0.05)。在圖3-B中,F(xiàn)e2+處理組的藻體T-SOD活性均與對照組差異有統(tǒng)計學意義(<0.05),F(xiàn)e3+的處理組,除3 mg/L組外,其余處理組藻體T-SOD活性均顯著高于對照組(<0.05)??梢?,在實驗濃度范圍內(nèi),除3 mg/L 的Fe3+外,添加兩種無機鐵可顯著提高藻體兩種抗氧化酶活力,且當添加Fe2+濃度為3 mg/L時,兩種抗氧化酶活力最強;當Fe3+濃度為6 mg/L時,藻體的兩種抗氧化酶活力開始相對穩(wěn)定。
凡含有一個相同字母則組間差異無統(tǒng)計學意義(>0.05)
The date with a same letter indicate no significant difference between them (> 0.05)
圖3不同無機鐵濃度下長莖葡萄蕨藻過氧化物酶活力變化
Fig.3 Changes of peroxidase activity inunder different concentrations of inorganic iron
兩種無機鐵對長莖葡萄蕨藻總蛋白、VC和可溶性糖含量的影響見表2。表2可見,所有加鐵組的藻體總蛋白含量均顯著低于對照組(<0.05)。在Fe2+處理后,各實驗組的藻體總蛋白含量比對照組分別降幅為36.47%、17.88%、31.82%、33.37%。在Fe3+處理后,各實驗組的藻體總蛋白含量分別降幅為18.65%、34.15%、38.80%、30.27%。在Fe2+處理后,添加濃度為3 mg/L和9 mg/L組的VC含量與對照組相比顯著提高(<0.05),分別增幅107.56 %和128.55 %。而Fe3+處理組中,除3 mg/L組外,其他組均與對照組有顯著提高(<0.05),分別增幅52.68%、73.58%、71.21%。Fe2+處理后,藻體可溶性糖含量均顯著增加(<0.05),增幅分別為39.01%、5.87%、23.02%、25.12%。Fe3+處理后的藻體可溶性糖含量沒有顯著提高(>0.05)。
可見,F(xiàn)e2+和Fe3+處理組的藻體總蛋白含量均顯著低于對照組。Fe2+處理后的藻體的VC與可溶性糖含量總體上顯著提高。Fe3+處理組的藻體的VC含量總體上顯著高于對照組,但藻體的可溶性糖含量與對照組差異不大。
表2 不同的無機鐵濃度下長莖葡萄蕨藻的總蛋白、VC和可溶性糖含量變化
凡含有一個相同字母則組間差異無統(tǒng)計學意義(>0.05)。
The date with a same letter indicate no significant difference between them (> 0.05).
鐵是藻類生長所必需的重要微量元素,同時也是限制性因素之一,在細胞呼吸、葉綠素產(chǎn)物合成以及作為輔酶參與電子和氧的轉(zhuǎn)運等過程中發(fā)揮作用[18-21]。在培養(yǎng)液中適當增加鐵的濃度可促進小球藻()、銅藻()的生長[15, 22]。本研究表明,無論是添加Fe2+還是Fe3+,均可促進長莖葡萄蕨藻的生長,說明在天然海水中加鐵可有效促進長莖葡萄蕨藻的生長。最適宜的Fe2+質(zhì)量濃度為3 mg/L,F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為6 mg/L。不同價態(tài)鐵的最適濃度不同,主要是因為藻類對兩種價態(tài)鐵離子的吸收機制不同,藻類可直接吸收利用外界環(huán)境中的Fe2+,僅小部分Fe3+可通過硫置換途徑進入細胞,大部分需經(jīng)置換和蛋白轉(zhuǎn)運兩個過程方可被吸收利用[23-25]。在光合色素的生成途徑中,需要以鐵卟啉環(huán)和δ-氨基-γ-酮戊二酸(ALA)為原料,鐵離子是二者生成原料之一,因此鐵可通過影響這兩種物質(zhì)的生成而影響光合色素的產(chǎn)生,從而導致色素含量發(fā)生變化[26]。研究表明,海帶()幼孢子體的葉綠素a和類胡蘿卜素含量隨著培養(yǎng)液中鐵濃度的增加而顯著增加[27],銅綠微囊藻()和慧氏微囊藻()葉綠素a和類胡蘿卜素的含量在富鐵培養(yǎng)液中明顯高于缺鐵的環(huán)境[28]。本研究中,添加兩種無機鐵主要對長莖葡萄蕨藻葉綠素a和類胡蘿卜素含量有顯著影響,但對葉綠素b含量無顯著影響。
一般而言,在植物耐受范圍內(nèi),植物對微量元素的富集量會隨環(huán)境中微量元素的升高而增加。目前已成功培育出多種富鐵陸生植物,在食用藻類富鐵強化方面亦培育出富鐵螺旋藻(1 426.40 μg/g,干基)、富鐵蛋白核小球藻(995.17 μg/g,干基)[14-15]。野生海藻鐵含量取決于沿岸海域中鐵離子含量,并呈季節(jié)性和地理性的變化[13]。關于天然長莖葡萄蕨藻中鐵含量,唐賢明等[29]報道約為136.96 μg/g(干基),de Gaillande[9]報道為0.2 ~ 214 mg/kg(干基)。本研究中,測得對照組藻體鐵質(zhì)量分數(shù)為103.62 μg/g,加入鐵后,藻體鐵含量隨培養(yǎng)液中Fe2+或Fe3+濃度的升高而增加,最高值分別可達1 522.54 μg/g和1373.93μg/g,增幅為1 369.34%和1 225.92%,表明長莖葡萄蕨藻對兩種價態(tài)的鐵均有較強的富集能力,應用無機鐵強化藻體鐵含量來生產(chǎn)富鐵功能海藻是可行的。在相同濃度下,F(xiàn)e2+處理組的富鐵量高于Fe3+處理組,是藻類對兩種價態(tài)鐵的吸收轉(zhuǎn)運機制不同所致,F(xiàn)e2+具有更快的時效性[30]。
T-SOD和CAT是兩種典型的抗氧化酶,它們通過將體內(nèi)形成的超氧化物轉(zhuǎn)換成毒性小或者無害物質(zhì)減少對植物造成的毒性損傷[31]。T-SOD在植物中主要以Mn-SOD、CuZn-SOD和Fe-SOD三種形式存在[32-33],大多數(shù)真核藻類的葉綠體基質(zhì)中,F(xiàn)e-SOD占主導地位。T-SOD通過控制金屬離子的得失電子對超氧化物陰離子自由基進行歧化來維持藻類細胞的穩(wěn)定[34-35]。CAT是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶,可將T-SOD酶產(chǎn)生的H2O2轉(zhuǎn)化為水。因此,在鐵元素充足狀況下,藻類體內(nèi)代謝旺盛,兩種酶活力較高,以分解代謝產(chǎn)生的毒害物質(zhì)[36-37]。本研究中,在Fe2+溶液培養(yǎng)條件下,兩種酶活力出現(xiàn)先升后降,再上升的現(xiàn)象,是因為藻體吸收鐵離子后會產(chǎn)生自由基,部分自由基一定程度上可抑制鐵對藻體的迫害,但當鐵離子濃度持續(xù)增加時,藻體產(chǎn)生的大量自由基又會對機體產(chǎn)生傷害,導致酶活力上升,以減少對藻體的迫[38];在Fe3+溶液培養(yǎng)條件下,兩種酶活力表現(xiàn)為先升高后平穩(wěn),這是因為藻體對不同價態(tài)鐵的利用機制不同[39]。從本研究可知,在實驗鐵濃度范圍內(nèi)(0 ~ 12 mg/L),T-SOD和CAT保護作用基本與鐵濃度存在正相關性。當添加的Fe2+質(zhì)量濃度為3 mg/L,藻體的兩種酶的活性最高;當Fe3+濃度質(zhì)量達6 mg/L后,藻體T-SOD和CAT的活性隨Fe3+濃度升高相對穩(wěn)定,這時藻體的生長也最佳。
蛋白質(zhì)、VC和可溶性糖是衡量藻類營養(yǎng)質(zhì)量的三個重要指標。研究發(fā)現(xiàn),當外界生長環(huán)境改變時,藻類的生長及生理生化成分也會隨之改變。加入鐵后,藻類外界環(huán)境改變,藻體易受脅迫而導致蛋白質(zhì)的改變[40]。本研究中,兩種加鐵實驗組的蛋白質(zhì)含量低于對照組,這與Xing等[41]報道的鐵使紫背浮萍()蛋白質(zhì)合成受到嚴重抑制的結(jié)果相似。這可能是因為藻體對鐵環(huán)境產(chǎn)生了脅迫反應,使藻體中葉綠素蛋白質(zhì)合成受抑制,從而導致總蛋白減少[40],或者是因為藻體鐵蛋白達到了一定的值后,鐵對其他種類蛋白質(zhì)合成和表達產(chǎn)生了負面影響從而降低了總蛋白含量[42]。實驗組VC含量發(fā)生變化,是因為VC是一種抗氧化劑,在鐵環(huán)境下細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量改變,作為清除過量ROS的優(yōu)勢抗氧化劑,VC會隨ROS的變化而變化[43]??扇苄蕴鞘侵参矬w內(nèi)重要供能物質(zhì),也是一種信號傳遞物質(zhì),對植物生長、增殖等過程有調(diào)控作用[44]。本研究中,加鐵組可溶性糖的含量均高于實驗組,說明鐵促進植物生長,在生長過程中植物進行光合作用產(chǎn)生大量的碳水化合物,從而導致可溶性糖的含量升高[45-46]。
總的來說,在加鐵環(huán)境下,藻體除蛋白質(zhì)含量降低外,VC和可溶性糖含量均顯著增加,說明添加鐵可較好地改善長莖葡萄蕨藻的營養(yǎng)品質(zhì),尤其是VC含量的顯著增加將有助于人體對鐵的吸收[12]。
在培養(yǎng)海水中分別加入兩種無機鐵(Fe2+、Fe3+)后,藻體的特定生長率、光合色素含量、鐵含量、兩種過氧化酶(CAT、T-SOD)活性以及總蛋白、維生素C、可溶性糖含量均受到影響。綜合考慮各指標,藻體在添加的Fe2+濃度為3 mg/L或Fe3+濃度為6 mg/L時,長莖葡萄蕨藻不僅獲得最佳的生長,而且可較好地改善其營養(yǎng)品質(zhì)。因此,最適宜添加的Fe2+濃度為3 mg/L,最適宜的Fe3+濃度為6 mg/L。
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Effects of Two Types of Inorganic Iron on the Growth, Iron Content and Physiological Characteristics of
WANG Xiao-liang1,2, LIU Dong-chao1,2, XU Ri-sheng1,2, CHEN Hai-sheng1,2
(1.,524088,; 2.,524025,)
【】The effects of two types of inorganic ferrum on the growth, photosynthetic pigment, iron content, antioxidative enzymes activity and nutrient components of.【】Ferric chloride (FeCl3) and ferrous sulfate (FeSO4) were added as iron sources in diet and their effects on growth, photosynthetic pigment content, iron content, enzymatic activity (CAT, T-SOD) and total protein, Vitamin C and soluble sugar content ofwere studied in a single factor experiment.【】The specific growth rate, photosynthetic pigment concentration, iron content, antioxidative enzymes activity (CAT, T-SOD) and Vitamin C concentration of algae were significantly higher than the control group under Fe2+or Fe3+treatment (<0.05). The iron content of algae is significantly increased with the increase of Fe2+or Fe3+concentration in the culture solution with the highest values 1 522.54 μg/g and 1 373.93 μg/g respectively and the increase was by 1 369.34% and 1 225.92%respectively. The highest Vitamin C concentration of algae reached 15.41 μg/mg (for Fe2+) and 12.89 μg/mg (for Fe3+), increasing by 107.56% and 73.586%,respectively. Fe2+group had a significant effect on the soluble sugar content of algae (<0.05). The total protein content of algae was significantly lower than that of the control group (<0.05). 【】When the algae was under 3 mg/L Fe2+or 6 mg/L Fe3+treatment, the algae achieved the best growth and improvement in nutritional quality.
; growth; iron content; antioxidative enzymes; nutrient content
S968.4
A
1673-9159(2020)02-0020-08
10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.004
2019-12-02
廣東省科技計劃項目(2015A020209167)
王曉梁(1993-),男,碩士,主要從事藻類生理生態(tài)學研究。E-mail:544517970@qq.com
劉東超(1963-),男,副教授,主要從事藻類生理生態(tài)學研究。E-mail: dongchaoliu696@hotmail.com
王曉梁,劉東超,徐日升,等. Fe2+和Fe3+對長莖葡萄蕨藻生長、鐵含量和生理特性的影響[J]. 廣東海洋大學學報,2020,40(2):20-27.
(責任編輯:劉慶穎)