苑翠玲 閆彩霞 趙小波 王 娟 李春娟 孫全喜 單世華

(山東省花生研究所,山東 青島 266100)

花生(Arachis hypogaeaL.)是我國重要的油料作物,是食用油脂重要供應(yīng)來源。培育多抗、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)新品種是花生育種工作者主要的研究方向。然而,目前我國推廣的花生品種大多系譜狹窄,90%以上的品種以“伏花生”和“獅頭企”作為骨干親本或含有他們的血緣[1]。這種對少數(shù)骨干親本的依賴現(xiàn)象導(dǎo)致遺傳基礎(chǔ)狹窄,是目前花生育種工作面臨的主要瓶頸[2]。挖掘或創(chuàng)制新的種質(zhì)資源已成為育種工作者的首要任務(wù)。從農(nóng)家品種、野生種、國外引進資源中挖掘和利用新的基因是一個重要方向[3],但仍然存在可利用資源有限、遠(yuǎn)緣雜交困難等問題。突變體創(chuàng)制成為挖掘新種質(zhì)進而培育新品種的重要途徑;同時,突變體也可作為功能基因組學(xué)的研究材料。本文就植物突變體創(chuàng)造途徑、花生突變體研究現(xiàn)狀及利用情況進行了概述,并對下一步工作進行了展望,旨在為花生突變體的創(chuàng)制和利用提供參考。

1 植物突變體創(chuàng)造途徑

1.1 自然突變

自然突變是不經(jīng)任何人工處理,在自然條件影響下產(chǎn)生的變異。這種突變體避免了人們對食品安全性的擔(dān)憂,但突變發(fā)生頻率極低、難度較大。利用具有優(yōu)異性狀的自然突變體已經(jīng)育成了不少農(nóng)作物新品種。比如國寶太谷核不育小麥即由一個編碼“孤兒蛋白”的基因自然突變而來[4],該材料的利用大大提高了小麥育種效率,培育了一批優(yōu)異小麥品種[5]。

1.2 物理誘變

1.3 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變是利用化學(xué)誘變劑[如:甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)、疊氮化鈉、秋水仙素等]處理植物材料,誘發(fā)遺傳物質(zhì)發(fā)生改變,從而引起植物表型的變異。在眾多化學(xué)誘變劑中,EMS 被認(rèn)為是應(yīng)用最好的化學(xué)誘變劑,具有可操作性強、簡便易行等優(yōu)勢,且容易得到穩(wěn)定的突變體,一般到M3 即可穩(wěn)定遺傳。EMS 突變體由于遺傳背景單一,是遺傳育種和分子生物學(xué)研究的理想材料,在國內(nèi)外已成為一種成熟的技術(shù)[9],被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物誘變育種和功能基因組學(xué)研究。在水稻[10]、玉米[11]和小麥[12]等作物中,借助EMS 誘變已經(jīng)獲得了大量的品種或品系,并被應(yīng)用于基因功能鑒定工作中。

TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes)技術(shù)是結(jié)合EMS 誘變?nèi)后w構(gòu)建和PCR 定向篩選技術(shù)而發(fā)展起來的檢測點突變的反向遺傳學(xué)研究方法,具有通量高、成本低、不依賴基因型等特點[13],主要包括突變?nèi)后w的構(gòu)建和隨機突變的篩選。一般采用EMS處理獲得突變?nèi)后w,用CELⅠ酶酶切目的基因PCR 產(chǎn)物,借助電泳篩選突變材料。TILLING 技術(shù)最早應(yīng)用于擬南芥[14],隨后陸續(xù)在玉米[15]、小麥[16]、大豆[17]等作物中廣泛應(yīng)用。

1.4 分子生物學(xué)方法

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制突變體越來越受到科研人員的青睞,如插入突變[18]和基因組編輯[19]等,插入突變包括T-DNA 插入[20]和轉(zhuǎn)座子插入[21]等。二者均需要借助轉(zhuǎn)基因?qū)⑼庠匆阎迦朐?T-DNA或轉(zhuǎn)座子)隨機插入受體植物基因組中,破壞插入位點基因的正常表達(dá),從而引起植株表型的改變。插入突變技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于擬南芥、水稻等易于轉(zhuǎn)化的植物突變體庫的構(gòu)建[22-25]。盡管這種方法具有很大的隨機性和局限性,但這些突變體庫的創(chuàng)制和利用極大地促進了植物功能基因組學(xué)研究的發(fā)展。

近幾年,科學(xué)家創(chuàng)造出能夠按照人們意愿特異切割DNA的序列特異核酸酶,實現(xiàn)了對基因組特定位點的靶向修飾,即基因組編輯技術(shù),包括鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)技術(shù)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技術(shù)和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技術(shù)等[26]。其中,CRISPR 技術(shù)已經(jīng)成為近年的研究熱點,已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物遺傳改良中,并取得了巨大進展?？茖W(xué)家利用CRISPR 技術(shù)創(chuàng)制了高通量的水稻突變體庫[27],開發(fā)了簡單高效的配套的突變體篩選方法[28]:基因組編輯蘑菇已經(jīng)獲準(zhǔn)種植和銷售,并得到美國政府的上市許可[29]。

2 花生突變體研究進展

目前,已經(jīng)有大量具有優(yōu)異性狀的花生突變體被發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)制,并被應(yīng)用到花生新品種培育中。其中,研究最透徹、應(yīng)用最廣泛的是脂肪酸去飽和酶2(Fatty acid desaturase2,FAD2)基因的突變體?；ㄉ鶩AD2基因編碼的脂肪酸去飽和酶可以將油酸轉(zhuǎn)化成亞油酸,該基因突變后,亞油酸合成受抑制,從而得到油酸含量提高的花生,即高油酸花生[30]。

2.1 自然突變體

1987年,Norden 等[31]發(fā)現(xiàn)了花生FAD2基因第一個自然突變體F435,油酸含量高達(dá)80%。目前美國大部分高油酸花生品種(如Sunoleic 97R、Tamrun OL07、Florida-07 等)都直接或間接選育自該突變體[32]。Wang 等[33]篩選了4 000 余份花生種質(zhì),鑒定出2 份高油酸自然突變體PI342664和PI342666,這兩份材料均收集自巴基斯坦西部;姜慧芳等[34]對5 700 份花生種質(zhì)資源進行鑒定評價,篩選出18 份油酸含量達(dá)67%以上的高油酸材料;王傳堂等[35]從花生栽培種與不親和野生種雜種后代中鑒定出高油酸自然突變體,獲得了豐產(chǎn)性較好的高油酸大花生新材料。

2.2 物理誘變突變體

大部分物理誘變是借助γ-射線輻射花生干種子,對后代進行表型鑒定,篩選具有感興趣性狀的突變體材料。邱慶樹等[36]用γ-射線輻射白沙1016,獲得38個可穩(wěn)定遺傳的具有不同性狀的突變體;姜德鋒等[37]以魯花11號干種子為誘變材料,采用γ-射線輻射處理,在后代中選出大果和金黃色內(nèi)種皮的品系;禹山林等[38]用γ-射線照射白沙1016、徐州68-4、花27 干種子,獲得了白葉脈、葉片較小的突變體;李歡倪等[39]利用快中子輻射山花13號的干種子,獲得了一個性狀穩(wěn)定遺傳的花生半矮化突變體sdm1(semi-dwarf mutant 1)。以上突變體的創(chuàng)制為花生大小果、葉片大小、內(nèi)種皮顏色以及株高等性狀研究提供了很好的材料。研究者利用γ-射線輻射也創(chuàng)制了高油酸花生材料。Chu等[40]利用γ-射線輻射Georia Runner,獲得高油酸突變體,命名為GA-T2636M;Yu 等[41]利用γ-射線輻射79266 獲得的高油酸突變體SPI098,是我國創(chuàng)制的第一個高油酸花生突變體,為我國高油酸花生育種研究提供了重要材料。

借助航天育種也獲得了一些變異后代,并培育出了一些花生新品種或品系。河北省唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院借助航天技術(shù)選育出了高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)花生新品種唐花11號,并育成兩個高蛋白花生新品系K2-5-6和K2-33-9[42]。河南省濮陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院將濮珍花1號搭載衛(wèi)星遨游育太空15 d,返回地面后,經(jīng)系統(tǒng)選育獲得豫航花1號[43]。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所通過衛(wèi)星搭載粵油7號種子,返回地面后在后代中發(fā)現(xiàn)莢果大小、形狀和種皮顏色變異新材料,并先后育成了航花1號、航花2號和航花3號等[44]。

由此可知，圓了在學(xué)生時期追究西洋哲學(xué)的同時，首先追究中國哲學(xué)，闡明這點的是中國古代思想史專家佐藤將之。[注]參見佐藤將之：《井上圓了思想における中國哲學(xué)の位置》，《井上圓了センター年報》第21號，2012年9月，第31—32頁。

輻射誘變育種具有變異頻率高、變異范圍大、后代穩(wěn)定快等優(yōu)點,極大縮短了花生育種年限。

2.3 化學(xué)誘變突變體

化學(xué)誘變操作簡單方便,已被廣泛用于花生突變體的創(chuàng)制。研究者分別利用不同的化學(xué)誘變劑,獲得了具有不同優(yōu)異性狀的花生突變后代,并用于新品種培育和分子機理研究。其中,應(yīng)用最多的化學(xué)誘變劑是EMS。

王允等[45]將不同濃度EMS 溶液注入花生花器,獲得了大量株高、株型、生育期、育性及莢果大小等性狀改變的突變體。Wang 等[46]通過EMS 注射花生花器,獲得了高產(chǎn)性狀能夠穩(wěn)定遺傳的超大果和超小果突變體,后代產(chǎn)量顯著增加。徐倩玉[47]利用EMS處理獲得了抗唑嘧磺草胺和雙氟磺草胺的花生種質(zhì)。胡曉輝等[48]用EMS處理強休眠性的花育52號種子,獲得了喪失休眠性的突變體HY52-100-23和HY52-10-67,且被應(yīng)用于花生種子休眠機理的研究。楊富軍等[49]通過不同EMS 濃度梯度和時間梯度處理四粒紅和白沙1016,最終篩選獲得了3個高產(chǎn)株系。Han等[50]用EMS處理抗葉斑病的遠(yuǎn)雜9102,得到抗性喪失的突變體材料M14,并用于花生抗葉斑病機制的研究。Wan 等[51]用EMS處理中花16,得到莢果變小的突變后代,利用此材料開展了莢果大小機理的研究。此外,劉澤等[52]用0.1%秋水仙素溶液處理皖花4號,篩選獲得了一些早熟品系。

利用化學(xué)誘變的方法,也獲得了一些高油酸花生材料。Fang 等[53]用EMS處理魯豐2號,獲得了油酸含量顯著提高的突變體。Knoll 等[54]用EMS 溶液處理Tifrunner,借助TILLING 技術(shù)篩選到了兩個花生主要過敏源基因Arah1和Arah2和一個高油酸突變體。Zhuang 等[55]利用EMS 誘變劑和γ-射線分別處理閩花6號和閩花8號,獲得了一批高油酸且較耐冷的品種和品系,經(jīng)重測序發(fā)現(xiàn)FAD2A和FAD2B基因均有突變,這是首次人工一次誘變創(chuàng)制的雙基因隱性突變高油酸新品系。此外,Wang 等[56]利用疊氮化鈉處理花育22號,獲得了油酸含量提高的突變體CTWE,這是我國高油酸花生品種的少數(shù)幾個親本之一。

2.4 基因組編輯突變體

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,利用基因組編輯技術(shù)對花生目的基因進行定點修飾的報道也陸續(xù)出現(xiàn)。Wen等[57]借助TALEN 技術(shù),獲得了FAD2基因的突變體,轉(zhuǎn)基因花生種子中油酸含量得到顯著提高,這是首次借助基因組編輯技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因花生突變體的報道。Yuan 等[58]借助CRISPR 技術(shù)成功在原生質(zhì)體和發(fā)根(hairy root)中定點突變了FAD2基因,FAD2A出現(xiàn)G448 突變位點,FAD2B出現(xiàn)441_442insA和G451T 突變位點,其中G448A和441_442insA 與現(xiàn)有高油酸材料突變位點一致,G451T是新的突變點,這是首次借助CRISPR 技術(shù)對花生基因進行定點編輯的報道,證明了該系統(tǒng)在花生基因組編輯中應(yīng)用的可行性。

2.5 花生突變體庫創(chuàng)制

利用物理或化學(xué)的方法對花生進行大規(guī)模誘變處理,從而獲得突變體庫,具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。從正向遺傳學(xué)角度,可以挖掘具有優(yōu)異性狀的新材料,用于培育優(yōu)異新品種;并定位或克隆該基因。從反向遺傳學(xué)角度,可以篩選感興趣基因的突變體,鑒定基因的功能。該方面的研究逐漸引起了花生科研工作者的重視。

侯蕾等[59]利用EMS、60Co-γ射線以及快中子輻射處理花生品種豐花1號、山花13和濰花10號等10個主要推廣的栽培花生品種的成熟種子,共獲得30 000 余株M1個體,M2 在葉片形態(tài)、植株形態(tài)、莢果與種子表型及種子成分上均出現(xiàn)變異表型。彭振英等[60]對花生干種子進行60Co-γ 輻射誘變處理并構(gòu)建花生突變體庫,獲得了一些有價值的突變體材料,如高油、高蛋白、大種子和小種子、大葉和小葉、卷葉等。韓鎖義等[61]采用EMS處理阜花10號構(gòu)建花生突變體庫,獲得了104 份葉、莖和種子變異的突變體。宋佳靜[62]用離子束和EMS 誘變處理花生品系416和606的種子和花器,獲得了一個具有豐富表型變異的突變體庫,后代涉及株高、生育期、育性、多分枝、莢果大小、葉型、品質(zhì)等變異。這些花生突變體庫的建立,極大的豐富了花生種質(zhì)資源。然而,這些研究并未對突變質(zhì)量進行評價,也沒有借助TILLING 技術(shù)對優(yōu)異基因突變體進行篩選。

3 花生突變體的應(yīng)用

綜上所述,研究者借助各種途徑創(chuàng)制了一批優(yōu)異花生突變體,并利用這些突變體材料培育出大量優(yōu)異花生品種或品系。其中,應(yīng)用最多的是FAD2基因的突變體,即高油酸花生。

3.1 高油酸花生突變體的應(yīng)用

高油酸花生具有貯藏期長等優(yōu)點,也是目前花生育種的一個重要目標(biāo)。利用FAD2基因突變體已經(jīng)育成大量高油酸花生品種[30,32,63]。截至2016年,美國已經(jīng)育成47個高油酸花生品種[63],我國育成了38個高油酸花生品種[30]。這些品種的親本都來自FAD2 基因的突變體或其衍生物(如F435、SPI098、P76、CTWE等)。

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用從美國引進的高油酸種質(zhì)SunOleic 95R 育成了高油酸品種桂花37[64];青島福德隆種業(yè)有限公司利用SunOleic 95R 育成了富花1號;山東省花生研究所利用SPI098、P76和CTWE 育成了花育32號、花育51號、花育52號、花育951、花育961和花育662 等高油酸新品種。此外,利用高油酸材料開選01-6,河南省開封市農(nóng)林科學(xué)院和河北農(nóng)林科學(xué)院分別育成了開農(nóng)61、開農(nóng)176、開農(nóng)58、開農(nóng)1715、冀花11、冀花13、冀花18和冀花20 等高油酸品種。利用高油酸突變體或衍生物育成的一系列高油酸品種,已在多篇文獻[30,32,63]中進行綜述。

3.2 其他花生突變體的應(yīng)用

除了高油酸花生,花生科研工作者借助誘變技術(shù)創(chuàng)制的突變體材料,也育成了一些具有其他優(yōu)異性狀(如高產(chǎn)、高油、抗逆等)的新品種或品系。江西省撫州地區(qū)農(nóng)科所采用60Co-γ射線處理粵油551 育成了贛花二號[65]。利用輻射創(chuàng)制的普通型大果突變體RP1 育成了高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、適應(yīng)性廣的出口花生品種8130[66]。唐月異等[67]用EMS 注入花育16號開放的花朵,選育出了高產(chǎn)穩(wěn)定、高出米率、適宜機械化收獲的新品種花育40。劉風(fēng)珍[68]利用79266和魯花11 雜交獲得的F1種子經(jīng)60Co-γ 輻射后系統(tǒng)選育出了山花13。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)利用中花4號干種子采用γ-射線輻射育成了湘花5009。廣東省汕頭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所通過60Co-γ 輻射誘變汕油212 育成高油高產(chǎn)花生新品種汕油輻1號[69]。此外,青島農(nóng)業(yè)大學(xué)利用輻射誘變結(jié)合組培再生等方法育成了一系列優(yōu)異品種,如宇花1號、宇花3號、宇花5號、宇花6號、宇花7號和宇花10號等(育自魯花11),以及宇花4號、宇花9號、宇花14和宇花16 來自花育20;宇花4號和宇花8號(育自花育22)。

通過篩選自然變異株的方法也育成了一系列花生新品種。如,雒花86 選自譽宇11號變異單株,魯花10號選自花17,科花1號選自徐州68-4,青花1號選自豐花1號。

4 結(jié)論與展望

研究者陸續(xù)創(chuàng)制了一批花生突變體,并以此育成了一些新品種。然而,利用反向遺傳學(xué)研究基因功能,需要借助突變體表型鑒定來完成,篩選目的基因的突變體也是一項重要工作。因此,應(yīng)加強對花生目的基因突變體篩選鑒定方面的研究。

4.1 創(chuàng)建突變位點飽和、表型豐富的花生EMS 突變體庫,完善配套的TILLING 篩選平臺

EMS 誘變操作簡單、隨機性好,是目前突變體創(chuàng)制最常用的手段。不同花生品種所需要的EMS 工作濃度和處理時間不同。要達(dá)到理想的誘變效果,研究者需要根據(jù)試驗?zāi)康?探索EMS 誘變條件,創(chuàng)制一個突變位點飽和、表型豐富的花生突變體庫,并通過田間性狀調(diào)查,記錄每個突變后代的性狀。研究者可以篩選感興趣性狀的突變體(如耐鹽、抗病等),一方面可以借助雜交等常規(guī)手段,培育花生新品種;另一方面可以以突變體為親本,構(gòu)建雜交群體,對重要性狀基因進行圖位克隆。

TILLING 技術(shù)是在其他作物中很成熟的一種篩選目的基因突變體的方法。隨著花生野生種和栽培種基因組測序的完成,將會有越來越多的功能基因被克隆鑒定,這對于研究基因功能具有重要作用。應(yīng)完善花生TILLING 篩選平臺,充分利用突變體庫,對感興趣基因的突變體進行篩選,并用于基因突變后代表型的鑒定。

4.2 優(yōu)化花生組培再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系,建立穩(wěn)定的花生CRISPR 技術(shù)

CRISPR 技術(shù)可以實現(xiàn)對目的基因的精確改變,是實現(xiàn)花生遺傳改良或功能基因研究的一種強有力手段。Yuan 等[58]借助該技術(shù)在花生原生質(zhì)體和發(fā)根中實現(xiàn)了對FAD2基因的定點修飾。目前,雖然有不少花生轉(zhuǎn)基因成功的報道,但是鮮有利用CRISPR 技術(shù)實現(xiàn)對花生目的基因修飾并穩(wěn)定遺傳的報道,這可能與花生遺傳轉(zhuǎn)化體系不成熟等有關(guān)。因此,迫切需要優(yōu)化花生組培再生及遺傳轉(zhuǎn)化平臺,建立穩(wěn)定的花生CRISPR 定點突變技術(shù),以實現(xiàn)對花生重要功能基因的精確修飾。