谷艷茹，韓秉君，黃繼元，楊鳳霞*，張克強*

在畜禽養(yǎng)殖過程中，抗生素因具有預(yù)防疾病、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動物生長等功效，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)被廣泛應(yīng)用[1]。據(jù)統(tǒng)計，2013年我國抗生素使用總量約16.2萬t，其中獸用抗生素占一半以上，高達(dá)52%[2]。獸用抗生素濫用會導(dǎo)致動物腸道內(nèi)產(chǎn)生大量含有抗生素耐藥基因（ARGs）的耐藥性細(xì)菌，進(jìn)而增加疾病的治療難度[3]?，F(xiàn)如今我國推行畜禽糞污的還田利用，而大量的耐藥性細(xì)菌和耐藥基因隨著糞污排出動物體外[4]，并以糞肥、肥水的形式進(jìn)入農(nóng)田土壤，最終危害人類健康[5]。

抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的長期、大量使用，導(dǎo)致我國畜禽環(huán)境中ARGs污染形勢十分嚴(yán)峻。Ji等[6]在規(guī)?；i場和牛場糞污中檢測到磺胺類耐藥基因（sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ和sul A）和四環(huán)素類耐藥基因（tet O、tet W、tet M和tet B），其中sul A、sul1和tet W在兩種糞污中均顯示較高豐度；Mu等[7]在規(guī)?；u場糞污中發(fā)現(xiàn)喹諾酮類耐藥基因oqx B和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm B，其絕對濃度分別達(dá) 3.5×1010、2×109copies·g-1；此外，在大規(guī)模養(yǎng)殖的豬場和雞場糞污中也有研究[8]調(diào)查了氨基糖苷類、氯霉素類和萬古霉素類等耐藥基因，結(jié)果顯示各類耐藥基因在所測樣本中均有檢出。值得關(guān)注的是，在規(guī)模化養(yǎng)殖的畜禽環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了與人類健康密切相關(guān)的高風(fēng)險耐藥基因。如有學(xué)者在部分雞場糞污中檢出了絕對豐度高達(dá)106～107copies·g-1的blaTEM[9]；同時Yang等[10-11]在規(guī)模化豬場糞污中還發(fā)現(xiàn)了blaOXA-1、blaTEM-1、blaGES-1等十余種β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，并證實豬場糞污是高風(fēng)險耐藥基因blaNDM和mcr-1的重要儲庫。另外，近年來畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中具有多重耐藥性的“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)[12]，進(jìn)一步凸顯了養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌耐藥問題的嚴(yán)重性。

目前，畜禽糞污中ARGs的污染問題已引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，相關(guān)報道亦陸續(xù)增多。然而現(xiàn)有報道主要集中在規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染研究，而有關(guān)家庭農(nóng)場畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染規(guī)律及其對農(nóng)田環(huán)境的影響尚不清楚，仍缺乏相關(guān)的研究數(shù)據(jù)?，F(xiàn)如今，家庭農(nóng)場畜禽養(yǎng)殖是我國鄉(xiāng)村地區(qū)的主要養(yǎng)殖方式，具有養(yǎng)殖場數(shù)量多、養(yǎng)殖地點分散、抗生素使用不規(guī)范、糞污收集困難且缺乏后續(xù)處理設(shè)施等特點[13]。其產(chǎn)生的糞污未經(jīng)處理或者處理不當(dāng)而隨意排放給農(nóng)村生態(tài)環(huán)境造成了巨大壓力，由此引起的環(huán)境污染日益嚴(yán)重，對公共健康的危害不容忽視。因此，解析家庭農(nóng)場養(yǎng)殖糞污中ARGs污染情況及其潛在的環(huán)境風(fēng)險，對于全面了解和控制我國畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染亦十分必要。

天津市薊州區(qū)家庭農(nóng)場具有分布廣、數(shù)量多（600～700家）、養(yǎng)殖畜種豐富等特點，是研究家庭農(nóng)場的典型區(qū)域。因此，本研究選取天津市薊州區(qū)22家糞污還田達(dá)2年以上的具有代表性的家庭農(nóng)場（8家豬場、8家牛場和6家雞場）作為考察對象，采用實時熒光定量PCR方法對養(yǎng)殖糞污及施用糞肥的農(nóng)田土壤中ARGs進(jìn)行了全面調(diào)查。比較天津市薊州區(qū)家庭農(nóng)場不同畜種間常見ARGs的污染特征及差異性；詳細(xì)分析不同畜種及其周邊環(huán)境中常見ARGs的多樣性及污染水平；特別針對與人類健康密切相關(guān)的高風(fēng)險β-內(nèi)酰胺類ARGs和多黏菌素耐藥基因mcr-1，評估其在家庭農(nóng)場中的分布及污染狀況；探討家庭農(nóng)場畜禽糞肥的施用對農(nóng)田土壤中ARGs的影響及存在的環(huán)境風(fēng)險。本研究提供了家庭農(nóng)場畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中各類抗生素耐藥基因的綜合概況，為家庭農(nóng)場畜禽養(yǎng)殖過程中獸用抗生素的管理和使用提供參考，以期減輕這些高風(fēng)險耐藥決定因子的傳播。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品于2018年冬季在天津市薊州區(qū)（北緯39°45'～40°15'，東經(jīng)117°05'～117°47'）22家典型的家庭農(nóng)場內(nèi)采集，包括8家豬場、8家牛場和6家雞場，共38個糞便樣品和44個土壤樣品。糞便樣品主要采自舍內(nèi)新鮮糞便，試驗土壤為施用糞肥2年以上的農(nóng)田土壤，對照土壤則是在同區(qū)域未施用糞肥或少有人活動的地方采集。養(yǎng)殖場分布的詳細(xì)信息見圖1。

1.2 樣品采集及預(yù)處理

根據(jù)糞堆的大小分別收集3～5個糞便樣本，采樣方法按照《畜禽糞便監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（GB/T 25169—2010）操作。土壤樣品采用梅花采樣法采集0～15 cm耕層土壤，采樣方法按照《農(nóng)田土壤環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（NY/T 39—2012）操作。將糞便和土壤樣品使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行處理后，將等量的離散子樣品混合，并通過2 mm的網(wǎng)篩制備復(fù)合樣品。樣品預(yù)處理完成后于-20℃保存至實驗室，等待DNA提取。

1.3 DNA提取及PCR反應(yīng)

圖1 天津市薊州區(qū)養(yǎng)殖場分布圖Figure 1 Distribution map of livestock farms in Jizhou area of Tianjin

采用Fast DNA SPIN Kit for soil試劑盒（MPBiomedicals，LLC，Santa Ana，CA，美國）按操作手冊對0.5 g糞便和0.5 g土壤進(jìn)行DNA提取，采用超微量紫外可見光分光光度計檢測DNA樣品純度。對每個DNA模板進(jìn)行普通PCR檢測，PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix（TransGen Biotech，Beijing，China）、上下游引物各 0.5 μL（10 μmol·L-1）、0.5 μL DNA模板和11μL ddH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)包括95℃變性30 s，退火30 s（退火溫度詳見表1），72 ℃延伸30 s至1 min。特異性引物詳細(xì)信息見表1。最后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有目的基因，詳細(xì)步驟見參考文獻(xiàn)[14]。

1.4 實時熒光定量PCR

本研究對21個ARGs進(jìn)行qPCR檢測，使用儀器7500實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems美國）進(jìn)行實時qPCR分析。將提取的DNA樣品稀釋10倍，qPCR反應(yīng)體系為20μL，包括10.0μL TB Green Premix Ex Taq（Tli RNase H Plus，Takara）、上下游引物各 0.4μL、0.4μL ROX Reference DyeⅡ、6.8μL ddH2O和2μL DNA模板。兩步法qPCR擴(kuò)增過程如下：預(yù)變性95℃持續(xù)30 s，隨后是40個循環(huán)包括95℃變性5 s，60℃退火/延伸持續(xù)34 s，熔點曲線分析在60～95℃之間進(jìn)行。每個DNA模板設(shè)置3個平行，無菌水為陰性對照，qPCR反應(yīng)程序和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)[10]。最終換算為樣品中耐藥基因的相對濃度（ARGs copies/16SrRNA gene copies）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析，以P＜0.05作為差異顯著水平。采用R軟件的pheatmap制作熱圖，RStudio軟件的Boxplot制作箱線圖，利用Origin 2017繪制了土壤分析柱狀圖。數(shù)據(jù)的相對豐度、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計算均使用Excel 2007。

2 結(jié)果與討論

2.1 家庭農(nóng)場養(yǎng)殖糞污中常見耐藥基因的總體污染特征及差異性

為了研究家庭農(nóng)場畜禽糞污中ARGs的污染特征及分布規(guī)律，本文在薊州區(qū)選取22家典型的養(yǎng)殖場（包括牛場、雞場和豬場），針對常見的5類典型抗生素的15種ARGs進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查。從耐藥基因的賦存來看（圖2），磺胺類耐藥基因（sul1和sul2）、四環(huán)素類耐藥基因（tet O、tet Q、tet W、tet X和tet L）、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（erm B和erm C）和鏈霉素類耐藥基因（aad A、str A和str B）遍及所有樣品，檢出率為100%（38/38）；而喹諾酮類耐藥基因qnr S、qnr B和oqx B的檢出率為73%（28/38）、94%（36/38）和92%（35/38），由此可見，磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和鏈霉素類耐藥基因在家庭農(nóng)場畜禽糞污中存在范圍最廣。這主要是因為這幾類抗生素具有抗菌廣、見效快和價格低廉等優(yōu)點，被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)，導(dǎo)致其相應(yīng)的ARGs在畜禽糞污中蓄積[20]。

表1 PCR引物的詳細(xì)信息Table 1 The detail information of PCRprimer

圖2 家庭農(nóng)場畜禽養(yǎng)殖糞污及其周邊土壤中ARGs的相對豐度Figure 2 The relative abundance of ARGs in livestock waste and surrounding soils from family farms

值得注意的是，喹諾酮類耐藥基因（oqx B、qnr S和qnr B）在豬場糞污中不僅檢出率為100%，其污染水平（10-6～10-3）也顯著高于雞場（10-7～10-4）和牛場（10-8～10-6）（P＜0.05），其原因可能是動物飼料中該類抗生素的添加方式不同，以及不同畜種間腸道菌群存在差異[21]。然而，喹諾酮類以外的其他類耐藥基因在雞場糞污中的相對豐度（10-4～10-2）卻比豬場（10-5～10-2）和牛場（10-6～10-3）更為嚴(yán)重，這與規(guī)?；B(yǎng)殖場不同畜禽糞污中ARGs的賦存特征一致[8]。雞的養(yǎng)殖密度大且銷售周期短，使用的抗生素劑量遠(yuǎn)高于豬場和牛場；另外，與哺乳動物豬和牛相比，雞的消化功能較差，容易造成腸道內(nèi)抗生素的殘留，為耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生提供了有利條件[22]，由此導(dǎo)致雞場中ARGs污染嚴(yán)重。此外，調(diào)查還發(fā)現(xiàn)在同一養(yǎng)殖場不同豬群的發(fā)育階段中ARGs的多樣性與豐度也有所不同，例如母豬糞中 ARGs的污染水平（10-3～100）顯著高于育肥豬（10-3～10-5）和仔豬（10-4～10-2）（P＜0.05），這可能與其飼料配比、使用劑量和頻率的差異有關(guān)[6]。

2.2 不同家庭農(nóng)場養(yǎng)殖糞污中常見抗生素耐藥基因的污染分析

不同畜禽糞污中耐藥基因的相對含量如圖3所示。在雞場糞污中（圖3A），除了喹諾酮類ARGs，其他類耐藥基因均以高濃度普遍存在。其中，sul1、sul2、tet O、tet Q、tet W、tet L、tet X、str A、str B、aad A、erm B和erm C賦存水平相對較高，數(shù)量級高達(dá)10-3～100；而喹諾酮類耐藥基因qnr B、qnr S和oqx B的相對豐度僅為10-7～10-4。特別值得注意是，磺胺類耐藥基因sul1和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm B在雞場糞污中的豐度顯著高出其他類耐藥基因（P＜0.05），達(dá)到10-2～100，其污染最為嚴(yán)重的原因可能是sul1位于可移動遺傳元件int1和int2上，可以促進(jìn)sul1在微生物群落中的持久性[23]；以及類似Tn1545-like轉(zhuǎn)座子的移動基因元件可促進(jìn)erm B在不同介質(zhì)間轉(zhuǎn)移，提高了其在糞污環(huán)境中的污染水平[24]。此外，關(guān)于四環(huán)素類ARGs的研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制的基因含量高于其他表達(dá)機(jī)制[25]，而在本研究中表達(dá)核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制的基因tet O、tet Q、tet W與編碼外排泵基因tet L和酶修飾基因tet X的相對豐度卻在同一污染水平（10-3～10-1）；tet L和tet X濃度偏高的原因可能是薊州區(qū)雞場糞污環(huán)境與其傳播機(jī)制相互作用的結(jié)果。另外，從污染水平來看，還發(fā)現(xiàn)家庭農(nóng)場的雞場糞污中耐藥基因的豐富度高于規(guī)?；u場糞污，如Mu等[7]在天津市規(guī)?；u場中的調(diào)查結(jié)果顯示四環(huán)素類耐藥基因tet W和tet X豐度水平為10-2～10-1，而本研究中相應(yīng)的四環(huán)素類耐藥基因的最高含量卻達(dá)到了100；同時sul1和erm B的污染水平也比規(guī)?；u場中相應(yīng)耐藥基因的水平高出1～2個數(shù)量級[26]。

與雞場糞污中ARGs不同的是，豬場糞污中所有耐藥基因包括喹諾酮類ARGs普遍存在（圖3B），且tet O、tet Q、tet W、tet X、tet L和erm B的污染相對較嚴(yán)重，其水平高達(dá)10-3～100。從圖2B還可以明顯看出，四環(huán)素類耐藥基因tet O和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm B在豬場糞污中的相對水平顯著高出其他類耐藥基因，均達(dá)到10-2～100。其中tet O普遍存在偶聯(lián)質(zhì)粒上，增加了其水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[27]；erm B的宿主菌如腸球菌等在糞污中廣泛分布[24]，由此導(dǎo)致tet O和erm B含量偏高。從四環(huán)素的抗性機(jī)制角度分析，發(fā)現(xiàn)豬糞中編碼核糖體保護(hù)蛋白基因tet O、tet Q和tet W的相對含量（10-2～100）顯著高于編碼外排泵基因tet L（10-3～10-2）和酶修飾基因 tet X（10-3～10-1）（P＜0.05），這可能由于核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制是動物胃腸道中四環(huán)素抗性的主導(dǎo)機(jī)制，且與接合質(zhì)粒和整合子等密切相關(guān)造成的[27]，同時該規(guī)律與Chen等[23]研究結(jié)論一致。此外，雖然喹諾酮類ARGs在豬場糞污中均有檢出，但其污染水平不高，僅為10-7～10-4；qnr S和qnr B同為質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因[28]，而前者的污染水平（10-5～10-3）顯著高于后者（10-7～10-5）（P＜0.05），其原因可能是本試驗所測的區(qū)域環(huán)境不利于相應(yīng)菌落的生長繁殖。有學(xué)者對規(guī)模化豬場ARGs的分析中發(fā)現(xiàn)，erm B、str A、sul1、tet O、tet Q、tet W和tet X的污染較嚴(yán)重，相對含量在10-6～10-1范圍內(nèi)[8，29]，而上述基因在家庭豬場中的污染水平均較高，最高達(dá)100。薊州區(qū)家庭農(nóng)戶主要依靠經(jīng)驗養(yǎng)殖，養(yǎng)殖技術(shù)不完善、不規(guī)范和不標(biāo)準(zhǔn)，這是其污染較重的主要原因[30]。

相比于雞場和豬場，牛場糞污中各類耐藥基因的污染水平稍低，其相對豐度范圍為10-6～10-1（圖3C）。四環(huán)素類耐藥基因tet O、tet Q、tet W和tet X在牛場糞污中的相對豐度最高，可達(dá)10-2～10-1；磺胺類基因（sul1和sul2）、大環(huán)內(nèi)酯類基因（erm B和erm C）和鏈霉素類基因（aad A、str A和str B）的污染水平次之，相對濃度為 10-4～10-2。tet L（10-6～10-4）的相對含量顯著低于其他四環(huán)素類耐藥基因，原因可能是tet L在牛場糞污中的相關(guān)菌屬內(nèi)分布有限。此外，喹諾酮類耐藥基因在牛場糞污中的污染水平相比于其他類的耐藥基因亦是最低，僅為10-8～10-6，這與雞場和豬場結(jié)果相似。原因可能是牛本身對喹諾酮類抗生素攝入較少導(dǎo)致糞污中的含量最低。

2.3 高風(fēng)險耐藥基因在家庭農(nóng)場養(yǎng)殖糞污中的污染情況及賦存規(guī)律

本研究針對家庭農(nóng)場畜禽糞污中高風(fēng)險的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（bla基因）和多黏菌素耐藥基因mcr-1進(jìn)行了詳細(xì)調(diào)查。高風(fēng)險耐藥基因在家庭農(nóng)場畜禽糞污中的分布情況見圖2。從圖中可知，blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1在家庭農(nóng)場（豬、雞和牛）中存在普遍，檢出率均為100%（38/38）；此外，mcr-1和blaNDM也有較高的檢出率，分別達(dá)84%（32/38）和76%（29/38）；而blaGES-1的檢出數(shù)量僅占總樣品的39%（15/38）。以上結(jié)果表明高風(fēng)險bla基因中blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1在家庭農(nóng)場畜禽糞污中較為常見，意味著這些基因及其宿主細(xì)菌在目標(biāo)養(yǎng)殖場存在高普遍性。

圖4表示養(yǎng)殖糞污中高風(fēng)險耐藥基因的相對含量。如圖所示，除blaGES-1外，3種糞污中高風(fēng)險耐藥基因 的 相 對 豐 度 大 小 一 致 為 blaampC＞blaTEM-1＞blaOXA-1＞blaNDM＞mcr-1，與本課題組Yang等[10-11]在規(guī)?；B(yǎng)殖場報道的結(jié)果類似。其中blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1在豬場、雞場和牛場糞污中均為主導(dǎo)基因，且相對豐度較高，分別達(dá) 10-5～10-2、10-4～10-1和 10-6～10-3，與各養(yǎng)殖場中常見的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm C的污染水平相似。牛場中blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1的污染水平較低，其與不同畜禽的代謝能力及養(yǎng)殖方式的不同有著密切關(guān)系。圖2可看出，仔豬和母豬糞污中blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1的相對含量顯著高出育肥豬約1～2個數(shù)量級（P＜0.05），喂食的抗生素劑量和頻率的差異導(dǎo)致了該結(jié)果的發(fā)生。然而，與優(yōu)勢基因相比較，blaNDM和mcr-1在豬場、雞場和牛場糞污中的污染水平顯著偏低（P＜0.05），分別為 10-8～10-5、10-9～10-6和10-9～10-5。blaGES-1在牛場中未檢出，而在豬場和雞場的小部分樣品中檢出，這可能是由于相關(guān)的抗生素使用較少或牛場糞污環(huán)境不利于相應(yīng)菌群生長導(dǎo)致。同時，Yang等[10-11]在天津市規(guī)?；i場的研究中顯示，bla基因和mcr-1的相對含量范圍為10-9～10-3，而本研究中相應(yīng)的高風(fēng)險基因的最高含量卻達(dá)到了10-1。暗示著家庭農(nóng)場畜禽環(huán)境中高風(fēng)險耐藥基因污染問題的嚴(yán)重性，同時也反映出加強畜禽糞污合理化處置的必要性。

圖3 家庭農(nóng)場中不同畜禽糞污中常見ARGs的相對豐度Figure 3 Relative abundance of common ARGs in different livestock wastesfromfamily farms

圖4 不同畜禽糞污中高風(fēng)險ARGs的相對豐度Figure 4 The relative abundance of high risk ARGs in different livestock manures

2.4 家庭農(nóng)場畜禽糞肥的施用對農(nóng)田土壤中耐藥基因污染的影響

現(xiàn)如今我國推行畜禽糞污的還田利用，以改良土壤和提高土壤肥力。為了確定家庭農(nóng)場的畜禽糞肥對農(nóng)田土壤中耐藥基因的影響，本研究還對長期施用糞肥的農(nóng)田土壤展開了系統(tǒng)的調(diào)查。結(jié)果如圖2所示，在施用有機(jī)肥的土壤中抗生素耐藥基因普遍存在，其中磺胺類（sul1和sul2）、四環(huán)素類（tet O、tet Q、tet W、tet L和tet X）、大環(huán)內(nèi)酯類（erm B和erm C）、鏈霉素類（str A、str B和aad A）和高風(fēng)險的β-內(nèi)酰胺類（blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1）耐藥基因在所用樣品中均有檢出，其中相對含量最高的3種耐藥基因為sul1、sul2和tet O，均在10-4～10-2范圍內(nèi)；另外，雖然高風(fēng)險基因中blaNDM和mcr-1相對水平較低，為10-7～10-5，但其在土壤中亦分布廣泛，檢出率分別達(dá)78%和75%。土壤中ARGs的高檢出表明它們在土壤環(huán)境中存在高穩(wěn)定性，應(yīng)引起廣泛注意。喹諾酮類耐藥基因qnr S、qnr B和oqx B檢出率最低，僅分別為27%、34%和52%。該類耐藥基因在畜禽糞污中含量低是導(dǎo)致這一結(jié)果的原因之一，其二也可能是因為糞污的堆肥過程削減了部分喹諾酮類耐藥基因，但該想法需要進(jìn)一步驗證。這說明糞肥施用對農(nóng)田土壤中喹諾酮類耐藥基因的賦存影響不大。

不同畜禽糞污的處理對農(nóng)田土壤中ARGs的影響不同。通過對比未施用糞肥的對照土壤，分析糞肥施用的農(nóng)田土壤中耐藥基因的富集情況，結(jié)果如圖5所示。施用雞糞肥后的土壤中ARGs的相對豐度增加了18倍，而施用豬糞肥和牛糞肥則分別增加了14倍和8倍。由上述可得，3種糞肥的施入對土壤中ARGs影響依次為雞糞肥＞豬糞肥＞牛糞肥。該結(jié)果與不同動物糞污中ARGs的污染規(guī)律相一致，表明家庭農(nóng)場糞污中ARGs的差異是造成不同糞肥土壤中ARGs污染差異的主要原因；同時不同糞肥土壤中寄主細(xì)菌的多樣性和生存能力的差異，也可導(dǎo)致ARGs的持久性不同[8，31]。顯然，畜禽糞肥的施加可顯著增加土壤環(huán)境中抗生素耐藥基因的豐度，這與以往的研究結(jié)果相一致[32-33]。此外，不同施肥土壤中相同基因的含量也有所不同（圖2），如雞糞肥土壤中sul1、emr B和blaOXA-1的相對豐度（10-2～100）顯著高于施用豬糞肥（10-3～10-2）和牛糞肥土壤（10-4～10-3）（P＜0.05），這表明同種耐藥基因在不同土壤中的持久性也有所不同。綜上分析，除了喹諾酮類ARGs在3種不同土壤中很少檢出，且mcr-1和blaNDM濃度較低外，其他基因在施肥后的土壤中均以高濃度普遍存在，由此可充分證明家庭農(nóng)場的畜禽糞污是農(nóng)田土壤環(huán)境中抗生素耐藥基因的一個重要污染源。因此，采用有效的糞污處理技術(shù)來控制家庭農(nóng)場糞肥中耐藥基因的污染問題勢在必行。

3 結(jié)論

圖5 施用不同糞肥的土壤中ARGs的相對豐度Figure 5 Relative abundance of ARGs in soil applied different animal manures

（1）家庭農(nóng)場畜禽養(yǎng)殖糞污中常見耐藥基因污染較為普遍且存在多種耐藥機(jī)制并存的污染特點；高風(fēng)險耐藥基因在畜禽糞污中的廣泛分布，進(jìn)一步凸顯了家庭農(nóng)場畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥基因污染問題的嚴(yán)重性。

（2）不同種類畜禽糞污中抗生素耐藥基因的污染程度存在差異，且不同生長發(fā)育階段對豬糞中的耐藥基因污染存在影響。

（3）家庭農(nóng)場畜禽糞肥的施用不僅顯著增加土壤環(huán)境中耐藥基因的豐度，也增大了耐藥基因在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的擴(kuò)散風(fēng)險，同時揭示出家庭農(nóng)場的畜禽糞污是農(nóng)業(yè)環(huán)境中耐藥基因的一個重要污染源。

（4）應(yīng)加強對家庭畜禽養(yǎng)殖場的管理，并針對養(yǎng)殖密集區(qū)域集中設(shè)置糞污存儲和處置設(shè)施，如糞污處理廠和有機(jī)肥加工廠，遵循源頭減量、過程控制和末端利用的原則，實現(xiàn)糞水肥處理技術(shù)的一體化，進(jìn)而降低環(huán)境中耐藥基因的傳播風(fēng)險。