張凱曄, 劉曉琳, 董小燕,3, 劉潤進, 賀立恒, 解志紅,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 山西 太谷 030801；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003；3.中科院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071; 4.青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院, 山東 青島 266000)

內(nèi)生菌是與植物共生的微生物，通常指的是至少某一個生活史階段與植物共生的微生物，內(nèi)生菌主要包括真菌、細菌和放線菌[1]。內(nèi)生菌在植物生長發(fā)育、抗逆境脅迫以及生態(tài)適應中具有重要的功能[2]。例如，用具有ACC酶活性的內(nèi)生菌Pseudomonasmigulae8R6和PseudomonasfluorescensYsS6接種番茄種子，在正常及鹽脅迫下均可以促進番茄生長，提高生物量[3]。內(nèi)生菌EnterobacterradicincitansDSM 16656具有固氮以及溶磷兩種促生特性，該內(nèi)生菌不僅可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，而且該內(nèi)生菌還可以通過刺激擬南芥水楊酸/乙烯信號途徑來提高植物抗病性[4]。由以上研究結(jié)果可見，內(nèi)生菌是巨大的植物促生菌資源庫，分離培養(yǎng)內(nèi)生菌可以應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，具有廣闊的前景。田菁(S.cannabina)為豆科田菁屬一年生草本植物，其鮮草養(yǎng)分十分豐富，作為改善土壤肥力的綠肥作物被廣泛種植。田菁根系發(fā)達，抗旱、抗病蟲害能力較強，且具有較強的耐鹽堿、耐洪澇能力[5]。田菁的根際微生物和內(nèi)生菌對于其抗逆性具有重要作用。田菁根瘤菌主要分布于Ensifer、Neorhizobium和Rhizobium三個屬[6]。普通田菁大約苗齡10 d主根開始結(jié)瘤，在長達120 d固氮周期中[7]，其主根側(cè)根均有根瘤形成，所以其固氮能力較高，現(xiàn)已被廣泛應用到鹽堿地改良中。

種子表面與內(nèi)部攜帶有豐富的微生物種群，可作為多種有益細菌和病原菌的載體，且內(nèi)生菌的數(shù)量對種子的發(fā)育具有重要作用。馬同鎖等[8]研究發(fā)現(xiàn)，油菜種子內(nèi)生菌數(shù)量與萌發(fā)率相關(guān)，內(nèi)生菌數(shù)量下降萌發(fā)率降低。內(nèi)生菌不僅可以影響種子的萌發(fā)，種子對內(nèi)生菌的生長也具有調(diào)控作用，吳欣等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加種子提取物后內(nèi)生菌的生長態(tài)勢，菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性也隨之提高。IAA能促進植物伸長，是常見的植物激素，同時也是植物生長發(fā)育調(diào)控的重要信號分子[10]；而溶磷菌則可以將土壤中植物難以吸收的不溶性磷元素轉(zhuǎn)化為可吸收型磷元素，促進植物生長[11]；鐵載體不僅可以幫助植物吸收土壤中鐵元素，而且可以通過與病原菌競爭鐵離子的吸收來達到拮抗作用[12]。外源接種具有促生特性的種子內(nèi)生菌可以促進植物的生長，如Verma等[13]研究發(fā)現(xiàn)，具有IAA產(chǎn)生能力、溶磷能力和拮抗病原菌Fusariumoxysporu的水稻種子內(nèi)生菌可以促進根毛的發(fā)育和種子的生長以及活性氧的產(chǎn)生。在種子萌發(fā)過程中，內(nèi)生菌移動至種子際開始定殖在種子表面和植物根部[14]。田菁所生存的鹽堿地土壤結(jié)構(gòu)差，主要表現(xiàn)為土壤板結(jié)，且擁有特殊的微生物群落[15]。在田菁早期成長過程中伴隨著種子萌發(fā)，內(nèi)生菌以及周圍環(huán)境中的微生物逐漸定殖到根部，形成根際微生物。種子內(nèi)生菌作為在植物早期發(fā)育過程中的共生細菌，對于植物生長具有重要意義，然而田菁種子內(nèi)生菌中是否有促生菌以及其促生機制還不清楚。因此，深入探究田菁種子內(nèi)生菌的促生特性可以為田菁改良鹽堿地的田間應用提供理論依據(jù)。

本研究從普通田菁種子中分離篩選到了79株菌株，其中34株具有IAA分泌能力，對其中的6株進行16S rRNA基因序列分析，確認了它們的系統(tǒng)發(fā)育地位，并測定了溶磷能力和鐵載體合成能力，通過浸種發(fā)芽試驗進一步檢測內(nèi)生菌的促生作用。本研究主要目的是探究普通田菁種子內(nèi)生菌的種類及內(nèi)生菌對種子發(fā)育所起的作用，同時挖掘促生菌用于生產(chǎn)實踐，旨在為微生物菌肥的研發(fā)與應用奠定試驗基礎。

1 材料和方法

1.1 田菁種子

普通田菁(S.cannabina)品種為魯菁一號，種子由山東省農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.2 培養(yǎng)基

①LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、酵母膏5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、瓊脂 10～20 g·L-1、pH 7.0～7.5。

②高氏一號培養(yǎng)基[16]：可溶性淀粉20 g·L-1、NaCl 0.5 g·L-1、KNO31 g·L-1、K2HPO4·3H2O 0.5 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、FeSO4·7H2O 0.01 g·L-1、瓊脂10～20 g·L-1、pH 7.2。

③Pikovskava無機解磷培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g·L-1、(NH4)2SO40.5 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1、FeSO4·7H2O 0.3 g·L-1、MnSO4·7H2O 0.03 g·L-1、Ca3(PO4)25 g·L-1、、pH 7.0～7.5，固體培養(yǎng)基添加瓊脂15.0～18.0 g·L-1。

④CAS培養(yǎng)基[17]：鉻天青S 0.012 g、FeCl3溶液 10 mmol·L-1、HTDMA 0.015 g·L-1、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)6.04 g·L-1、瓊脂3.2 g·L-1、CaCl2溶液0.11 g·L-1、MgSO4·7H2O溶液0.25 g·L-1、20%葡萄糖、10%水解酪素、KH2PO415 g·L-1、NaCl 25 g·L-1、NH4Cl 50 g·L-1。

1.3 菌種分離

挑選田菁種子0.5 g，75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～5次，10%次氯酸鈉浸泡處理10 min，無菌水沖洗3～5次。由于田菁種子質(zhì)地較堅硬，用磷酸緩沖液(NaCl 8 g·L-1、KCl 0.2 g·L-1、Na2HPO41.44 g·L-1、KH2PO40.24 g·L-1、pH 7.4)浸種48 h，然后進行研磨，取勻漿上清液1 mL稀釋為10-1～10-7，分別取100 μL涂布LB和高氏一號固體平板，每個稀釋梯度重復三次。將固體平板置于恒溫培養(yǎng)箱30℃暗培養(yǎng)。待菌株長成菌落后挑取不同菌落形態(tài)和大小的菌株利用平板劃線法純化，待所分離菌株菌落形態(tài)一致，以30%甘油保藏菌種。

1.4 16S rRNA擴增

采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG)和1492R(5’-GGTTACCTTGTT-ACGACTT)擴增16S rRNA序列，引物由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴增體系：模版1 μL，引物各1 μL，2×EasyTaqPCRSuperMix 8 μL，加水補足20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保溫。獲得序列經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交睿博興科進行測序，獲得拼接序列后在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，選取同源性較高模式菌株序列使用MEGA X 10.0.5進行序列比對構(gòu)建進化樹。

1.5 內(nèi)生菌株產(chǎn)IAA能力測定

將所分離的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h。隨后將菌液以1%接菌量轉(zhuǎn)接至含色氨酸(200 mg·L-1)LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h[18]。將菌株培養(yǎng)液8 000 r·min-1離心1 min，取上清液與Salkowski比色液(0.5 mol·L-1FeCl3溶液10 mL，35% HClO4500 mL)等量混合，暗處放置30 min后觀察顯色情況，空白對照為未接菌的培養(yǎng)基與比色劑的混合液。與對照相比培養(yǎng)液變色的為陽性反應結(jié)果，即該菌株可分泌IAA。

配置100 mg·L-1IAA儲藏液，配置濃度為0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg·L-1的系列標準液。取各標準液2 mL，分別加入Salkowski試劑。置于恒溫培養(yǎng)箱40 ℃避光保溫30 min，酶標儀(TECAN Infinite, M200PRO)測量OD530(optical density, OD)，繪制標準曲線。

選取定性實驗呈陽性的菌株接種至含L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)4 d。取菌液2 mL于離心管，10 000 r·min-1離心10 min，取100 μL上清液加入96孔板，加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30 min顯色，以酶標儀測定其OD530。利用標準曲線可得單位體積發(fā)酵液IAA的含量。

1.6 內(nèi)生菌株解磷能力測定

將分離得到的內(nèi)生菌接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h，用打孔器在Pikovskava無機解磷固體培養(yǎng)基上打直徑約為0.5 cm的孔[19]，將菌液點入，30 ℃培養(yǎng)7 d，菌落周圍出現(xiàn)透明圈即為陽性。

采用鉬銻扛顯色法[20]定量測定溶解無機磷。①配置5 mg·L-1的磷標準溶液，比色管中加入1 mL鉬銻抗顯色劑，吸取不同量磷標準液于比色管中，加入1 mL鉬銻抗顯色劑，蒸餾水定容至10 mL?；靹蜢o置15～20 min，以酶標儀測量各反應液OD700。根據(jù)測量結(jié)果繪制磷標準曲線。②選取無機磷平板實驗的陽性菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)1 d。將菌液接種于無機磷培養(yǎng)基，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液8 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL加1 mL鉬銻抗顯色劑，超純水定容至10 mL，混勻靜置20 min，測量反應液OD700。用標準曲線可得發(fā)酵液的溶磷濃度。

1.7 內(nèi)生菌產(chǎn)鐵載體的測定

將六株內(nèi)生菌菌懸液點接至CAS培養(yǎng)基，每次5 μL，30 ℃培養(yǎng)48 h，設3個重復。觀察菌株生長，菌落周圍出現(xiàn)橙黃色暈圈即為可合成鐵載體。

1.8 內(nèi)生菌促生效果檢測

將所選菌株接種于LB培養(yǎng)基30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h，分別調(diào)節(jié)菌液OD600為0.25、0.50、1.00作為三種浸種液，以LB培養(yǎng)基(0)為對照。選擇飽滿形狀均一的魯菁一號田菁種子，表面消毒后，分別用不同菌株不同OD的菌懸液、LB液體培養(yǎng)基浸種1 h，每個處理處理約30粒種子，每個處理處理設置三個重復[21]。將種子放置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入10 mL滅菌水，置于恒溫培養(yǎng)箱30℃暗培養(yǎng)。觀察每日發(fā)芽情況。發(fā)芽數(shù)連續(xù)3 d不變之后停止統(tǒng)計。內(nèi)生菌對種子萌發(fā)和幼苗的影響主要有以下指標需要測量[22]。

發(fā)芽勢(GE)=種子發(fā)芽達到最高峰的發(fā)芽粒數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

活力系數(shù)(VI)=幼苗生長勢(種苗全長)×發(fā)芽指數(shù)

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

式中，Gt為第t天發(fā)芽數(shù)，Dt為相應發(fā)芽天數(shù)。

1.9 內(nèi)生菌對種子胚根發(fā)育的影響

從每個處理組及對照組隨機選取10株測量其幼苗全長和胚根長度，計算胚根占全長的百分比，作為種子胚根的發(fā)育指標。

1.10 數(shù)據(jù)處理

所獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果使用Excel 2017記錄及繪制圖表，并使用SPSS Statistic 20統(tǒng)計分析。采用ANOVA進行同一內(nèi)生菌處理內(nèi)顯著性分析，采用Duncan法兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離鑒定和實驗菌株的篩選

經(jīng)分離篩選，共得到79株內(nèi)生菌。將內(nèi)生菌的16S rRNA序列通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，分離獲得的內(nèi)生菌主要屬于Bacillus、Azorhizobium、Cellulosimicrobium三個屬。其中Cellulosimicrobium2株、Bacillus38株、Azorhizobium39株。通過檢測發(fā)現(xiàn)共有34株具有產(chǎn)IAA活性，IAA產(chǎn)量范圍為(1.285±0.1911)～(25.47±1.873)mg·L-1。在具有IAA合成能力的內(nèi)生菌中,Azorhizobium占比85.3%，Bacillus和Cellulosimicrobium分別占比11.7%、3%。IAA產(chǎn)量最高為菌株SC60，最低為菌株SC37。從這34株IAA合成菌株中選出SC5、SC17、SC24、SC45、SC59、SC60菌作為試驗對象。6株內(nèi)生菌IAA產(chǎn)量如表1所示,產(chǎn)量在(8.922±0.096)～(25.47 0±1.873)mg·L-1內(nèi)。

表1 內(nèi)生菌的IAA產(chǎn)量

2.2 菌株16S rRNA分析

通過16S rRNA序列比對，獲取實驗菌株及與實驗菌株相似性高的代表菌株16S rRNA序列，構(gòu)建發(fā)育系統(tǒng)樹,如圖1所示。從圖1可得知，SC5、SC17以及SC24與AzorhizobiumcaulinodansORS571的16S rRNA序列相似度最高，聚類于一支，序列相似性均高于99%。SC45、SC59、SC60與BacillusvelezensisCR-502聚類于一支，且三株菌與其序列相似性均高于99%。一般設定16S rRNA序列相似性超過97%的原核生物屬于一個種[23]。因此，SC5、SC17、SC24屬于Azorhizobiumcaulinodans，SC45、SC59、SC60屬于Bacillusvelezensis。

圖1 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.3 內(nèi)生菌促生特性

定殖在根際的微生物通常會發(fā)揮其促進植物生長的特性，比如調(diào)節(jié)植物激素水平、溶磷、產(chǎn)氨氣以及產(chǎn)鐵載體等[24]。為了進一步探究所篩選的菌株的促生特性，本研究檢測了所選6株菌的溶磷能力和產(chǎn)鐵載體能力。

2.3.2內(nèi)生菌鐵載體合成能力 鐵載體是微生物在限鐵條件下產(chǎn)生的小分子有機物，其結(jié)構(gòu)復雜，可以特異性結(jié)合鐵離子。經(jīng)證明鐵載體可以增強細菌和植物對鐵離子的吸收。6株內(nèi)生菌只有SC45可產(chǎn)鐵載體(表2)，SC45經(jīng)過CAS平板培養(yǎng)后產(chǎn)生了黃色暈圈，而不產(chǎn)鐵載體菌株點接后的陰性對照沒有變化(圖2)，由此證明SC45具有分泌鐵載體到環(huán)境中的能力。

圖2 CAS平板檢測產(chǎn)鐵載體

表2 內(nèi)生菌的促生功能

2.4 內(nèi)生菌對田菁種子的促生作用

種子萌發(fā)是植物生命周期的開始，種子萌發(fā)后環(huán)境微生物和內(nèi)生菌定殖在植物，可用種子萌發(fā)試驗來判斷所接種的菌株是否具有促生效果。本研究主要檢測了種子萌發(fā)的發(fā)芽勢、種子活力系數(shù)和胚根占比。

2.4.1內(nèi)生菌浸種對發(fā)芽勢的影響 發(fā)芽勢高代表種子萌發(fā)的較為快速且集中，有利于作物的生長，尤其在逆境脅迫下統(tǒng)一快速的出苗生長有利于植物適應外界環(huán)境，也有利于機械化的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。經(jīng)過不同濃度菌液浸種處理，內(nèi)生菌對種子發(fā)芽勢的影響如圖3所示，SC17浸種處理，在浸種菌液OD600為0.50和0.25時,田菁種子的發(fā)芽勢顯著提高，分別比OD600為0.00時提高了38.6%和36.3%(P<0.05)。由此可見，用SC17浸種會顯著促進種子萌發(fā)，其余菌株浸種對種子的發(fā)芽勢無顯著影響。

注：*代表與對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4.2內(nèi)生菌浸種對種子活力系數(shù)的影響 從圖4可得知，SC59和SC17浸種處理種子，種子活力在浸種菌液OD600為0.50，比CK(OD600=0.00)顯著提高了29.9%和26.7%；SC45和SC60在浸種菌液OD600為0.25時可顯著提高田菁種子的活力系數(shù)，分別可提高13.3%和14.1%；在較高濃度下，對種子活力系數(shù)影響不顯著。SC24和SC5浸種對種子活力系數(shù)影響不顯著。

注：*代表與對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4.3內(nèi)生菌浸種促進了胚根的發(fā)育 胚根的生長情況與植物的萌發(fā)和生長相關(guān)[25]，促進胚根的發(fā)育有利于促進植物的早期生長。內(nèi)生菌浸種對幼苗胚根發(fā)育的影響如圖5所示。SC60在浸種菌液以OD600為0.50、0.25浸種后促進胚根的發(fā)育，胚根占幼苗全長的比例分別比CK(OD600=0.00)提高了29.5%、16.1%。以菌株SC17浸種菌液OD600為0.25浸種亦可促進胚根的發(fā)育，與對照相比，胚根占全長比例提高了13%。其余菌種浸種對胚根發(fā)育未見顯著性影響。

注：*代表與對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

本研究分離到的菌株分布于三個屬：Bacillus、Azorhizobium、Cellulosimicrobium。分離到的菌株相較于根際微生物或者是其余組織的內(nèi)生菌數(shù)量較少，這可能與田菁種子發(fā)育后期高滲透壓的環(huán)境[26]和分離過程中所選用的培養(yǎng)基種類較少相關(guān)。所分離到的菌株中Cellulosimicrobium屬于放線菌，在以往研究中該屬的菌株具有耐鹽堿及重金屬的特性，其與田菁耐鹽堿之間的相關(guān)性需要深入研究探索。

在種子萌發(fā)過程中，各種激素扮演著重要的作用。其中IAA與小分子物質(zhì)KARs協(xié)同作用，調(diào)控著種子的萌發(fā)[27]，適量的外源IAA可以促進種子的萌發(fā)，IAA影響植物的側(cè)根發(fā)育、細胞分裂以及細胞延長[28]。分離自龍葵根際微生物的PGPB菌株Bacillussubtilis和Bacilluscereus均具有分泌IAA能力，可促進植物的生長[29]。因此，本文選取了6株可分泌IAA的菌株進行了研究，其中3株具有溶解無機磷能力，1株具有產(chǎn)鐵載體能力。植物在自然界中只可以利用礦質(zhì)肥料中20%～30%的磷肥，這是由于礦物質(zhì)磷肥在自然界中會和其他元素結(jié)合，例如鈣元素。使用具有溶磷能力的細菌可以使植物獲得更多的有效磷元素[30]。從香蕉根部分離的溶磷細菌溶解Ca3(PO4)2的能力在2～15.12 mg·L-1[31]，相較于本研究所選取的菌株溶磷能力較低。溶磷菌Bacillussp.具有產(chǎn)鐵載體能力(16.06 mg·L-1)和產(chǎn)IAA能力(30.58 mg·L-1)，接種薄荷后可以提高植物的鮮重和干重，提高出油率[32]。本研究所選取的菌株均可產(chǎn)IAA，部分內(nèi)生菌具有溶磷和合成鐵載體特性。

通過種子發(fā)芽試驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌浸種可以提高種子萌發(fā)的發(fā)芽勢和種子活力系數(shù)，促進胚根的發(fā)育。該結(jié)果與核桃內(nèi)生菌XHE8對紅莧菜種子萌發(fā)的影響結(jié)果[33]相似，內(nèi)生菌雖然對種子萌發(fā)的影響不顯著，但促進了種子幼芽和根的發(fā)育。種子活力是一個重要的種子生理指標，對于快速統(tǒng)一的種子發(fā)育以及延長種子的儲存壽命有重要意義，最關(guān)鍵的是種子活力高可以幫助種子抵御萌發(fā)中的脅迫以及可以提高種子的耐儲存性[34]。本研究計算種子活力選用的是幼苗全長，種子活力高代表在一定時間內(nèi)，幼苗生長受到了促進。干旱[35]、鹽、重金屬會抑制植物胚根的生長進而抑制植物生長，反之促進胚根發(fā)育可以促進植物的生長。

本研究分離的菌株中，SC60和SC17顯著促進了胚根發(fā)育和提高了種子活力，有利于種子統(tǒng)一快速出苗和幼苗的生長。SC60解磷能力較高，在后續(xù)植物的生長過程中有利于與植物吸收環(huán)境中的磷元素。因此，SC60可作為潛在的促生菌，用于提高種子活力促進幼苗發(fā)育和植物生長，具有一定的應用價值，可作為潛在綠色肥料。