張彩霞, 陳穎, 胡安妥, 王娉*, 王宏勛

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 武漢 430023; 2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心, 北京 100176; 3.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 南京 210046)

克羅諾桿菌(Cronobacter)[原阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)]主要寄生于人體和動(dòng)物腸道內(nèi)，是周生鞭毛、可運(yùn)動(dòng)、無芽孢、兼性厭氧的革蘭氏陰性腸桿菌[1]，在自然界中廣泛分布，乳制品及原料、即食食品、蔬菜、調(diào)味品、乳品生產(chǎn)環(huán)境、沖調(diào)器具等都有檢出克羅諾桿菌的報(bào)道[2]。2012年，Joseph等[3]將克羅諾桿菌屬定義為7個(gè)種，即阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌(Cronobactermalonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌(Cronobacterturicensis)、康帝蒙提克羅諾桿菌(Cronobactercondimenti)、尤尼沃斯克羅諾桿菌(Cronobacteruniversalis)、穆汀斯克羅諾桿菌(Cronobactermuytjensii)、都柏林克羅諾桿菌(Cronobacterdublinensis)。受到污染的嬰幼兒配方粉是新生兒感染的主要渠道，可導(dǎo)致新生兒腦膜炎、敗血癥和致死性小腸結(jié)腸炎等嚴(yán)重疾病，致死率達(dá)40%～80%[4]。我國GB 10765-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》中規(guī)定0～6月齡嬰兒食用的配方食品中不得檢出克羅諾桿菌[5]，此標(biāo)準(zhǔn)與EC 1441/2007[6]中的相關(guān)規(guī)定一致。

克羅諾桿菌具有很強(qiáng)的抗干燥特性[7]，可在低水分活度的嬰幼兒配方食品中長期存活[8]。乳制品生產(chǎn)加工過程中，如操作不當(dāng)極易造成克羅諾桿菌的污染。近年來，我國嬰幼兒感染克羅諾桿菌的事件屢有報(bào)道[9-10]。臨床上常使用β-內(nèi)酰胺類抗生素和氨基糖苷類抗生素治療克羅諾桿菌的感染，并且已有相關(guān)耐藥菌株的報(bào)道。周顯鳳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒配方奶粉中分離的7株阪崎腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素均有不同程度的耐藥性，其中1株阪崎腸桿菌幾乎對被測的所有頭孢類抗生素耐藥；張西萌等[12]的研究表明，進(jìn)口乳制品中阪崎克羅諾桿菌對苯唑西林100%耐藥，對頭孢噻吩、氨芐西林、頭孢唑啉和四環(huán)素具有不同程度的耐藥性；鄭金華等[13]研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒食品中分離的7株克羅諾桿菌對頭孢西丁的耐藥率為100%。因此，需要加強(qiáng)嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌的監(jiān)測及控制污染，其中，對細(xì)菌耐藥性檢測是監(jiān)測的重要內(nèi)容。本研究分析了食品中分離的68株阪崎克羅諾桿菌的抗生素敏感性和分子分型，探究了阪崎克羅諾桿菌的耐藥情況和脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分子分型特征，并探討了二者之間的相關(guān)性，以期為克羅諾桿菌引發(fā)的食源性疾病溯源和分子流行病學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株 從黑龍江、新疆、遼寧、北京等地食品樣品中分離的68株阪崎克羅諾桿菌。其中，58株分離自配方粉，3株分離自巧克力，2株分離自洋蔥圈，2株分離自方便面，1株分離自辣蝦條，1株分離自餅干，1株分離自辣味蝦。所有菌株經(jīng)生化及16s rRNA鑒定確定為阪崎克羅諾桿菌。沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812、質(zhì)控菌株ATCC25922為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基與主要試劑 腦心浸液液體培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI)、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(brain heart infusion agar，BHIA)(北京陸橋技術(shù)有限公司)；蛋白酶K(德國Calbiochem公司)；Tris-HCl(美國Biosharp公司)；EDTA(美國Amresco公司)；SeaKem Gold瓊脂糖(瑞士Lonza公司)；硫脲(美國Amresco公司)；XbaⅠ限制性內(nèi)切酶(日本TaKaRa公司)；十二烷基硫酸鈉(美國Amresco公司)；十二烷基肌氨酸鈉(日本Sigma公司)；細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞裂解液、5×TBE(上海生工生物工程有限公司)。

1.1.3主要儀器與設(shè)備 BD Phoenix Spec Nephelometer比濁儀(美國BD公司)；BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(美國BD公司)；BD PhoenixTMNMIC/ID-4革蘭式陰性菌鑒定及藥敏板(美國BD公司)；恒溫水浴搖床(WS20，德國WIGGENS公司)；恒溫培養(yǎng)箱(Memmert，德國Binder公司)；恒溫水浴鍋(WNB400，德國Memmert公司)；CHEF MAPPER XA脈沖場凝膠電泳儀(MODEL 200/2.0 POWER SUPPLY，美國BIO-RAD公司)；凝膠成像系統(tǒng)(VersaDoc，美國BIO-RAD公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌株活化 無菌操作將-80 ℃凍存的阪崎克羅諾桿菌接種于BHI中，36 ℃過夜培養(yǎng)，次日將培養(yǎng)液劃線接種至BHIA平板上，36 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.2藥敏檢測 抗生素敏感性分析選用BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)。無菌操作刮取BHIA平板上的新鮮菌落到比濁管，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至0.5 MCF，采用BD PhoenixTMNMIC/ID-4藥敏板進(jìn)行藥敏檢測，按照說明書進(jìn)行操作。BD PhoenixTMNMIC/ID-4藥敏板檢測項(xiàng)目19種，包括青霉素類(氨芐西林、哌拉西林)、頭孢類(頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶)、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類(氨曲南、亞胺培南、美羅培南、阿莫西林-克拉維酸、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦)、氨基糖苷類(阿米卡星、慶大霉素)、喹諾酮類(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)、葉酸途徑抑制劑類(復(fù)方新諾明)、酰胺醇類(氯霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素)。

1.2.3PFGE分型 參照文獻(xiàn)[14]，優(yōu)化部分試驗(yàn)參數(shù)。將新鮮培養(yǎng)的阪崎克羅諾桿菌制備成菌懸液(4.0～4.5 MCF)，加入1%的SeaKem Gold瓊脂糖混合制成膠塊，將凝固的膠塊轉(zhuǎn)入0.1 mg·mL-1蛋白酶K和細(xì)胞裂解液的混合液54 ℃裂解3.5 h，用XbaⅠ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切3.5 h，然后與1%的瓊脂糖制成電泳凝膠。電泳參數(shù)：電壓為6 V·cm-1，溫度為14 ℃，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間為2.16 s，最終轉(zhuǎn)換時(shí)間為54.17 s。電泳結(jié)束后，染色、脫色、成像，電泳圖譜用BioNumerics Version 6.6軟件進(jìn)行聚類分析。條帶位置差異容許度設(shè)置為0.5%，優(yōu)化值設(shè)為0.5%，PFGE帶型之間的相似度采用Dice系數(shù)來衡量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表1顯示，68株阪崎克羅諾桿菌分離株對氨芐西林、哌拉西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、阿莫西林-克拉維酸、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明16種抗生素均敏感。4株阪崎克羅諾桿菌具有耐藥性，耐藥率為5.88%。其中，對頭孢唑啉耐藥的菌株3株，對四環(huán)素耐藥的菌株1株。18株菌表現(xiàn)為中介，其中，對頭孢唑啉中介的菌株16株，對氯霉素中介的菌株2株。所有菌株對其余16種抗生素均敏感。

表1 68株阪崎克羅諾桿菌的抗生素敏感性

2.2 PFGE分型結(jié)果

圖1顯示，68株阪崎克羅諾桿菌共形成58個(gè)PFGE帶型，相似度為20%～100%，分別命名為PT001～PT058型。帶型總體較分散，沒有明顯的優(yōu)勢帶型和聚集現(xiàn)象。相似度為100%的菌株被認(rèn)為屬于同一PFGE帶型[15]。其中，PT037帶型包含4株菌；PT050帶型、PT054帶型均包含3株菌；PT007帶型、PT043帶型、PT046帶型均包含2株菌；其余帶型各包含1株菌株。同一帶型的菌株樣品來源較集中，如PT037帶型的4個(gè)菌株均分離自黑龍江A乳品廠的配方粉，PT050帶型的3個(gè)菌株均分離自黑龍江B乳品廠的配方粉，PT054帶型的3個(gè)菌株均分離自黑龍江C乳品廠的配方粉，說明配方粉受同一來源克隆株污染的可能性較大。而分離自北京配方粉的菌株BQ02和分離自黑龍江配方粉的BQ26表現(xiàn)出相同的帶型PT043，提示乳粉生產(chǎn)過程中可能存在特定型別的菌株。

圖1 68株阪崎克羅諾桿菌的PFGE聚類分析

3 討論

克羅諾桿菌對嬰幼兒和免疫力低下的人群具有嚴(yán)重的危害性，因此，對克羅諾桿菌耐藥性進(jìn)行檢測具有重要意義。黃玉蘭等[16]對嬰幼兒食品和臨床病例中分離的109株克羅諾桿菌的耐藥性研究表明，嬰幼兒乳粉中克羅諾桿菌的菌株分離數(shù)低于其他食品，雖然食源性克羅諾桿菌對磺胺類藥物和氯霉素等的耐受性有逐年上升趨勢，但食品中克羅諾桿菌多重耐藥株檢出較少。王倩寧等[17]對羊奶粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離的克羅諾桿菌進(jìn)行藥物敏感性分析，發(fā)現(xiàn)29株克羅諾桿菌中的22株對甲氧芐啶/磺胺甲惡唑耐藥，2株對頭孢西丁耐藥，1株對阿莫西林耐藥，1株對阿莫西林/克拉維酸耐藥，2株菌具有多重耐藥現(xiàn)象。本研究的藥敏結(jié)果顯示，68株分離株對所測試19種抗生素中的16種敏感，僅對頭孢唑啉和四環(huán)素耐藥，耐藥率分別為4.4%、1.5%，對頭孢唑啉和氯霉素的中介率分別為23.5%和2.9%，未發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株。相比于以上文獻(xiàn)報(bào)道，本研究中的阪崎克羅諾桿菌分離株耐藥性較低，可能與采樣地域、樣品種類有關(guān)。有研究認(rèn)為，耐藥基因在不同細(xì)菌間的傳遞，使原本對抗生素敏感的菌株產(chǎn)生“獲得性”耐藥[18]。因此，仍需加強(qiáng)克羅諾桿菌的耐藥性監(jiān)測。

PFGE分子分型方法辨識度高、穩(wěn)定性好，被廣泛運(yùn)用于克羅諾桿菌的分子分型及溯源研究[19]。柴云雷等[20]對嬰兒配方乳粉中的克羅諾桿菌分離株進(jìn)行PFGE分子分型，將12株克羅諾桿菌分為11個(gè)帶型；甘辛等[21]研究發(fā)現(xiàn)，我國19個(gè)地區(qū)嬰兒配方粉來源的49株克羅諾桿菌圖譜共形成38個(gè)帶型；周蒂等[14]利用PFGE技術(shù)對配方奶粉加工過程分離的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)46株阪崎克羅諾桿菌共形成29種PFGE基因指紋圖譜，說明乳粉來源的菌株呈現(xiàn)出較高的基因多態(tài)性和離散性。本研究中，68株阪崎克羅諾桿菌共分為58個(gè)PFGE帶型，PFGE型別較分散，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似。

將PFGE分型結(jié)果與藥敏結(jié)果結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，同一PFGE帶型的菌株BQ55和BQ56均對頭孢唑啉中介，PT054帶型中的2個(gè)菌株BQ64和BQ65均對頭孢唑啉中介，但與它們同型別的菌株BQ63對所有測試的抗生素均敏感，菌株BQ35和BQ36同屬于PT007帶型，但它們的耐藥情況卻不同。說明本研究中克羅諾桿菌的耐藥性與其PFGE帶型的關(guān)聯(lián)性不大，此結(jié)果與許龍巖等[22]的研究一致。

本文研究了PFGE帶型與菌株耐藥性之間的相關(guān)性，但并未發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)性。一方面是由于我國克羅諾桿菌食品分離株具有高度多態(tài)性[21]，另一方面與腸桿菌科其他屬病原菌相比，克羅諾桿菌屬菌株對常用抗生素較為敏感[16]。未來需分析更多的菌株，并結(jié)合耐藥基因檢測等其他手段來探究耐藥菌株間的聯(lián)系。