亓 琳,李艷玲,向 璐, 趙 威,王曉凌

1 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 洛陽 471023 2 洛陽市共生微生物與綠色發(fā)展重點實驗室, 洛陽 471023 3 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室, 北京 100085

放射性核素鍶(strontium,Sr)為典型的長壽命核素,半衰期為28.79年[1]。已發(fā)現(xiàn)鍶有19個放射性同位素,其中長半衰期的鍶- 90和鍶- 89分別屬于高毒性和中毒性核素[2]。鍶- 90為鈾在核試驗中產(chǎn)生的裂變產(chǎn)物,存在于核爆炸的輻射微塵中,以粉塵的形式或者隨著食物鏈的富集最終進入人體,作為β射線的放射源對人體產(chǎn)生放射危害。研究發(fā)現(xiàn),鍶與鈣在人體內(nèi)的代謝具有很高的相似性,鍶為親骨性元素,沉積于人體內(nèi)富含鈣的器官,骨骼和牙齒是鍶的主要儲存庫[3]。鍶在我國土壤中的背景濃度,呈現(xiàn)地區(qū)分布不均勻性。甘肅、青海、新疆和西藏地區(qū)的鍶污染最為嚴重,土壤鍶濃度最高可達到1120—2112 mg/kg[4]。青海地區(qū)平均鍶濃度為334 mg/kg[5]。新疆是典型的內(nèi)陸干旱地區(qū),新疆污水庫的使用使其周邊的土壤鹽漬化加劇,增加了一些稀有金屬元素,如鍶對土壤的污染,周邊土壤的平均鍶濃度達到333 mg/kg[4, 6]。大連地區(qū)表土中鍶濃度最高達到763 mg/kg,平均鍶濃度為236 mg/kg[4]。目前,我國面臨的土壤污染趨勢不容樂觀,放射性核素導(dǎo)致大范圍的土壤遭到污染,開展修復(fù)90Sr污染土壤的研究很有必要。研究表明放射性核素在環(huán)境中與其穩(wěn)定性同位素在環(huán)境中的行為相似[7]。于是,觀察穩(wěn)定態(tài)鍶- 88在土壤和植物中的行為,是一個預(yù)測其放射性同位素鍶- 90行為的方法。

植物修復(fù)技術(shù)是指利用植物從環(huán)境中吸收富集重金屬和放射性核素等物質(zhì),具有成本低且綠色環(huán)保的優(yōu)點[8],該技術(shù)被用于緩解或去除土壤重金屬、核素污染。長期的實踐不斷證明,通過該技術(shù)修復(fù)污染土壤是行之有效的[9]。修復(fù)的成效則關(guān)鍵取決于修復(fù)植物自身的生物學(xué)特性。放射性核素通過土壤在植物體內(nèi)進行富集,對植物造成了雙重傷害,其一是核素發(fā)出的輻射射線會對植物造成嚴重的輻射傷害,其二核素本身在植物體內(nèi)具有累積效應(yīng),當(dāng)累積達到一定程度后會對植物生長代謝造成嚴重影響。由于不同植物生物學(xué)特性不同,對核素的吸附效果以及響應(yīng)機制也相差很大[10]。因此,植物修復(fù)技術(shù)的關(guān)鍵就是篩選出合適的植物[11]。長期以來,超累積植物是人們普遍關(guān)注的修復(fù)植物。研究表明超累積植物具有三大特征,包括富集重金屬量高、具有解毒機制以及對不同重金屬的富集有差異,生物富集系數(shù)(bioconcentration factor,BCF)和轉(zhuǎn)運系數(shù)(translocation factor,TLF)大于1是判定超富集植物的重要標準[12]。先前研究所關(guān)注的超累積植物主要是蕓苔屬(Brassica)如印度芥菜(Brassicajuncea),庭芥屬(Alyssum)如南庭芥(Aubrietacultorum)、遏藍菜屬(Thlaspi)如天藍遏藍菜(Thlaspicaerulescens)等,但它們存在很多不足之處,比如生物量較低且難以大規(guī)模種植,因而其在實際修復(fù)中的應(yīng)用受到限制,較高的地上生物量可以彌補這些缺陷。最理想的超累積植物,理想的超累積植物往往是BCF>1,TLF>1,且生物量較大。因此,一些生長速率快、生物量大、可富集重金屬的植物類型被應(yīng)用于植物修復(fù)[13]。

能源作物在我國資源豐富,且是生物質(zhì)能源的原料,將能源作物運用到植物修復(fù)技術(shù)前景廣闊。高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench),禾本科,一年生草本植物,其生物量大、根系發(fā)達、生長速度快等優(yōu)點有利于對土壤中污染物的富集,是目前最具修復(fù)潛力的能源作物之一[14]。能源作物高粱的秸稈可用于生產(chǎn)乙醇,將高粱用于植物修復(fù)具有兩個優(yōu)勢,其一治理了土壤重金屬污染；其二可用于生產(chǎn)工業(yè)酒精。由此,高粱作為修復(fù)植物解決了富含重金屬的植物難以處理的問題[15]。高粱具有龐大的根系對土壤中重金屬有很強的吸收能力[16]。然而,高粱轉(zhuǎn)運重金屬至地上部分的能力與超富集植物相比較弱,難以快速修復(fù)重金屬污染土壤,這一缺陷極大的限制了植物修復(fù)效率[17]。研究者們提出了許多強化植物修復(fù)效率的方法,如通過添加植物激素或接種微生物促進植物生長的等方法以增強重金屬在植物中富集[18-19]。其中,利用微生物與植物形成微生物-超累積植物共生體來加強植物修復(fù)效率成為目前植物修復(fù)領(lǐng)域的重要研究方向[20]。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)用于植物修復(fù)的四大優(yōu)點分別是：分布廣；可與陸地上多數(shù)(80%)植物互利共生；可以提高共生植物的抗逆性；能夠加強植物對重金屬的吸收。AMF在植物抗病、抗鹽堿、抗旱方面作用效果明顯,在土壤修復(fù)中的作用也很突出[21]。AMF-超累積植物共生體可以提高植物對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收效率,提高植物的抗逆性,增強植物對重金屬的耐受力以及調(diào)節(jié)植物對重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運,加強植物修復(fù)技術(shù)在土壤污染中的作用[22]。

通過對4種AMF,包括地球囊霉(Glomusgeosporum)、地表球囊霉(Glomusversiforme)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、透光球囊霉(Glomusdiaphanum)的比較研究,其中,地球囊霉對增強高粱對鍶耐受能力的效果最好。本研究在高粱修復(fù)鍶污染土壤體系中加入地球囊霉,在不同鍶濃度污染中,通過地球囊霉對高粱富集和轉(zhuǎn)運鍶能力的影響以及對土壤酶活性和土壤養(yǎng)分狀況的影響,評價接種地球囊霉對高粱根際土壤微生態(tài)環(huán)境的影響,評估地球囊霉在強化高粱修復(fù)核素鍶污染土壤的應(yīng)用價值,從而為地球囊霉-植物共生體修復(fù)鍶污染土壤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種：叢枝菌根真菌選擇地球囊霉。選擇花生(Arachishypogaea)作為地球囊霉的宿主,在土壤中進行菌種繁育80d,清除植物地上部分和表層土,將孢子、菌絲和侵染的根段混合物作為接種劑。

供試植物：本試驗采用的供試植物為高粱。用酒精(75%)浸泡種子5 min后,用H2O2(3%)滅菌10 min,之后用滅菌水沖冼3次。

供試土壤：在河南科技大學(xué)周山校區(qū)農(nóng)場土采集試驗土壤。土壤基本理化性質(zhì)按常規(guī)方法測定[23]。土壤pH值為8.05,有機質(zhì)含量為12.85 g/kg、全氮含量為0.96 g/kg、速效磷含量為12.52 mg/kg、速效鉀含量為155 mg/kg、銨態(tài)氮含量為2.01 mg/kg,陽離子交換量為19.23 cmol/kg,鍶含量為25.06 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

將實驗用土充分混均,放入袋子中,采用濕熱滅菌方法用高壓滅菌鍋在121℃下處理24 h[24],冷卻后備用。在每個塑料盆(高=16 cm,底徑=12 cm,口徑=22 cm)中裝入風(fēng)干土8 kg。每盆中播入20粒種子,出苗后定苗為每盆10株。將試劑SrCl2·6H2O(分析純)溶于超純水中制成溶液,設(shè)置Sr2+濃度為0、75、725、975 mg/kg,充分混勻,平衡3周。采用雙層接種法在每盆中均勻加入40 g接種劑至盆缽2/3處,以滅菌接種劑作為對照組(non-AMF)。

1.3 測定指標與方法

1.3.1菌根侵染率

在鍶處理60 d后,取整株高粱,每盆6株。用直尺和游標卡尺測量幼苗的株高和根長。叢枝菌根染色方法參考Phillips和Hayman[25]。菌根侵染率(%)=(根段中被菌根侵染的長度/檢測根段的長度)×100%。

1.3.2菌根依賴性

取不同鍶濃度處理的整株高粱,每盆6株。殺青溫度為105℃,持續(xù)殺青30 min,在烘箱中55℃持續(xù)烘干至恒重,用萬分之一天平稱重。菌根依賴性(%)=(接種從枝菌根真菌的植秼干重/未接種的植秼干重)×100%。

1.3.3株高、根長、生物量的測定

取不同鍶濃度處理的整株高粱,每盆6株。分別用直尺和游標卡尺測量,對幼苗的株高、根長進行測量。殺青溫度為105℃,持續(xù)殺青30 min,在烘箱中55℃持續(xù)烘干至恒重,用萬分之一天平稱重。

1.3.4鍶富集濃度的測定和計算

植物樣品烘干后,被分成根、莖、葉3個部分。分別取根、莖、葉2.0 g樣品,250℃下灰化,持續(xù)增溫至500℃,之后灰化2 h。將1 g灰化樣品混入6 mL的HCl-HNO3-H2O2(體積比為1∶1∶1)。采用ICP-AES(電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法)測定植物樣品中鍶濃度[26]。

生物富集系數(shù)(bioconcentration factor,BCF)﹦植物地上部分鍶濃度/(處理鍶濃度+土壤本底值)。

轉(zhuǎn)運系數(shù)(translocation factor,TLF)﹦地上部分鍶富集濃度/根中鍶富集濃度。通常,富集植物的TLF大于1,而非富集植物的TLF小于1[27]。

1.3.5土壤營養(yǎng)成分的測定

土壤有機質(zhì)含量的測定方法為重鉻酸鉀外加熱法,土壤全氮含量的測定方法為凱氏蒸餾法,土壤全磷含量的測定方法為濃硫酸高氯酸消解-鉬銻抗比色法,土壤速效磷含量的測定方法為碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法,土壤速效鉀含量的測定方法為乙酸銨浸提-原子吸收光譜法[23]。

1.3.6土壤酶的測定

轉(zhuǎn)化酶測定方法為3, 5-二硝基水楊酸比色法,磷酸酶活性測定方法為對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)-比色法測定,蛋白酶活性測定方法為茚三酮比色法測定,脲酶活性測定方法為尿素-凱氏定氮法,脫氫酶活性測定方法為TTC法[28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件(version 13.0；SPSS Institute Chicago,IL,USA)來進行統(tǒng)計分析,用最小顯著性差異(LSD)判定處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鍶脅迫下高粱的菌根侵染率

圖1 鍶脅迫下高粱的菌根侵染率 Fig.1 The mycorrhizal colonization rates of Sorghum bicolor under strontium stress不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著 (P < 0.05)

所有鍶處理組的菌根侵染率都大于50%。隨著鍶濃度的升高,菌根侵染率呈先上升后下降趨勢(圖1)。侵染率最高的為75 mg/kg(80%)和725 mg/kg(74.67%)處理,顯著高于無鍶添加處理(0 mg/kg)。在975 mg/kg處理中菌根侵染率有所下降,但與無鍶添加處理的侵染率無顯著性差異(P>0.05)。在無鍶添加處理和975mg/kg處理中,菌根侵染率分別為54.67%和53.67%。

2.2 接種叢枝菌根真菌對鍶脅迫下高粱生長的影響

高粱的整株生物量以及株高隨著處理中鍶濃度的增加,呈先增加后降低的趨勢。在接種菌根組中,在低濃度75 mg/kg鍶處理中,地上生物量最高。在接種菌根組中, 75 mg/kg和725 mg/kg鍶處理中高粱的地上生物量顯著高于無菌根組中的對應(yīng)濃度(P<0.05),分別增加了33.23%和21.43%。在接種菌根組中,根生物量最高的為無鍶添加處理和75 mg/kg處理,二者的根生物量均顯著高于無菌根組,分別增加了43.98%和56.09%。接種菌根組中975 mg/kg處理與無菌根組的對應(yīng)濃度相比,根生物量沒有顯著差異(P>0.05)。株高的最高值出現(xiàn)在75 mg/kg,而在725 mg/kg鍶處理中下降,在無菌根組和接種菌根組之間差異不顯著(P>0.05)。根長在無菌根組和接種菌根組之間相比沒有顯著性差異(P>0.05)(表1)。

以無菌根處理組中高梁的生物量為100%,高粱對菌根的依賴性隨著鍶濃度的增高呈先升高后降低(圖2)。其中,在低濃度75 mg/kg鍶處理,菌根依賴性最高為136.92%。在接種菌種組中,0—975 mg/kg處理時,菌根依賴性都高于100%。

表1 鍶脅迫下接種地球囊霉對高粱生長的影響

同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)

圖2 鍶脅迫下高粱的菌根依賴性 Fig.2 The mycorrhizal dependency of Sorghum bicolor under strontium stress

2.3 接種AMF對高粱鍶富集能力的影響

與無菌根組相比,經(jīng)過AMF處理后,高粱地上部分和根中的鍶濃度顯著增加(P<0.05)。高粱的地上部分和根部對金屬鍶的響應(yīng)一致,地上部分和根部鍶濃度都隨著土壤鍶濃度的增加而增加(表2)。

AMF接種處理中,高粱對鍶的轉(zhuǎn)運系數(shù)和富集系數(shù)都顯著高于無菌根組(P< 0.05)(表3)。無菌根組中高粱對鍶的轉(zhuǎn)移系數(shù)和富集系數(shù)都小于1。AMF種處理中,轉(zhuǎn)運系數(shù)在無鍶添加處理和975 mg/kg鍶處理中都小于1(但接近于1),而在75 mg/kg和725 mg/kg鍶處理中都大于1。富集系數(shù)僅在無鍶添加處理中小于1,而在鍶添加處理中都大于1。AMF處理顯著增強了高粱對金屬鍶的富集能力。

2.4 接種AMF高粱對鍶污染土壤中營養(yǎng)成分的影響

接種AMF對土壤有機質(zhì)、全氮、全鉀和速效鉀并沒有顯著影響,所有處理之間沒有顯著差異(P>0.05)(表4)。土壤全磷和速效磷含量與無菌根組相比顯著減少,全磷減少了6.52%—18.77%；速效磷減少了12.38%—27.43%。

表2 接種地球囊霉對鍶脅迫下高粱各部位鍶富集濃度

表3 接種地球囊霉對高粱富集鍶的轉(zhuǎn)移系數(shù)和生物富集系數(shù)的影響

表4 接種地球囊霉對土壤營養(yǎng)成分的影響

2.5 接種AMF高粱對鍶污染土壤中酶活性的影響

AMF對不同土壤酶活性的影響有差異(表5)。轉(zhuǎn)化酶、蛋白酶、脲酶和脫氫酶在所有處理中沒有差異(P> 0.05)。其中,接種AMF顯著增加了土壤磷酸酶活性(P< 0.05),與無菌根組相比,增加了19.67%—32.56%。

表5 接種地球囊霉對土壤酶活性的影響

3 討論

3.1 地球囊霉對高粱抗鍶能力的影響

在所有鍶濃度處理下地球囊霉對高梁的侵染率都超過了50%。在低濃度75 mg/kg和中間濃度725 mg/kg處理組時,地球囊霉的侵染率最高,顯著高于其他無鍶添加處理和高濃度975 mg/kg處理,這可能是由于地球囊霉在75 mg/kg和725 mg/kg鍶處理下耐受能力較強。在所有鍶處理中高梁都表現(xiàn)出顯著的菌根依賴性(P<0.05),表明在鍶處理中叢枝菌根有利于高粱生長。同時,接種地球囊霉顯著增強了高粱耐受鍶的能力。4個鍶濃度梯度相比,在75 mg/kg和725 mg/kg鍶處理時,高粱的菌根依賴性最強,與無鍶添加處理相比,分別增加了38.52%和58.78%。接種地球囊霉顯著增加了高粱的生物量(P< 0.05)。75 mg/kg和725 mg/kg鍶處理組中高梁的地上生物量與對照相比分別增加了33.23%和21.43%,根生物量分別增加了43.98%和56.09%。高粱和地球囊霉互利共生,菌絲通過根的皮層細胞可以從植物體獲得碳源,為菌絲生長提供了有利條件[29]。地球囊霉侵染高粱后形成龐大的菌絲體和植物根系網(wǎng)絡(luò),能夠促進植物對礦質(zhì)元素和營養(yǎng)成分的吸收,從而顯著增加高粱的生物量。有研究表明AMF通過增強植物光合效率,能夠促進宿主高粱生長并增強其抗逆能力[30]。在本研究中,地球囊霉有利于高粱生長,并提高了高粱對土壤鍶污染的耐受能力。

3.2 地球囊霉對高粱富集轉(zhuǎn)運鍶能力的影響

菌根真菌能夠影響土壤中重金屬的生物有效性,比如AMF對重金屬活化或鈍化、吸收與固持的作用,從而影響植物對重金屬的富集和分配。至今關(guān)于AMF對植物富集重金屬能力的影響還沒有一致的結(jié)論。接種地球囊霉能夠增強萬壽菊(TageteserectaL.)[31]和翅莢木(ZeniainsignisChun)[32]對重金屬的富集能力。在本研究中,與無菌根處理組相比,接種地球囊霉處理顯著增加了高粱地上部分和根的鍶濃度(P< 0.05)。這一結(jié)果表明地球囊霉增加了金屬鍶在土壤中的生物有效性,促進了鍶向植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。地球囊霉接種處理顯著提高了高粱對鍶的轉(zhuǎn)運和富集能力,TLFs和BCFs在接種AMF組顯著高于無菌根組(P< 0.05)。這一結(jié)果與先前的研究一致,AMF通過調(diào)節(jié)重金屬離子在植物體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運過程,促進了重金屬從土壤向植物體的轉(zhuǎn)移,從而增強植物修復(fù)的效果和效率[33]。此外,在重金屬污染條件下,由AMF和植物形成的共生體可以改善植物對營養(yǎng)元素的吸收,有效地增強了植物對重金屬污染的抗逆性,緩解了植物本身所受到的重金屬毒害作用,使植物修復(fù)效率增加[34]。然而,由于AMF定殖于植物根系,進而強化了根系對重金屬的吸收和固持作用,從而使重金屬更多固定于土壤中。在高濃度Cd處理中,接種摩西球囊(Glomusmosseae)顯著提高了Cd在玉米(ZeamaysL.)根中的富集,減少玉米地上部分的富集濃度,表明接種AMF能夠增強玉米對Cd的固持作用[31]。接種地球囊霉顯著增加了紫花苜蓿(Medicagosativa)根中Cd和Zn的富集濃度,而減少了地上部分的Cd和Zn富集濃度,表明地球囊霉增強了紫花苜蓿對Cd和Zn的固持作用,從而緩解重金屬對植物的毒性作用[35]。然而,由于接種AMF能夠促進宿主生長,當(dāng)植物富集重金屬總量相同時,植物富集的重金屬濃度(單位生物量中重金屬的富集含量)則會相應(yīng)減少。因此,AMF對重金屬的吸收和固持能力的增強效應(yīng),可能是AMF增加了植物的生物量而產(chǎn)生“稀釋效應(yīng)”[36]。

3.3 地球囊霉接種高粱對鍶污染土壤中養(yǎng)分和土壤酶活性的影響

菌根真菌侵染植物根系后,影響植物根際的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性,從而改變植物根際微生物的代謝活動。菌根真菌能夠提高植物的營養(yǎng)水平,特別是磷素營養(yǎng)。一方面,AMF增強微生物解磷活性,增加土壤有機磷含量。另一方面,AMF可將難溶性元素轉(zhuǎn)化為可吸收態(tài),進而促進植物對元素的吸收。如通過促進植物分泌有機酸,將土壤中轉(zhuǎn)化為磷酸鹽,在磷酸酶的作用下,磷酸鹽水解轉(zhuǎn)化為易吸收態(tài)[33]。在本研究中,與無菌根處理組相比,接種地球囊霉處理中的全磷減少了6.52%—18.77%,速效磷減少了12.38%—27.43%。土壤中這部分減少的磷素可能由地球囊霉介導(dǎo)而輸送至宿主植物體內(nèi)。研究表明接種地球囊霉的黑麥草(LoliumperenneL.)地上部分和根系中的磷含量相比于未接菌黑麥草都有顯著提高[37]。研究表明AMF會促進土壤酶的活性,包括酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、脲酶和蛋白酶的活性[35]。在本研究中,接種地球囊霉顯著增加了土壤磷酸酶活性(P< 0.05),與對照相比,增加了19.67%—32.56%。AMF可能通過多種機制協(xié)同影響根際環(huán)境,提高土壤養(yǎng)分的可利用性,并緩解重金屬對土壤酶的抑制作用,從而增強植物根際微生物的代謝活動。

4 結(jié)論

地球囊霉緩解了土壤鍶污染對高粱生長的抑制作用,增強了土壤磷酸酶和轉(zhuǎn)化酶活性,增強了高粱對鍶的富集和轉(zhuǎn)運能力。綜上所述,地球囊霉可增強高粱對鍶的富集和耐受能力,在鍶污染(75—725 mg/kg)下接種地球囊霉的效果最好。叢枝菌根-高粱共生體具有良好的修復(fù)效果和應(yīng)用前景。