符可芯, 楊葉, 曾耿狄

(1.海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院, ?？?570228; 2.海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, ?？?570228)

銅(Cu)是生物體必需的微量元素，Cu 缺乏或過量都會(huì)影響動(dòng)植物和人類的生長(zhǎng)發(fā)育[1-2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為了提高作物產(chǎn)量大量使用含銅化肥和農(nóng)藥，其不合理使用導(dǎo)致土壤中Cu濃度增加[3-4]，土壤中銅的含量過高導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境發(fā)生惡化[5]。在污染土壤中的Cu經(jīng)植物吸收后，可抑制植物的光合作用，導(dǎo)致其生長(zhǎng)遲緩和葉萎黃[1,6-7]。銅污染食品經(jīng)人類食用后可在人體內(nèi)過量累積導(dǎo)致人體機(jī)能受到損傷，引發(fā)疾病[4]。研究表明，在人體內(nèi)高濃度銅可損傷其消化道引起急性胃腸炎，損傷呼吸道引起肺部感染等疾病[8]。土壤重金屬污染危及生態(tài)環(huán)境安全以及人類健康，因此，對(duì)其進(jìn)行修復(fù)具有重大意義。

目前，利用微生物修復(fù)土壤重金屬污染是土壤治理的研究熱點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景。微生物具代謝途徑豐富多樣性，并進(jìn)化出多種抵抗重金屬毒性的機(jī)制，如微生物可通過生物累積、生物礦化、生物吸附和生物轉(zhuǎn)化等機(jī)制對(duì)重金屬進(jìn)行吸附、沉淀、氧化和還原，因此，可以利用微生物對(duì)重金屬的抗性機(jī)制對(duì)環(huán)境中的重金屬污染進(jìn)行修復(fù)[9]。在微生物修復(fù)重金屬污染的研究中，細(xì)菌類微生物以芽孢桿菌為主。該類細(xì)菌產(chǎn)芽孢，好氧或兼性厭氧，抗逆性強(qiáng)，可在極端環(huán)境下生存[10]。研究報(bào)道，芽孢桿菌對(duì)Cu2+、Cd2+、Cr3+、Cu2+、Pb2+等多種重金屬具有抗性，在含有重金屬的培養(yǎng)基中可正常生長(zhǎng)[11-12]。Kumari等[13]從我國(guó)新疆一個(gè)酸性銅礦尾礦分離得到三株芽孢桿菌，對(duì)Cu、Cr、Pb、Cd、Sb 和Ni六種重金屬都具有較強(qiáng)的抗性。康薇等[14]分離得到一株芽孢桿菌TLSB-2-K,對(duì)銅的最高耐受濃度為700 mg·L-1，該菌株分別在銅濃度為200和300 mg·L-1的培養(yǎng)基中脅迫培養(yǎng)30 h后，菌體銅含量分別為2 078.2 mg·kg-1和2 188.4 mg·kg-1，具有較高的銅吸附能力。芽孢桿菌在土壤環(huán)境中廣泛存在，是被廣泛研究的生防微生物之一，也是重金屬污染的微生物修復(fù)技術(shù)中的重要微生物資源。

微生物修復(fù)法具有來源廣、成本低、操作簡(jiǎn)單、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)[9,15-16]。由于微生物本身的性質(zhì)特點(diǎn)，微生物修復(fù)法也存在局限性。微生物受環(huán)境溫度、pH及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等條件的影響，在土壤環(huán)境中不易存活及繁殖，導(dǎo)致微生物對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)效果不穩(wěn)定。如何提供微生物菌種適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生存環(huán)境條件在微生物修復(fù)法技術(shù)存在著重要地位。筆者在前期工作中分離得到1株銅富集細(xì)菌HNU1菌株，采用生理生化和分子生物學(xué)鑒定HNU1菌株為解淀粉芽孢桿菌。以HNU1菌株的生物量為評(píng)估指標(biāo)，對(duì)該菌的培養(yǎng)基成分和搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定該菌的最適培養(yǎng)基成分及最適培養(yǎng)條件，為進(jìn)一步開發(fā)為微生物肥料及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌種和質(zhì)粒 HNU1菌株由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從海南儋州分離并保存。大腸桿菌感受態(tài)DH5α菌株和pMD18-T載體均購自TaKaRa公司。

1.1.2主要試劑和儀器 DNA 凝膠回收純化試劑盒(Ver 2.0)、PCR 反應(yīng)用的各種試劑均購自大連TaKaRa公司(日本)；DNA 提取用試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、pH 7.0～7.2。

全自動(dòng)生物顯微鏡(LEICA DM6B)，廣東省中科進(jìn)口有限公司(德國(guó))；紫外分光光度計(jì)(T6新世紀(jì))，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 菌株鑒定

在LB平板上對(duì)HNU1菌株的菌落邊緣、形狀和顏色等形態(tài)特征進(jìn)行觀察，進(jìn)行革蘭氏染色、淀粉水解反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、V-P反應(yīng)、吲哚反應(yīng)、糖類發(fā)酵試驗(yàn)、脲酶反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)和檸檬酸鹽利用反應(yīng)等生理生化試驗(yàn)[17]。

將HNU1菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，在30 ℃、160 r·min-1震蕩培養(yǎng)18 h，用1.5 mL離心管吸取1 mL菌液，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，獲得菌體沉淀。利用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取HNU1菌株的基因組DNA。以基因組DNA為模板，用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增菌株的16S rDNA序列[18]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳 后，用DNA 膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收?；厥债a(chǎn)物連接到18T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)后，吸取微量菌液涂布在含有氨芐抗生素的LB平板上，在37 ℃下培養(yǎng)12～24 h。待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑取形態(tài)較大的菌落進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑取具有陽性電泳條帶的菌落，在含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，吸取適量菌液送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司完成。從EzTaxon-server(http：//eztaxon-e.ezbiocloud)獲得與HNU1菌株親緣關(guān)系相近的菌株16S rDNA序列，利用Mega 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.1溫度 以LB液體培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為20 mL(錐形瓶容量為50 mL)，121 ℃滅菌 20 min。以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種至培養(yǎng)液中，設(shè)定溫度為20、25、30、37、40、45、50 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理3次重復(fù)，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定菌液在600 nm處的OD值。

1.3.2pH 用滅菌的0.1 mol·L-1HCl和 0.1 mol·L-1NaOH 將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在最適溫度、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理3次重復(fù)，測(cè)定OD600值。

1.3.3接種量 將培養(yǎng)基調(diào)至最適pH，在培養(yǎng)基中分別加入0.1%、0.5%、0.7%、1%、1.5%、2%的種子液，在最適溫度、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理3次重復(fù)，測(cè)定OD600值。

1.3.4轉(zhuǎn)速 將培養(yǎng)基調(diào)至最適pH，按最適的接種量接種，分別調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為 120、150、180、210、240 r·min-1，在最適溫度下震蕩培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理3次重復(fù)，測(cè)定OD600值。

1.3.5裝液量 將培養(yǎng)基調(diào)至最適pH，用50 mL的錐形瓶依次裝有 10、20、25、30、40 mL培養(yǎng)液，按最適接種量接種，在最適溫度、最適轉(zhuǎn)速的條件下振蕩培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理3次重復(fù)，測(cè)定OD600值。

1.4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

選用LB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)基成分優(yōu)化的單因素篩選試驗(yàn)。

1.4.1碳源及其濃度 分別添加1%的葡萄糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、麥芽糖、蔗糖作為L(zhǎng)B培養(yǎng)基中的碳源，以不加碳源為對(duì)照，將上述處理的培養(yǎng)基 pH 調(diào)至7.0，裝液量為20 mL(錐形瓶容量為50 mL)，121℃滅菌 20 min。以0.1%的接種量接種至錐形瓶中，置于37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理3次重復(fù)，測(cè)定OD600值。

確定培養(yǎng)基的最佳碳源之后，改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最佳碳源的濃度，氮源和無機(jī)鹽組分不變，來進(jìn)一步研究不同濃度的碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.2氮源及其濃度 分別添加1.5%的KNO3、(NH4)2SO4、牛肉浸膏、胰蛋白胨、酵母粉、酵母粉+胰蛋白胨(兩種氮源的比例為1∶2)等氮源，替換LB培養(yǎng)基中的氮源，以不加氮源為對(duì)照，其他條件和測(cè)定方法同1.4.1。

確定培養(yǎng)基的最佳氮源之后，改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最佳氮源的濃度，碳源和無機(jī)鹽組分不變，來進(jìn)一步研究不同濃度的氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.3無機(jī)鹽及其濃度 分別以 1%的 CaCl2、KH2PO4、MgSO4、NaCl作為培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽，以不添加無機(jī)鹽為對(duì)照，其他條件和測(cè)定方法同1.4.1。

確定培養(yǎng)基的最佳無機(jī)鹽之后，改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最佳無機(jī)鹽的濃度，碳源和氮源組分不變，來進(jìn)一步研究不同濃度的無機(jī)鹽對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)中篩選出的蔗糖為碳源，酵母粉和蛋白胨為氮源，MgSO4為無機(jī)鹽，根據(jù) L9(34)正交表進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)(表1)，獲得HNU1菌株生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基組合，并驗(yàn)證優(yōu)化培養(yǎng)基組合對(duì)菌株生物量的提高效果。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS9.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用origin2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1分子生物學(xué)鑒定 HNU1菌株的16S rDNA基因序列測(cè)序結(jié)果表明，其大小為1 472 bp。將測(cè)序得到的16S r DNA基因序列上傳至NCBI中，獲得GenBank序列登記號(hào)為 MK583944。將測(cè)序獲得的序列在EzTaxon-server(http：//eztaxon-e.ezbiocloud)進(jìn)行相似性分析，結(jié)果表明，菌株HNU1與暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)的相似性為99.73%，與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissubsp.subtilis)的相似性為99.73%，與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的相似性為99.59%。利用 MEGA7.0 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示菌株HNU1與B.siamensis和B.amyloliquefaciens親緣關(guān)系最近(圖1)。

圖1 菌株HNU1的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.1.2形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定 通過菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),菌株在37 ℃培養(yǎng)24 h后，在LB平板上形成圓形或近似圓形菌落，菌落前期表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、稍有光澤的乳白色，后期表面粗糙、邊緣不整齊；在顯微鏡下觀察的菌體形態(tài)為短桿狀，兩端鈍圓。根據(jù)HNU1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示B.siamensis和B.amyloliquefaciens與HNU1菌株的親緣關(guān)系最近，對(duì)比HNU1菌株與B.siamensis和B.amyloliquefaciens[20]的生理生化特性(表2)，結(jié)果顯示HNU1菌株的生理生化特征與B.amyloliquefaciens一致，根據(jù)以上結(jié)果判斷HNU1菌株為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

表2 菌株HNU1的生理生化特性

2.2 菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 由圖2可知，在初始pH<5和pH>9時(shí)，HNU1菌株生長(zhǎng)緩慢。初始pH在5～8之間，OD值均達(dá)到2.30以上，說明菌株在pH 5～8之間都能很好的生長(zhǎng)。初始pH 8.0時(shí)，菌株的OD值顯著高于其他pH，因此HNU1菌株的最適pH為8.0。

注：圖中不同字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 由圖3可知，菌株在20～50 ℃的溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，說明菌株對(duì)溫度的適應(yīng)性較寬。在30～40 ℃時(shí)菌體生長(zhǎng)良好，在37 ℃時(shí)菌株的生長(zhǎng)最好，其OD值顯著高于其他溫度。高于45 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，OD值迅速下降。由此可以得出，菌株生長(zhǎng)的最適溫度為37 ℃。

注：圖中不同字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.3接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 由圖4可知，在0.1%～3%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加菌株的生物量逐漸降低，接種量超過3%之后，菌株生物量的差異趨于平穩(wěn)，以0.1%接種量處理時(shí),菌株的生物量最高，顯著高于其他接種量，因此最佳接種量為0.1%。

注：圖中不同字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.4轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 如圖5所示，轉(zhuǎn)速在120～240 r·min-1之間菌株均可以正常生長(zhǎng)。隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株的生物量呈先上升后下降的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)速為180 r·min-1時(shí)，菌株的生物量與其他轉(zhuǎn)速無顯著性差異，為了節(jié)約成本，以180 r·min-1為最適轉(zhuǎn)速。

注：圖中不同字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.5裝液量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 如圖6所示，隨著裝液量的增加，菌株的生物量呈下降趨勢(shì)，試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株發(fā)酵的最佳搖瓶裝液量為50 mL搖瓶中裝液20 mL，即50 mL搖瓶中最佳裝液量為20 mL。

注：圖中不同字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 培養(yǎng)基成分對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.3.1碳源及其濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 從圖7可以看出，HNU1菌株均能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉等碳源，以麥芽糖為碳源時(shí)菌體生長(zhǎng)最旺盛，蔗糖次之，以玉米淀粉為碳源時(shí)菌株的生物量最小，說明玉米淀粉不利于菌株的生長(zhǎng)。麥芽糖市場(chǎng)價(jià)較高，考慮到以后工業(yè)化生產(chǎn)的成本，選擇蔗糖為碳源。隨著蔗糖濃度的增加，菌株的生物量逐漸降低，以蔗糖濃度為1 g·L-1時(shí)，菌株的生物量達(dá)到最大。

注：圖中不同字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.2氮源及其濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 從圖8可以看出，以無機(jī)氮源為培養(yǎng)基氮源時(shí)菌株生長(zhǎng)量低，與對(duì)照組無顯著差異。以酵母粉+胰蛋白胨(1∶2)組合的氮源為培養(yǎng)基氮源時(shí)菌株的生長(zhǎng)量顯著高于其他氮源。另外，在以酵母粉、蛋白胨、牛肉膏三種有機(jī)氮源兩兩組合為培養(yǎng)基氮源時(shí)，以A2組合為氮源時(shí)，菌株生物量最大，且顯著高于其他組合，選擇該組合為培養(yǎng)基的最適氮源。當(dāng)?shù)礉舛葹? g·L-1時(shí),菌株生長(zhǎng)量最高，且顯著高于其他濃度，氮源濃度高于9 g·L-1時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量趨向于平穩(wěn)，因此氮源的最適濃度為9 g·L-1。

注：A1、A2、A3分別表示酵母粉與胰蛋白胨的比例為1∶1、1∶2、2∶1；B1、B2、B3分別表示酵母粉與牛肉膏的比例為1∶1、1∶2、2∶1；C1、C2、C3分別表示牛肉膏與胰蛋白胨的比例為1∶1、1∶2、2∶1。圖中不同字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3無機(jī)鹽及其濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 從圖9可以看出，以MgSO4為培養(yǎng)基的無機(jī)鹽時(shí)菌株的生物量最大，顯著高于其他無機(jī)鹽，選擇MgSO4作為最佳無機(jī)鹽。當(dāng)MgSO4的濃度為5 g·L-1時(shí)，菌株的生物量顯著高于其他濃度，確定優(yōu)化培養(yǎng)基中MgSO4的最適濃度為5 g·L-1。

注：圖中不同字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)碳源、氮源和無機(jī)鹽等組分的配比進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由表3可知，各組分影響HNU1菌株生物量的主次順序?yàn)镈>B>C>A，最優(yōu)的培養(yǎng)組合為A2B3C2D2。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果得出，HNU1菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基配比為蔗糖2.0 g·L-1、酵母粉4.0 g·L-1、蛋白胨6.0 g·L-1、MgSO45.0 g·L-1。利用優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)HNU1菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)后，測(cè)定發(fā)酵液的OD600值為2.398，顯著高于正交試驗(yàn)中的9種組合，說明該優(yōu)化培養(yǎng)基能顯著提高HNU1菌株生物量。

表3 培養(yǎng)基各組分配比優(yōu)化的正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

化肥、農(nóng)藥的大規(guī)模使用不僅導(dǎo)致土壤中的重金屬濃度增加，同時(shí)也出現(xiàn)土壤肥力降低，生態(tài)環(huán)境惡化，產(chǎn)品質(zhì)量下降等問題[21]。大多數(shù)重金屬(鎘、鉻、鉛等)在低濃度時(shí)對(duì)生物體具有很高的毒性，在環(huán)境中不易被降解，能通過食物鏈在生物體內(nèi)累積并危害其健康[9]。芽孢桿菌內(nèi)產(chǎn)芽孢，抗逆性強(qiáng)，是廣泛存在自然界中的非致病細(xì)菌，對(duì)人畜及環(huán)境安全無害，對(duì)多種病原菌均有抑制作用。解淀粉芽孢桿菌在防治植物病害中的研究報(bào)道較多，解SD-32對(duì)黃瓜白粉病菌和灰霉病菌具有良好的抑制作用[22]，Kc-38對(duì)芒果炭疽病菌和枯萎病菌具有良好的抑制作用[23]，SH-27對(duì)辣椒疫霉病菌有較強(qiáng)的抑制作用。但其在重金屬污染修復(fù)中的研究報(bào)道較少，龐亞琴等[25]利用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液處理受鎘脅迫的小麥幼苗5 d后，其發(fā)酵液對(duì)小麥幼苗遭受的鎘脅迫具有緩解作用。目前用于重金屬污染修復(fù)的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌等[26]。本課題組在前期研究中分離到一株對(duì)Cu2+具有良好富集作用的細(xì)菌菌株HNU1，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA同源性分析，確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。為了提高HNU1菌株的生物量及找出其最適培養(yǎng)條件，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)HUN1菌株的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，為該菌在土壤修復(fù)中的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

大多數(shù)研究認(rèn)為芽孢桿菌屬的最佳發(fā)酵pH在6.0～7.0左右，解淀粉芽孢桿菌15-1-1的最適初始pH為7.0[27]，短小芽孢桿菌的最佳初始pH為7.2[28]，枯草芽孢桿菌NJ-18的最適初始pH為6.8[29]，解淀粉芽孢桿菌FS6最適培養(yǎng)pH為6.0[30]，解淀粉芽孢桿菌HF-01的最佳初始pH為6.0～6.5[31]。與前人研究結(jié)果不同，本研究中HNU1菌株的最適初始pH為8.0，且菌株在pH 5～8的范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，其OD值均在2.30以上，說明該菌在偏酸以及偏堿的環(huán)境中均可良好生長(zhǎng)，適應(yīng)范圍廣。HNU1菌株的最適pH偏堿性，在大規(guī)模發(fā)酵時(shí)可添加適量的堿液，既能滿足菌株生長(zhǎng)的pH條件，也能在發(fā)酵過程中抑制其他雜菌生長(zhǎng)，保證發(fā)酵菌液的純度。

多數(shù)研究結(jié)果表明，芽孢桿菌的最適培養(yǎng)溫度在30～37 ℃左右，如解淀粉芽孢桿菌HF-01的最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃[31]，BAB-1為30 ℃[32]，TB2菌株為35 ℃[33]。HNU1菌株在30～40 ℃均可良好生長(zhǎng)，在37 ℃時(shí)菌株的生物量最高，與前人研究報(bào)道一致。但HNU1菌株在40～50 ℃下的生物量顯著高于20～30 ℃下的生物量，說明該菌可耐高溫環(huán)境，在土壤中具有更強(qiáng)的存活能力。在大規(guī)模發(fā)酵時(shí)可高溫發(fā)酵，既能達(dá)到菌量的要求，也能降低發(fā)酵過程中用于冷卻降溫的成本。在大多數(shù)的菌種優(yōu)化培養(yǎng)研究中，菌種的最佳接種量均在1%以上。如郭龍濤等[33]以3%接種量為解淀粉芽孢桿菌TB2的最佳接種量。魏立娟等[34]以14%接種量為解淀粉芽孢桿菌262AG6菌株的最佳接種量。與前人研究結(jié)果不同，HNU1菌株的最佳接種量為0.1%，說明HNU1菌株對(duì)培養(yǎng)條件的要求較低，在大規(guī)模發(fā)酵過程中可降低成本。HNU1菌株的生長(zhǎng)量隨著轉(zhuǎn)速的升高而成先上升后下降的趨勢(shì)，與魏嬌洋等[35]研究結(jié)果一致。

在碳源優(yōu)化結(jié)果中，HNU1菌株以麥芽糖為碳源時(shí)生物量最高，蔗糖次之。兩者的生物量差異不顯著，麥芽糖的市場(chǎng)價(jià)較高，選取蔗糖為HUN1菌株的最適碳源。與趙曉燕等[36]研究解淀粉芽孢桿菌XLA03的最佳碳源為玉米淀粉不同，HNU1菌株以玉米淀粉為碳源時(shí)的生物量最低，可能是由菌株間的生物學(xué)特性差異所致。在氮源優(yōu)化結(jié)果中，HNU1菌株以(NH4)2SO4、KNO3等無機(jī)氮源為培養(yǎng)基氮源時(shí)菌株基本不生長(zhǎng)，與劉文波等[37]研究結(jié)果一致。在單一有機(jī)氮源中，HNU1菌株以酵母粉為氮源時(shí)生物量最高，牛肉膏次之，最后是胰蛋白胨。在復(fù)合氮源中，以酵母粉+胰蛋白胨組合為氮源時(shí)菌株的生物量最高，其次是牛肉膏+胰蛋白胨組合，最后是酵母粉+胰蛋白胨組合。因此推測(cè)胰蛋白胨在HNU1菌株的發(fā)酵過程中的主要作用是提供生長(zhǎng)因子，其具體作用需進(jìn)一步研究。

本研究鑒定的解淀粉芽孢桿菌HNU1菌株對(duì)Cu2+具有良好的富集作用，可開發(fā)為銅污染土壤的修復(fù)菌種。為了使HNU1菌株土壤環(huán)境中可以穩(wěn)定生存及繁殖，可根據(jù)本研究結(jié)果將HNU1菌株發(fā)酵制成微生物肥料，并在肥料中添加菌株的最適營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為菌株在土壤環(huán)境中的生存和定殖提供營(yíng)養(yǎng)。本研究鑒定的解淀粉芽孢桿菌HNU1菌株可為開發(fā)重金屬污染修復(fù)菌種提供參考，對(duì)重金屬污染土壤修復(fù)和改良具有重大意義。