余軍楠，方 昊*，胡建林，王 壯，丁程成，袁和忠，王 瑟，崔益斌*

近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖成為我國(guó)水產(chǎn)品產(chǎn)量增長(zhǎng)的主要來(lái)源[1]，約占全球水產(chǎn)養(yǎng)殖總量的71%[2]。克氏原螯蝦作為我國(guó)廣泛流行的淡水產(chǎn)品，近年來(lái)養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量快速增長(zhǎng)。江蘇是我國(guó)主要水產(chǎn)養(yǎng)殖省份之一，2017年克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積達(dá)9.21×108m2，產(chǎn)量高達(dá)1.154×105t[3]。

在高密度的養(yǎng)殖活動(dòng)中，抗生素通常直接或與飼料一起施用于養(yǎng)殖塘中，以提高養(yǎng)殖物種的健康狀況和改善水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的環(huán)境條件[4]。大多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)與周圍水體相互連接并產(chǎn)生連續(xù)或間歇的廢水排放[5]，殘留的抗生素最終可能會(huì)釋放到周圍水生生態(tài)系統(tǒng)中。據(jù)估計(jì)，飼料中約75%的抗生素通過(guò)養(yǎng)殖物種的排泄物和未經(jīng)處理的含藥飼料浸出進(jìn)入環(huán)境[6]。一般而言，殘留抗生素對(duì)微生物（藻類）的毒性較大，對(duì)養(yǎng)殖物種（無(wú)脊椎動(dòng)物和魚(yú)類）沒(méi)有特別的毒性[7-8]。但藻類是食物鏈的基礎(chǔ)，其產(chǎn)量減少將影響整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)養(yǎng)殖物種造成間接影響。除此之外，水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的使用是擴(kuò)大抗生素耐藥性的重要途徑[9]。來(lái)自水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中殘留抗生素的持續(xù)選擇壓力可能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性細(xì)菌和抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs），并且極有利于ARGs在不同微生物之間的水平基因轉(zhuǎn)移（Horizontal gene transfer，HGT）。據(jù)報(bào)道，水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)所中ARGs的傳播與抗生素濃度之間存在顯著相關(guān)性[10]。水生環(huán)境中細(xì)菌與魚(yú)類，甲殼類和人類病原體共享遺傳相關(guān)的質(zhì)粒，整合子和轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)遺傳元件，加劇了新型抗性細(xì)菌的出現(xiàn)以及ARGs向動(dòng)物和人類群體的傳播，對(duì)人類健康造成威脅[4，9，11]。為了預(yù)防或減少抗生素污染可能造成的環(huán)境負(fù)擔(dān)和對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的影響，首先要量化水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的抗生素濃度。目前關(guān)于抗生素的研究主要集中在河流、湖泊等環(huán)境水體中[12-14]，雖然有幾項(xiàng)研究關(guān)注水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的抗生素[15-16]，但尚未有關(guān)于克氏原螯蝦養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素定量分析的公開(kāi)報(bào)告。作為全國(guó)克氏原螯蝦五大主要產(chǎn)地之一[3]，研究江蘇省克氏原螯蝦水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素的污染特征和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

本研究以江蘇典型克氏原螯蝦養(yǎng)殖區(qū)為研究對(duì)象，調(diào)查了5類（大環(huán)內(nèi)酯類MCs、四環(huán)素類TCs、β-內(nèi)酰胺類LCs、喹諾酮類QNs和磺胺類SAs）30種抗生素在養(yǎng)殖區(qū)水和沉積物中的濃度水平，揭示其分布特征和污染現(xiàn)狀，評(píng)價(jià)其潛在風(fēng)險(xiǎn)，旨在為我國(guó)克氏原螯蝦養(yǎng)殖區(qū)抗生素規(guī)范化使用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素使用的規(guī)范和經(jīng)驗(yàn)選擇30種目標(biāo)抗生素，包括MCs：阿奇霉素（AZI）、螺旋霉素（SP）、克拉霉素（CTM）、克林霉素（CLI）；TCs：土霉素（OTC）、鹽酸金霉素（CTCHCL）、鹽酸四環(huán)素（TC HCL）、甲烯土霉素（MC）、鹽酸強(qiáng)力霉素（DXC）；LCs：青霉素G鈉鹽（PEN G）；QNs：諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）、鹽酸洛美沙星（LOM HCL）、恩諾沙星（ENR）、依諾沙星（ENO）、麻保沙星（MBF）、氟羅沙星（FLX）、氧氟沙星（OFL）；SAs：乙酰磺胺（SAAM）、磺胺吡啶（SPD）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲惡唑（SMX）、磺胺甲二唑（SMTZ）、苯甲?；前罚⊿B）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺噻唑（STZ）、磺胺間二甲氧嘧啶（SDX）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶（SMD）。均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度大于98%。

甲酸、乙腈、甲醇為色譜純；磷酸、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）為分析純；其他試劑為優(yōu)級(jí)純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 樣品采集

選定的采樣點(diǎn)為江蘇省南京浦口（NJ1，118°50'59″E，32°10'56″N和NJ2，118°51'34″E，32°11'7″N）和淮安盱眙（XY1，118°31'2″E，32°57'35″N和XY2，118°33'38″E，32°45'14″N）4個(gè)典型克氏原螯蝦養(yǎng)殖塘，養(yǎng)殖面積分別為 1.47×104、1.33×104、4×104m2和1.33×104m2，采樣時(shí)間分別為2018年11月和2019年5月。使用“五點(diǎn)取樣法”，分別采集每個(gè)養(yǎng)殖塘四周和中央的表層（0.5 m）水樣，混勻后取2 L保存于棕色玻璃瓶中；同時(shí)利用底泥采樣器（常州普森PSC-200）采集表層沉積物（0～1 cm）裝入樣品袋。所有樣品采集后低溫保存，48 h內(nèi)完成預(yù)處理和水樣理化指標(biāo)分析。

1.3 樣品預(yù)處理及檢測(cè)

水樣通過(guò)0.22μm水相濾膜（GTTP04700，美國(guó)Merck Millipore公司），過(guò)濾后量取500 mL，加入2.5 mL 100 g·L-1Na2EDTA溶液，用（1+1）磷酸溶液調(diào)節(jié)pH=3.0，充分混勻后用Oasis HLB固相萃取柱（500 mg，6 mL）進(jìn)行富集。HLB柱使用前依次用6 mL甲醇、3 mL超純水和6 mL KH2PO4溶液（pH=3.0）進(jìn)行活化平衡。水樣通過(guò)HLB柱時(shí)流速約為4 mL·min-1。萃取結(jié)束后，用6 mL超純水淋洗HLB柱，在負(fù)壓下抽干20 min，用6 mL甲醇洗脫。

沉積物樣品室內(nèi)風(fēng)干粉碎并過(guò)60目篩后，稱取4 g于100 mL離心管中，分別加入5 mL 0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液和25 mL提取液（0.2 mol·L-1檸檬酸緩沖液∶甲醇=1∶1，V∶V）。依次超聲 15 min，振蕩10 min，離心15 min（8000 r· min-1），重復(fù)3次并收集上清液，用超純水定容至500 mL。參照水樣預(yù)處理進(jìn)行萃取和洗脫。

在35℃水浴下用氮吹儀將洗脫液吹至近干，用甲醇定容至1 mL。經(jīng)0.2μm濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣小瓶，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LCAgilent Technologies 1290 Infinity，美國(guó) MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美國(guó)Agilent公司）進(jìn)行測(cè)定。樣品經(jīng)Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5μm）分離，流動(dòng)相A為0.2%甲酸溶液，B為乙腈溶液，柱溫40℃。電離源采用電噴霧（ESI）離子源正電離模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring，MRM）掃描定量分析目標(biāo)抗生素。電離電壓為5500 V；氣簾氣壓為206 851.8 Pa；輔助加熱氣壓為275 802.4 Pa；噴霧電壓為241 327.1 Pa；碰撞氣壓為41 370.36 Pa；離子源溫度為400℃。

1.4 質(zhì)量控制

采用外標(biāo)法定量分析養(yǎng)殖區(qū)水和沉積物中目標(biāo)抗生素的濃度，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的QAQC程序。以水和沉積物樣品為基底進(jìn)行加標(biāo)回收，抗生素回收率均在70%～120%之間。以信噪比S/N≥3時(shí)各目標(biāo)抗生素的質(zhì)量濃度作為檢出限，水樣和沉積物樣品的檢出限分別為0.102～10.040 ng·L-1和0.001～2.500 ng·g-1（表1）。

1.5 水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

分別利用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定水樣的理化性質(zhì)，包括總氮（TN，GB 11894—1989）、總磷（TP，GB 11893—1989）和高錳酸鉀指數(shù)（CODMn，GB 11892—1989）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Minitab 17.1軟件，分析水樣中抗生素濃度和水體理化指標(biāo)的Pearson相關(guān)系數(shù)。

1.7 抗生素生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

風(fēng)險(xiǎn)商值（Risk quotients，RQs）被廣泛應(yīng)用于分析廢水和地表水中常檢測(cè)到的藥物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[17]。遵循RQs法評(píng)估克氏原螯蝦養(yǎng)殖水體中殘留抗生素對(duì)水生生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)依據(jù)其大小劃分：RQs≥1表明抗生素暴露風(fēng)險(xiǎn)很高；0.1≤RQs＜1代表中等風(fēng)險(xiǎn)；RQs＜0.1表明對(duì)目標(biāo)生物風(fēng)險(xiǎn)低。RQs的計(jì)算公式如下：

表1 水樣和沉積物樣品中抗生素的檢出限Table 1 The limits of detection of antibiotics in water and sediment samples

RQs=MEC/PNEC

式中：MEC為抗生素的實(shí)測(cè)濃度，ng·L-1；PNEC為預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度，即其不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不良影響的最大濃度，ng·L-1。PNEC值通過(guò)將毒性數(shù)據(jù)除以評(píng)估因子（AF）計(jì)算。根據(jù)歐盟的技術(shù)指導(dǎo)文件，AF根據(jù)毒性數(shù)據(jù)情況選取，當(dāng)采用急性毒性數(shù)據(jù)L（E）C50時(shí)，AF取值1000；當(dāng)采用慢性毒性數(shù)據(jù)L（N）OEC時(shí)，AF取值100[18]。本研究中目標(biāo)抗生素的毒性數(shù)據(jù)和AF取值來(lái)源于相關(guān)文獻(xiàn)，基于最壞情況考慮，篩選出最敏感水生物種的PNEC值以計(jì)算RQs。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗生素濃度水平

所有樣品中共檢測(cè)到4類14種目標(biāo)抗生素，包括大環(huán)內(nèi)酯類（AZI、SP、CTM、CLI）、四環(huán)素類（OTC、CTCHCL）、喹諾酮類（LOM HCL、ENR、FLX、OFL）和磺胺類（SAAM、SPD、SD、SMX），它們?cè)诓煌蓸狱c(diǎn)水樣和沉積物樣品中的濃度如表2所示，其余抗生素在各樣本中的濃度均低于檢測(cè)限。

南京浦口克氏原螯蝦養(yǎng)殖水體（NJW-1和NJW-2）中抗生素總濃度分別為104.890 ng·L-1和77.579 ng·L-1，污染水平以CTCHCL＞OFL＞AZI＞CTM＞ENR＞SP＞SMX＞SPD順序降低。CTCHCL在兩塘水樣中以較高濃度存在（分別為57.140 ng·L-1和47.400 ng·L-1），對(duì)總抗生素的貢獻(xiàn)大于其余抗生素之和?？傮w而言，四環(huán)素類藥物在南京兩個(gè)養(yǎng)殖塘水體殘留的抗生素中占主導(dǎo)地位。Chen等[19]的研究表明，中國(guó)南方海陵島海水養(yǎng)殖區(qū)水樣中廣泛檢測(cè)到抗生素（ND～16 000 ng·L-1），主要類別同樣是四環(huán)素類，但濃度水平相對(duì)高于本研究。克氏原螯蝦通過(guò)直接或間接感染細(xì)菌、真菌等引發(fā)疾病，四環(huán)素類抗生素能夠有效抑制或殺滅這些致病微生物，因此被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖活動(dòng)。對(duì)于盱眙克氏原螯蝦養(yǎng)殖水體，XYW-1中僅檢出OTC（9.756 ng·L-1）和 LOM HCL（1.420 ng·L-1）；XYW-2中兩種喹諾酮類抗生素（ENR和OFL）被檢出（1.081～2.043 ng·L-1）。說(shuō)明盱眙養(yǎng)殖水體中殘留的主要是四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素?？偟膩?lái)說(shuō)，浦口水體中抗生素總濃度相對(duì)高于盱眙，一方面可能受養(yǎng)殖者使用抗生素種類和劑量習(xí)慣的影響。另一方面可能與采集樣品的季節(jié)差異有關(guān)，11月養(yǎng)殖者陸續(xù)投放克氏原螯蝦幼苗，為了促進(jìn)幼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)預(yù)防爆發(fā)大規(guī)模細(xì)菌性疾病導(dǎo)致的減產(chǎn)，施用抗生素成為一種高效手段。此外，阮悅斐等[20]發(fā)現(xiàn)冬季淡水養(yǎng)殖水體和沉積物中抗生素濃度總體上比夏季高，與本研究結(jié)果類似。夏季氣溫和水溫升高，抗生素在環(huán)境中的降解效率可能隨之增加，而冬季抗生素在水環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定。兩個(gè)采樣點(diǎn)抗生素種類雖有所差異，但濃度均處于低水平。與天津近郊[20]、太湖周邊[21]和珠江口岸[22]等其他淡水養(yǎng)殖環(huán)境相比，江蘇（特別是盱眙）克氏原螯蝦養(yǎng)殖水體中抗生素濃度較低。這種差異可能是由于養(yǎng)殖習(xí)慣以及抗生素使用方式和使用量不同。盱眙克氏原螯蝦在江蘇省甚至全國(guó)范圍內(nèi)廣泛流行，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。克氏原螯蝦養(yǎng)殖成為盱眙支柱型產(chǎn)業(yè)，為了規(guī)范生產(chǎn)行為，維護(hù)市場(chǎng)穩(wěn)定，盱眙縣農(nóng)業(yè)委員會(huì)制訂《盱眙縣龍蝦養(yǎng)殖投入品管理控制辦法（試行）》，嚴(yán)格控制養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素等藥物的使用[23]。本研究結(jié)果表明，盱眙在克氏原螯蝦安全生產(chǎn)方面的努力已初見(jiàn)成效。

表2 水樣和沉積物樣品中抗生素的種類和濃度（ng·g-1）Table 2 Types and concentrations of antibiotics in water and sediment samples（ng·g-1）

對(duì)于沉積物樣品，盱眙兩個(gè)采樣點(diǎn)未檢測(cè)到任何目標(biāo)抗生素。NJS-1和NJS-2僅檢出少量抗生素殘留，總濃度分別為0.261 ng·g-1和 1.423 ng·g-1。值得注意的是，兩養(yǎng)殖塘水樣中殘留一定濃度的CTC HCL，然而沉積物中并未檢出，可能與其較高的溶解度有關(guān)。檢出的SAs（SAAM和SPD）濃度范圍為0.015～1.018 ng·g-1，與Chen等[16]的研究結(jié)果（0.1～0.8 ng·g-1）相似，表明磺胺類的沉積物吸附性能較弱。QNs有較強(qiáng)的吸附親和力，更容易被吸附到沉積物上，因此其在中國(guó)廣東（ND～446 ng·g-1）和珠江口（ND～153.06 ng·g-1）養(yǎng)殖區(qū)沉積物中濃度較高[22，24]。然而，本研究中QNs的濃度范圍僅為ND～0.273 ng·g-1，這種差異可能源于養(yǎng)殖過(guò)程中使用量的不同。總體而言，江蘇克氏原螯蝦養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素污染水平較低。

表3 抗生素濃度與水質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlations between antibiotic concentrations and water-quality indexes

2.2 水體中抗生素濃度與水質(zhì)指標(biāo)的關(guān)系

抗生素作為一種痕量的有機(jī)污染物，在水體中易發(fā)生水解、光解和生物降解等遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程。以往研究表明，環(huán)境因素會(huì)影響抗生素在水環(huán)境中的降解速率[25]。為了探究江蘇省克氏原螯蝦養(yǎng)殖水體中檢測(cè)到的10種抗生素與水質(zhì)指標(biāo)（TN、TP、CODMn）的關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析。如表3所示，AZI、CTM、CTC HCL、ENR、OFL、SPD、SMX的濃度與TN顯著正相關(guān)；CTCHCL、ENR、SMX的濃度與TP顯著或極顯著正相關(guān)。水體富營(yíng)養(yǎng)化程度的增加可能在一定程度上抑制以上抗生素藥物（特別是CTC HCL、ENR、SMX）在養(yǎng)殖水環(huán)境中的降解。以往也有研究表明，水體中諾氟沙星（NOR）、甲氧芐胺嘧啶（TMP）、環(huán)丙沙星（CIP）、紅霉素（ETM）的濃度與富營(yíng)養(yǎng)化程度呈正相關(guān)[26-27]。水樣中OTC和LOM HCL的濃度與CODMn顯著負(fù)相關(guān)（表3）?？赡苡捎诖罅坑袡C(jī)污染物在微生物作用下進(jìn)行好氧分解，水中溶解氧不足，從而影響抗生素的微生物降解速率。不同的是，在秦延文等[26]的研究中，NOR、TMP、CIP濃度與有機(jī)污染程度呈極顯著正相關(guān)，可能與抗生素不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。然而，目前的研究尚不能揭示水體理化性質(zhì)影響抗生素在環(huán)境中遷移擴(kuò)散的機(jī)制。

2.3 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)分析

不同抗生素對(duì)應(yīng)最敏感物種的PNEC值如表4所示，浮游植物對(duì)抗生素更為敏感。抗生素可能對(duì)浮游植物造成急性或慢性毒性威脅，從而對(duì)養(yǎng)殖塘和其他環(huán)境中的生物地球化學(xué)過(guò)程產(chǎn)生不利影響[21]。結(jié)果表明，大環(huán)內(nèi)酯類對(duì)藻類生長(zhǎng)最不利，其次是喹諾酮類。

結(jié)合檢出的抗生素環(huán)境濃度（MEC）計(jì)算其在江蘇克氏原螯蝦養(yǎng)殖水體中的RQs（表5），所有目標(biāo)抗生素對(duì)浮游動(dòng)物的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有風(fēng)險(xiǎn)。NJ-1中CTM和OFL、NJ-2中CTM對(duì)藻類等浮游植物具有較高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)；NJ-1中SP、NJ-2中SP和OFL處于中等風(fēng)險(xiǎn)水平。說(shuō)明在南京浦口養(yǎng)殖區(qū)，大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗生素存在一定生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。這兩類抗生素在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但與其他地區(qū)相比，本研究中其濃度均處于低水平，卻呈現(xiàn)中高風(fēng)險(xiǎn)，表明這些抗生素即使在殘留濃度很低的情況下，也會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成威脅。在盱眙養(yǎng)殖環(huán)境中，僅XY-2中殘留的OFL會(huì)造成中等程度的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。此前報(bào)道了孟加拉國(guó)有鰭魚(yú)類養(yǎng)殖地表水中除泰樂(lè)菌素（TYL，RQ=0.116）外，其余抗生素的風(fēng)險(xiǎn)商值均低于0.1，與本研究中盱眙克氏原螯蝦養(yǎng)殖環(huán)境的抗生素生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)水平相當(dāng)[28]。此類中低風(fēng)險(xiǎn)與養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的規(guī)范化使用密不可分。水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用大量化學(xué)品和生物制品，其中抗生素由于對(duì)非目標(biāo)生物具有高毒性和生物累積性，并且可能潛在地影響鄰近水生生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和功能，已被證明是對(duì)環(huán)境最有害的化合物之一[5]。減少養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的使用，能夠有效降低其生態(tài)和人類健康風(fēng)險(xiǎn)。

表4 目標(biāo)抗生素毒性數(shù)據(jù)Table 4 Aquatic toxicity data of target antibiotics

3 結(jié)論

（1）江蘇（特別是盱眙）克氏原螯蝦養(yǎng)殖水體中抗生素污染水平相對(duì)較低。CTCHCL、OFL、AZI是浦口養(yǎng)殖水中的主要抗生素。沉積物中僅有微量抗生素殘留。

（2）基于計(jì)算RQs進(jìn)行的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估表明，浦口養(yǎng)殖水體中SP、CTM和OFL可能對(duì)綠藻等浮游植物構(gòu)成高風(fēng)險(xiǎn)或中度風(fēng)險(xiǎn)，盱眙殘留抗生素對(duì)藻類的風(fēng)險(xiǎn)處于中低水平。

（3）有必要對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的使用進(jìn)行監(jiān)督和控制，以減少抗生素對(duì)水生生物以及人類健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)。