王 龑 王 琦 劉 陽

(1浙江工業(yè)大學(xué)食品系,浙江 杭州 310018;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

我國(guó)是全世界最大的小麥生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)目前小麥生產(chǎn)量和消費(fèi)量分別占全世界小麥總量的17%和16%,小麥種植面積和總產(chǎn)量?jī)H次于水稻,小麥種植面積和產(chǎn)量均占世界總種植面積和總產(chǎn)量的21%[1],小麥對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和糧食安全起著至關(guān)重要的作用。近年來,由于氣候和耕作制度的變化,小麥赤霉病在我國(guó)愈演愈烈,給小麥生產(chǎn)造成了巨大損失,嚴(yán)重影響籽粒品質(zhì)[1]。禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)是引起赤霉病的主要菌種,由該病菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)嚴(yán)重威脅食品安全[1]。DON是一種無色針狀結(jié)晶,結(jié)構(gòu)式為3α,7α,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮,分子量為296.3,分子式為C15H20O6,熔點(diǎn)為151～153℃,易溶于水、乙醇等溶劑,具有較強(qiáng)的熱抵抗力和耐酸性[2]。DON 毒素能夠抑制蛋白質(zhì)合成和核酸的復(fù)制,抑制線粒體功能,破壞細(xì)胞膜完整性,具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性和胚胎毒性,能引起腹瀉、嘔吐、腸道壞死等病癥。DON 毒素已被世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織確定為食品中最危險(xiǎn)的生物污染物之一[2]。DON 毒素的生物合成酶和直接調(diào)節(jié)蛋白是由位于染色體3個(gè)不同位點(diǎn)的15個(gè)基因編碼,即12個(gè)基因核心Tri簇、Tri1～Tri16位點(diǎn)和單基因Tri101位點(diǎn)[3-5]。

禾谷鐮刀菌在侵染小麥的過程中會(huì)引起寄主小麥的一系列防御反應(yīng),最初的防御反應(yīng)就是植株體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累,如H2O2,其中由質(zhì)膜NADPH 氧化酶產(chǎn)生的ROS是眾多防御反應(yīng)中較快的一種[6-7]。酵母作為真菌研究的模式菌株,氧化壓力能夠誘導(dǎo)酵母71個(gè)蛋白差異表達(dá),其中一半以上受到Y(jié)ap1的調(diào)控,氧化脅迫下,Yap1 蛋白C端的半胱氨酸殘基內(nèi)部形成二硫鍵,繼而使其NES 序列改變而失活,導(dǎo)致Yap1 蛋白在細(xì)胞核中積累,調(diào)控下游基因表達(dá)以適應(yīng)氧化壓力的變化,分析小麥赤霉病菌的基因組發(fā)現(xiàn),該禾谷鐮刀菌中存在一個(gè)Yap1同源蛋白Fgap1[8-9]。但目前尚未有Fgap1 在氧化壓力下調(diào)控禾谷鐮刀菌Tri基因表達(dá)和DON 毒素合成的研究報(bào)道。前期研究通過同源重組的方法構(gòu)建了Fgap1基因缺失突變株⊿Fgap1,本研究以禾谷鐮刀菌野生型PH-1和突變株⊿Fgap1為試驗(yàn)材料,分析氧化壓力敏感性、DON 毒素合成、Tri基因表達(dá)等,旨在明確轉(zhuǎn)錄因子Fgap1 與氧化壓力下Tri基因表達(dá)和DON 毒青合成的相關(guān)性,以期闡釋鐮刀菌中Fgap1 調(diào)控毒素合成的作用機(jī)制,為建立安全高效的赤霉病及DON 毒素的防控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)中所用禾谷鐮刀菌野生型PH-1是由浙江大學(xué)馬忠華教授贈(zèng)予;禾谷鐮刀菌Fgap1的缺失突變株⊿Fgap1是由本試驗(yàn)通過同源重組的方法構(gòu)建獲得的Fgap1基因缺失純合子。孢子懸液置于甘油管中-80℃保存,使用時(shí)在PDA 平板上復(fù)蘇,28℃培養(yǎng)3 d備用。

1.2 方法

1.2.1 禾谷鐮刀菌培養(yǎng)及其孢子懸液制備 禾谷鐮刀菌PH-1和⊿Fgap1,保存于-80℃甘油管中,使用前在PDA 上復(fù)蘇,28℃培養(yǎng)6～8 d后,用無菌棉棒刮下,在無菌水中懸浮制成孢子懸液,并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)稀釋至107CFU·mL-1。

1.2.2 生長(zhǎng)速率、氧化滲透壓敏感性測(cè)定 將禾谷鐮刀菌野生型菌株P(guān)H-1 在PDA 平板活化2 d后,用打孔器取下直徑0.5 cm 菌餅,接種到添加0.1 mmol·L-1甲萘醌(menadione)、0.007 mmol·L-1過氧化叔丁醇(tertbutyl hydroperoxide,TBHP)、24 mmol·L-1過氧化氫(H2O2)和0.001 mmol·L-1重鉻酸鉀(K2Cr2O7)的平板中,28℃避光培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)定菌落直徑[10],計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。其中,在培養(yǎng)60 h時(shí),測(cè)定各氧化劑處理下菌落直徑和菌絲生長(zhǎng)抑制率;在培養(yǎng)72 h時(shí),測(cè)定空白組(不加氧化劑)和0.1 mmol·L-1甲萘醌處理下菌落直經(jīng)和菌絲生長(zhǎng)抑制率,以及0.05、0.10、0.20 mmol·L-1甲萘醌處理下菌絲生長(zhǎng)抑制率。每組設(shè)3次生物學(xué)重復(fù),每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 掃描電鏡觀察菌絲結(jié)構(gòu) 菌株培養(yǎng)2 d后,用敲碎的蓋玻片小碎片輕輕斜插入PDA 培養(yǎng)基,再繼續(xù)培養(yǎng)12～18 h 至菌絲爬上玻璃碎片。收集碎片,用2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合液固定菌絲,4℃過夜。將固定好的菌絲用乙醇梯度溶液脫水,二氧化碳臨界點(diǎn)干燥,粘在金屬臺(tái)上,噴金鍍膜,S-750型掃描電鏡(Hitachi,日本)下觀察,拍照[11]。

1.2.4 DON 毒素含量測(cè)定 DON 提取:刮取約1 g菌絲至1.5 mL 離心管中,加入約1 mL 乙腈∶水(84 ∶16,v ∶v)溶劑,冰上研磨,25℃、170 r·min-1條件下震蕩提取,再用免疫親和柱凈化。

DON 毒素含量分析:Waters 高效液相色譜分析系統(tǒng),C18反向色譜柱(25 cm×4.6 mm,粒徑5 μm),流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水(90 ∶5 ∶5,v ∶v ∶v),流速1.0 mL·min-1,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm,檢測(cè)時(shí)間20 min,進(jìn)樣量20 μL。

1.2.5 基因表達(dá)分析 禾谷鐮刀菌培養(yǎng)48 h后,加入0.01 mol·L-1甲萘醌繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集菌絲,稱量約100 mg 菌絲至1.5 mL 離心管中,按照E.Z.N.A.Fungal RNA Kit 試劑盒(Omega Bio-Tek,美國(guó))進(jìn)行后續(xù)提取,RNA 電泳驗(yàn)證無降解,cDNA 合成試劑盒(TaKaRa,日本) 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,SYBR Green Supermix 試劑盒熒光標(biāo)記,ABI 7500型熒光定量PCR儀(ABI,美國(guó))分析基因表達(dá)量。采用2-ΔΔCt法[12]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量熒光PCR 引物Table1 Primers of quantitative real-time PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel Office 2013 軟件對(duì)試驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滲透氧化壓力下禾谷鐮刀菌PH-1的敏感性分析

由圖1可知,在PDA 平板培養(yǎng)60 h后,添加不同種類不同濃度的氧化劑培養(yǎng)后,禾谷鐮刀菌PH-1 生長(zhǎng)速率與空白相比有明顯變化,其中0.007 mmol·L-1過氧化叔丁醇對(duì)PH-1的抑制作用最明顯,菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到78%;其次是0.001 mmol·L-1重鉻酸鉀,菌絲抑制率達(dá)到44%,24 mmol·L-1過氧化氫對(duì)PH-1 菌絲生長(zhǎng)率抑制率為32%,0.1 mmol·L-1甲萘醌對(duì)PH-1菌絲生長(zhǎng)率抑制率為20%。

圖1 不同滲透氧化壓力下禾谷鐮刀菌PH-1的敏感性分析Fig.1 Sensitivity of F.graminearum PH-1 under osmotic and oxidative stresses

2.2 甲萘醌脅迫下禾谷鐮刀菌PH-1、突變體⊿Fgap1的長(zhǎng)勢(shì)情況

由于甲萘醌處理重復(fù)性好,選取0.05、0.1、0.2 mmol·L-1甲萘醌作為氧化劑添加到PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)禾谷鐮刀菌,在24～72 h 之間每隔12 h 拍照并記錄菌落生長(zhǎng)情況。突變體⊿Fgap1的菌落在正常條件下與野生型PH-1的長(zhǎng)勢(shì)一致,添加氧化劑后,突變體⊿Fgap1的菌落生長(zhǎng)較PH-1 緩慢,且色素沉積減慢(圖2-A)。在添加0.05、0.1、0.2 mmol·L-1甲萘醌的處理中,培養(yǎng)72 h后,野生型PH-1 菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為30%、53%、75%;突變體⊿Fgap1的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為46%、78%、88% (圖2-B)。綜上,⊿Fgap1 突變體在氧化壓力下的生長(zhǎng)明顯滯后,轉(zhuǎn)錄因子Fgap1 對(duì)禾谷鐮刀菌在氧化壓力下的菌絲生長(zhǎng)有正調(diào)控作用。

圖2 禾谷鐮刀菌在添加甲萘醌平板上的生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth of F.graminearum in culture supplemented with menadione

2.3 甲萘醌脅迫下禾谷鐮刀菌PH-1、突變體⊿Fgap1的菌絲形態(tài)

通過掃描電鏡觀察,PH-1 菌絲表面光滑(圖3-A),甲萘醌脅迫處理后菌絲表面出現(xiàn)輕微的萎縮(圖3-B);與野生型PH相比,Fgap1基因敲除突變株⊿Fgap1菌絲表面光滑度略有下降(圖3-C),在甲萘醌脅迫處理后菌絲纖細(xì)沒有光澤度,萎縮明顯,部分菌絲斷裂、細(xì)胞壁破損(圖3-D)。

2.4 不同氧化壓力下禾谷鐮刀菌PH-1、突變體⊿Fgap1的產(chǎn)毒情況

選取24 mmol·L-1過氧化氫、0.01 mmol·L-1甲萘醌、0.007 mmol·L-1過氧化叔丁醇作為氧化劑添加到PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h,收集菌絲測(cè)定DON 毒素含量。由圖4可知,野生型PH-1 在不同氧化劑處理下,DON 毒素含量均有不同程度的上升,尤其是在甲萘醌和過氧化叔丁醇處理下,DON 毒素含量顯著增加了18倍;突變體⊿Fgap1在不同氧化劑處理下,DON 毒素含量無明顯變化。表明Fgap1基因的缺失顯著影響了DON 毒素的產(chǎn)生,Fgap1基因調(diào)節(jié)氧化壓力下DON 毒素的合成。

圖3 甲萘醌處理下禾谷鐮刀菌的菌絲形狀(3 000×)Fig.3 Mycelial morphology of F.graminearum under menadione treatments (3 000×)

圖4 不同氧化空白壓力處理對(duì)禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒的影響Fig.4 Effect of different oxidative stress on the DON content produced F.graminearum

2.5 甲萘醌處理下禾谷鐮刀菌Fgap1、Tri基因的表達(dá)情況

由圖5可知,野生型PH-1 在0.01 mmol·L-1甲萘醌處理后,Fgap1基因表達(dá)量顯著升高,突變體⊿Fgap1中Fgap1基因不表達(dá)。Fgap1的DNA 結(jié)合位點(diǎn)TTACTAA,在Tri5和Tri10基因啟動(dòng)子區(qū)域具有結(jié)合位點(diǎn)。Tri5——單端孢霉烯合酶,是DON 合成途徑中的第一步限速酶[5,13],Tri6、Tri10 這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多個(gè)DON 合成基因的表達(dá)[14]。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Tri基因的表達(dá),野生型PH-1 經(jīng)0.01 mmol·L-1甲萘醌處理后,Tri5、Tri6、Tri10基因表達(dá)量均有不同程度的升高;與野生型PH-1相比,Fgap1基因缺失突變體中DON 毒素合成調(diào)控基因Tri5、Tri6、Tri10、Tri101均下調(diào)表達(dá)(圖5)。

圖5 甲萘醌處理下禾谷鐮菌Fgap1、Tri基因的表達(dá)Fig.5 The expression of Fgap1 and Tri in F.graminearum treated with menadione

3 討論

植物病菌在侵染過程中能引起寄主植物一系列的防御反應(yīng),氧化應(yīng)激是一種首要的防御反應(yīng),且ROS能夠作為第二信使傳遞放大反應(yīng)信號(hào),ROS的積累使得病菌在侵染部位受到更多的氧化壓力從而影響病菌的侵染過程[6-7]。禾谷鐮刀菌侵染小麥的過程中會(huì)產(chǎn)生ROS 信號(hào),激發(fā)小麥的氧化應(yīng)激反應(yīng)。禾谷鐮刀菌會(huì)產(chǎn)生單端孢霉烯毒素,包括HT-2 毒素、T-2 毒素、DON、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)等60 多種毒素,其中主要組分是DON。大量研究表明,赤霉病菌的DON 毒素的產(chǎn)生受到多個(gè)Tri基因的調(diào)控[4-5,13],且與致病性相關(guān)[15]。病原菌侵染麥穗的過程中產(chǎn)生的DON 毒素能夠引起胼胝質(zhì)的積累和抑制麥穗細(xì)胞壁的增厚,從而影響病菌的侵染過程[16]。在外源H2O2充足的環(huán)境下,離體培養(yǎng)赤霉病菌菌體能夠產(chǎn)生更多的DON 毒素,當(dāng)添加過氧化氫酶將外源的H2O2降解后,DON 毒素的積累劇烈下降。H2O2引起的氧化壓力能夠誘導(dǎo)多個(gè)Tri基因表達(dá)上升,而過氧化氫酶減弱了H2O2引起的氧化壓力,抑制了Tri基因的表達(dá)[7]。此外,酚酸等抗氧化劑能夠通過抑制Tri基因的表達(dá)從而控制禾谷鐮刀菌中單端孢霉烯B 族毒素的合成[17],且麥麩中提取的酚酸,同樣也能很好地抑制Tri基因的表達(dá)[18]。Yap1的同源蛋白被初步證實(shí)參與調(diào)控菌體對(duì)外界脅迫的感應(yīng),但是不同病菌中Yap1的生物學(xué)功能有所差別[16,19-22]。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中MoAP1的缺失突變體對(duì)H2O2敏感,影響菌絲分支、分生孢子形成、黑色素形成及致病力[19]。鏈格孢菌(Alternaria alternata)中AP-1 對(duì)氧化脅迫敏感,AP-1 缺失后的菌株致病力減弱[20-21]。隱球酵母(Cryptococcus neoformans)YAP1基因敲除后,其對(duì)大范圍的氧化脅迫敏感,同時(shí)也對(duì)抗真菌氟康唑高度敏感[22]。本研究中禾谷鐮刀菌在甲萘醌、過氧化叔丁醇、過氧化氫、重鉻酸鉀4種不同氧化劑處理下菌落生長(zhǎng)受到明顯抑制,表明Fgap1 缺失突變體對(duì)過氧化氫、過氧化叔丁醇、甲萘醌敏感,氧化劑影響了菌絲結(jié)構(gòu)及色素形成,這與前人研究一致。

氧化脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控真菌次生代謝產(chǎn)物,包括毒素的形成[23-24]。目前已有關(guān)于絲狀真菌中Yap1 調(diào)控毒素合成的研究報(bào)道[25-26]。在酵母中,Yap1 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其DNA的結(jié)合序列已確認(rèn)為TGACTAA[27]。單端孢霉烯毒素生物合成基因包括一個(gè)含有12個(gè)基因的核心Tri簇,Tri1、Tri16基因,以及1個(gè)單基因Tri101位點(diǎn)[5,13,28]。單端孢霉烯首先由焦磷酸法尼酯經(jīng)多步反應(yīng)合成曲古二烯(該步反應(yīng)由Tri5基因編碼酶催化),曲古二烯在Tri4 編碼的多功能的P450 單加氧酶催化下經(jīng)由4 步反應(yīng)合成異構(gòu)單端孢霉三元醇,而后經(jīng)無酶催化作用的兩步異構(gòu)化反應(yīng)(C9的羥基異構(gòu)成C11的羥基,C2 上氧原子與C11之間經(jīng)環(huán)化作用形成-CO 鍵),生成異構(gòu)木霉菌醇,異構(gòu)木霉菌醇在Tri101 編碼的乙?；D(zhuǎn)移酶催化[C3上的羥基被乙?；?3-乙酰異構(gòu)木霉菌醇C15位在P450 單加氧酶(由Tri11 編碼)]下羥基化生成15-脫乙酰麗赤殼菌素(DON 生成的直接底物),繼而經(jīng)過C3位和C7位的羥基化作用及C8位變?yōu)橥?最終生成DON[13]。通過分析已經(jīng)確定Fgap1 在赤霉的Tri5和Tri10基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn),Fgap1基因缺失突變體在甲萘醌引起的氧化壓力下DON 毒素含量顯著降低,Tri5、Tri6、Tri10及Tri101基因表達(dá)受到抑制,表明Fgap1 調(diào)控Tri基因表達(dá)和DON 毒素合成,但不能影響禾谷鐮刀菌的致病力[25]。此外,在寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)中也存在Yap1的同源蛋白,ApyapA 能調(diào)控AflR基因的表達(dá)及黃曲霉毒素B1的合成[26]。綜上表明,病原菌引起的氧化壓力會(huì)反過來干擾病原菌的次生代謝和調(diào)控毒素基因的合成,與寄生曲霉類似,禾谷鐮刀菌PH-1 能夠通過轉(zhuǎn)錄因子Fgap1 調(diào)節(jié)下游效應(yīng)因子的改變、DON 合成基因的表達(dá)等以適應(yīng)氧化壓力的變化,從而更好地完成侵染過程。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,4種不同氧化劑(甲萘醌、過氧化叔丁醇、過氧化氫、重鉻酸鉀)處理下禾谷鐮刀菌菌落生長(zhǎng)受到明顯抑制,⊿Fgap1 突變體對(duì)過氧化氫、過氧化叔丁醇、甲萘醌敏感,氧化劑影響菌絲結(jié)構(gòu)及色素形成,在氧化壓力下⊿Fgap1 突變體的DON 毒素合成能力下降,Tri5、Tri6、Tri10 及Tri101基因表達(dá)受到抑制。本研究明確了轉(zhuǎn)錄因子Fgap1 與氧化壓力下Tri基因表達(dá)和DON 毒素合成的相關(guān)性,禾谷鐮刀菌中Fgap1 轉(zhuǎn)錄因子能夠感受并傳遞氧化壓力信號(hào),調(diào)控Tri基因的表達(dá)和DON 毒素的合成,下一步可對(duì)Fgap1調(diào)控合成基因Tri基因表達(dá)的機(jī)理進(jìn)行研究。