趙晉鋒 杜艷偉 王高鴻 李顏方 趙根有 余愛麗

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所/特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西長(zhǎng)治 046011)

CBL 互作蛋白酶(CBL-interacting protein kinase,CIPK)是具有絲氨酸/蘇氨酸結(jié)合位點(diǎn)的一類蛋白激酶[1]。研究表明,CIPK 包括N 端催化結(jié)構(gòu)域和C 端調(diào)控結(jié)構(gòu)域,其催化結(jié)構(gòu)域類似于SNF1 蛋白激酶結(jié)構(gòu)域[2]。CIPK是其上游類鈣調(diào)磷酸酶B 亞基蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)的靶蛋白,依靠與CBL 互作形成復(fù)合物傳遞信號(hào)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)下游相關(guān)應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫[3]。在CIPK 調(diào)控域包含1個(gè)保守的FISH(稱為NAF)基序,是介導(dǎo)CIPKs與CBLs 互作所必需的結(jié)構(gòu)域[4-5]。CIPK 多基因家族在植物界廣泛存在,如在苔蘚、蕨類、裸子植物及被子植物中均發(fā)現(xiàn)有CIPK基因。目前已在多種植物中克隆到了CIPK基因,如擬南芥、水稻[6]、玉米[7]、小麥[8]、高粱[9]、棉花[10]、楊樹[11]、亞洲梨[12]、葡萄[13]等。前人研究表明,CBL/CIPK 網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在植物響應(yīng)環(huán)境脅迫中起著非常重要的作用,如參與鹽脅迫、高鎂脅迫、營(yíng)養(yǎng)元素(低鉀、低氮、低磷)脅迫、氧化脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫、高pH值脅迫及激素信號(hào)應(yīng)答等生理生 化 過(guò) 程[14-16]。其中,AtCIPK1被報(bào)道能與AtCBL1或AtCBL9 互作,在干旱脅迫下維持植物細(xì)胞的滲透平衡[17],OsCIPK23 過(guò)量表達(dá)能激活或調(diào)控多種抗旱相關(guān)基因的表達(dá),參與對(duì)干旱的響應(yīng)[18]。AtCIPK6表達(dá)受鹽、滲透脅迫和脫落酸(abscisic acid,ABA)強(qiáng)烈誘導(dǎo),在細(xì)胞內(nèi)鈉離子外排方面起重要作用[19-20],水稻OSCIPK6和OSCIPK16 受干旱、ABA和低溫誘導(dǎo),表明它們可能參與干旱、低溫、鹽等逆境脅迫和ABA 應(yīng)答[21],ZmCIPK21 受鹽、高溫、ABA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[22]。綜上,CBL/CIPK 網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在植物對(duì)非生物逆境應(yīng)答以及植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵調(diào)控作用。因此,通過(guò)對(duì)CIPK基因功能的深入研究了解植物逆境應(yīng)答機(jī)制對(duì)于基因工程方法改良作物抗逆性具有一定應(yīng)用價(jià)值和理論意義。

在前期研究谷子CBL和CIPK工作的基礎(chǔ)上[23-24],本研究對(duì)SiCIPK19基因的結(jié)構(gòu),蛋白特征、理化特性,啟動(dòng)子區(qū)域順式元件預(yù)測(cè)以及基因進(jìn)化等方面進(jìn)行了系統(tǒng)分析,利用實(shí)時(shí)定量PCR 方法分析SiCIPK19基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)模式,并研究其在谷子不同生育期干旱條件下的表達(dá)情況,旨在為進(jìn)一步揭示谷子CIPK基因在逆境脅迫應(yīng)答中的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以測(cè)序谷子品種豫谷1號(hào)為材料,保存于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所生物技術(shù)科室。

逆轉(zhuǎn)錄酶、LATaqDNA 聚合酶和RNA 酶抑制劑,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;TRIzol 及其他試劑均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 前處理試驗(yàn)

按照Shinozaki 等[25]的方法,在谷子幼苗三葉期分別對(duì)其進(jìn)行20% 聚乙二醇6000(PEG 6000)、鹽(250 mmol·L-1NaCl)、ABA (100 μmol·L-1)和低溫(4℃) 脅迫處理,分別于處理0(CK)、1、3、6、12和24 h后整株取樣。在旱棚種植豫谷1號(hào),對(duì)照組(control,CK)生育期內(nèi)正常澆水;干旱處理只澆3次關(guān)鍵水,其他農(nóng)田管理措施相同。所有樣品葉片取樣后立即在-80℃冰箱中速凍備用。試驗(yàn)均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 植物總RNA提取和引物設(shè)計(jì)

植物總RNA提取參照TRIzol 試劑盒使用說(shuō)明提取所有材料,試驗(yàn)所需其他試劑參照《分子克隆》第3版配制[26]。根據(jù)SiCIPK19、SiGAPB轉(zhuǎn)錄序列,用軟件PrimerPrimer 5.0 設(shè)計(jì)SiCIPK19、SiGAPB的RT-qPCR特異性引物,由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4 基因發(fā)掘和生物信息學(xué)分析

用已知擬南芥CIPK 蛋白序列在谷子數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)發(fā)現(xiàn)其同源序列SiCIPK19 (Seita.5G145900)。蛋白理化特性、氨基酸組成、一二級(jí)結(jié)構(gòu)等在ExPASy 網(wǎng)站(https://prosite.expasy.org)在線工具預(yù)測(cè);SiCIPK19潛在功能用Profun 2.2 Server 預(yù)測(cè),信號(hào)肽用SignalP 4.1 Server進(jìn)行分析;SiCIPK19 編碼蛋白亞細(xì)胞定位用Psort 在線工具預(yù)測(cè);SiCIPK19 氨基酸同源性序列用BLAST 工具在NCBI 上查找。候選基因序列比對(duì)用ClustalX1.83 軟件分析;不同物種CIPK基因[SbCIPK5(高粱),ZmCIPK15(玉米),OsCIPK5(水稻),TaCIPK5(小麥),AtCIPK6(擬南芥),SiCIPK6、16、19(谷子),PsCIPK(北美云杉),PpCIPK(小立碗蘚),其蛋白序列號(hào)分別為XP_002454972.1、ACG36627.1、XP_015621591.1、AJR22390.1、NP_194825.1、XP_004973551.1、XP_004956833.1、XP_012701746.1、ABK24914.1和ACQ83473.1]進(jìn)化樹用Mega 4.1 軟件構(gòu)建[27]。

1.5 RT-qPCR分析

樣品總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,均一化后作為RT-qPCR 模板,以SiGAPB作為內(nèi)參基因。PCR 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性7 s,61℃退火10 s,72℃延伸15 s,共45個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù),采用2-ΔΔCt法[28]計(jì)算基因在某種逆境處理下某個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄水平變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列參數(shù)分析

序列分析顯示,SiCIPK19位于谷子5號(hào)染色體12948718-12950070 區(qū)域,基因組序列長(zhǎng)1 353 bp,編碼450個(gè)氨基酸,該基因只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本,無(wú)可變剪切,cDNA 編碼序列由一個(gè)外顯子構(gòu)成,不含內(nèi)含子。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)顯示,與水稻、高粱、普通小麥中的CIPK5 以及玉米中的CIPK15 同源性較高。由圖1可知,SiCIPK19基因12～266 氨基酸區(qū)域?yàn)榈鞍准っ腹δ苡?311～335 氨基酸為NAF 結(jié)構(gòu)域。此外,SiCIPK19 蛋白序列含有絲氨酸/蘇氨酸激酶功能域(130～142 Aa)、蛋白激酶ATP 結(jié)合域(18～41 Aa)位點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)位點(diǎn)等多個(gè)CIPK 家族基因的特征結(jié)構(gòu)域。推斷SiCIPK19 (Seita.5G145900)是谷子CIPK 家族成員之一。不同物種CIPK 蛋白序列比對(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),SiCIPK19 蛋白與其他物種CIPK 蛋白非常相似,所有比對(duì)序列一致性為67.01%,具有非常保守的序列結(jié)構(gòu)。該基因與高粱(SbCIPK5)、玉米(ZmCIPK15)和水稻(OsCIPK5) 小麥(TaCIPK5)基因同源性非常高,一致性分別為79.88%、76.89%、76.69%和75.50%,而與其他物種(擬南芥、北美云杉、小立碗蘚) 序列一致性相對(duì)較低(圖2)。該結(jié)論一方面說(shuō)明SiCIPK19基因與高粱、玉米、水稻、小麥有較近的親緣關(guān)系,另一方面表明SiCIPK19可能與這些不同物種同源性較高的基因在逆境應(yīng)答或其他信號(hào)途徑中有著相似的功能。

圖1 SiCIPK19 蛋白功能域及功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.1 Domain and functional site prediction of SiCIPK19 protein

圖2 Seita.5G145900 與其他已知CIPK 氨基酸序列比對(duì)分析Fig.2 Sequences alignment of Seita.5G145900 and other known CIPKs

2.2 SiCIPK19基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 SiCIPK19 蛋白參數(shù)分析 參數(shù)分析顯示,SiCIPK19 蛋白分子式為C2280H3613N635O662S19,分子量51.12 kD,等電點(diǎn)(isoelectric point,pI)9.23,平均疏水性(average hydrophobicity,GRAVY)-0.429,脂肪系數(shù)(aliphatic index,AI)82.56,不穩(wěn)定指數(shù)37.95。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示螺旋(包括α-、pi-和3_10-helix)28.67%,β-折疊鏈16.22%,loop 環(huán)為55.11%。溶劑可及性分析顯示,膜外面積占41.33%,膜內(nèi)面積占49.11%,鑲嵌面積占9.56%。亞細(xì)胞位置預(yù)測(cè)SiCIPK19 蛋白被定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(置信度57)。根據(jù)SignalP 4.1 Server 軟件預(yù)測(cè)可知,SiCIPK19 第30位精氨酸殘基具有最高的原始剪切位點(diǎn)分值0.127,第12位酪氨酸具有最高的綜合剪切位點(diǎn)分值0.112,第1位甲硫氨酸殘基具有最高的信號(hào)肽分值0.197。基因氨基酸殘基的加權(quán)平均值為0.107 (小于臨界值0.45)。因此,推測(cè)SiCIPK19基因所編碼的蛋白不存在信號(hào)肽,為非分泌蛋白。

2.2.2SiCIPK19基因啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析和功能預(yù)測(cè) 由表1可知,SiCIPK19 (Seita.5G145900)基因啟動(dòng)子區(qū)域主要包括植物激素應(yīng)答元件(5個(gè))、逆境類應(yīng)答元件(2個(gè))、光應(yīng)答元件(11個(gè))及其他類元件(8個(gè))。Profun 2.2 Server 軟件預(yù)測(cè)顯示,SiCIPK19蛋白在分子功能上可能具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性,雜環(huán)化合物、核苷磷酸、小分子、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合活性,以及轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性。上述結(jié)果表明,SiCIPK19基因可能參與蛋白質(zhì)、大分子、有機(jī)物質(zhì)的合成以及細(xì)胞代謝,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),刺激應(yīng)答及生物調(diào)節(jié)等生物過(guò)程。

2.3 不同非生物逆境脅迫下谷子苗期SiCIPK19基因的表達(dá)分析

由圖3可知,在不同脅迫處理下谷子苗期SiCIPK19的表達(dá)量均有所上調(diào),但其具體表達(dá)動(dòng)態(tài)變化模式不完全相同。20% PEG 6000 脅迫處理1 h時(shí),SiCIPK19表達(dá)量下調(diào)為CK的0.55倍;脅迫處理3～6 h時(shí),SiCIPK19表達(dá)量迅速上調(diào);脅迫處理12 h時(shí),SiCIPK19表達(dá)量急劇上升至最大,為CK的70.66倍。100 μmol·L-1ABA 脅迫下,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),SiCIPK19表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì),脅迫處理12 h時(shí),SiCIPK19表達(dá)量達(dá)到最大值,為CK的53.71倍。250 mmol·L-1NaCl 脅迫時(shí),SiCIPK19表達(dá)量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì),脅迫處理1、3、6、12、24 h時(shí),SiCIPK19表達(dá)量分別為CK的0.48、3.30、10.31、7.56、2.00倍。低溫(4℃)脅迫下,SiCIPK19表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢(shì),脅迫處理1、3、6、12、24 h時(shí),SiCIPK19表達(dá)量分別為CK的1.02、0.73、0.36、0.77、1.98倍。相比之下,20% PEG6000和100 μmol·L-1ABA 脅迫對(duì)SiCIPK19表達(dá)量影響較大,脅迫下SiCIPK19 最高表達(dá)量分別為CK的70.66和53.71倍,而250 mmol·L-1NaCl和低溫(4℃) 脅迫 對(duì)SiCIPK19表達(dá)量影響相對(duì)較小,脅迫下最高表達(dá)量分別為CK的10.31和1.98倍。綜上表明,SiCIPK19 參與了谷子苗期干旱、鹽、低溫和ABA 等逆境脅迫響應(yīng),尤其是在干旱和ABA 信號(hào)途徑中可能起重要作用。

表1 SiCIPK19(Seita.5G145900)基因啟動(dòng)子區(qū)域順式元件預(yù)測(cè)Table1 Putative cis-elements in the promoter of SiCIPK19 (Seita.5G145900)

2.4 干旱處理下谷子不同生育期SiCIPK19基因的表達(dá)分析

由圖4可知,CK 谷子的SiCIPK19基因在拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期表達(dá)量逐步提高,在抽穗期和灌漿期表達(dá)量分別為拔節(jié)期的6.18和7.24倍。在干旱條件下,谷子拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期SiCIPK19基因表達(dá)量分別為CK 拔節(jié)期的8.31、237.23和235.46倍,較CK 相應(yīng)生育期表達(dá)量也大幅度提升,CK 谷子的SiCIPK19基因在各生育期均有表達(dá),揭示在谷子正常生長(zhǎng)條件下該基因在整個(gè)生育期均發(fā)揮了一定作用。在干旱條件下SiCIPK19基因表達(dá)量在拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期均被誘導(dǎo),尤其在抽穗期和灌漿期誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)幾百倍之高。推測(cè)SiCIPK19基因參與了谷子在拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期等不同生育期對(duì)干旱脅迫的響應(yīng),尤其是在抽穗期和灌漿期的干旱應(yīng)答信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用。

圖3 不同脅迫下谷子苗期SiCIPK19基因的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of SiCIPK19 under different stressesing in foxtail millet seedlings

圖4 SiCIPK19基因在谷子不同生育期干旱脅迫下的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of SiCIPK19 of foxtail millet under drought stressesing in different growth stages

3 討論

非生物逆境脅迫中的干旱、鹽、低溫對(duì)植物的影響最為明顯,是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的主要限制因素[29]。CIPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在植物體內(nèi)以多基因家族方式存在。CIPK基因在響應(yīng)逆境脅迫、病原體與防御反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)元素吸收與平衡、激素應(yīng)答等植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,尤其與非生物逆境脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)[14]。谷子是我國(guó)典型的抗旱耐瘠特色作物,因此發(fā)掘谷子中的CIPK基因并在分子水平上闡明其耐逆機(jī)理和調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。要解析CIPKs 功能首先要清楚CIPKs 參與了哪些逆境脅迫應(yīng)答,在哪些逆境信號(hào)通路中起作用。本研究在前期工作基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了位于谷子基因組5號(hào)染色體的谷子的SiCIPK19 (Seita.5G145900)基因,隨后對(duì)該基因的蛋白序列參數(shù)特征、主要功能域等進(jìn)行了詳細(xì)分析,結(jié)果顯示,SiCIPK19基因包含所有CIPK 家族基因的主要特征,表明SiCIPK19基因是谷子CIPK 家族成員之一。

為發(fā)掘SiCIPK19基因的潛在功能,本研究對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。一般來(lái)講,如果基因啟動(dòng)子區(qū)域存在某種順式元件則暗示該基因很可能參與相應(yīng)的信號(hào)途徑[30]。順式元件分析發(fā)現(xiàn),在SiCIPK19 啟動(dòng)子區(qū)域存在逆境類、激素類以及大量的光應(yīng)答元件,預(yù)示SiCIPK19基因很可能參與到這些相應(yīng)的信號(hào)途徑中。此外,谷子苗期逆境表達(dá)分析結(jié)果表明,SiCIPK19 在受到不同逆境脅迫時(shí)其表達(dá)量均被誘導(dǎo)提高,特別是在干旱和100 μmol·L-1ABA 脅迫時(shí)表達(dá)量被強(qiáng)烈誘導(dǎo),說(shuō)明SiCIPK19 參與了谷子苗期干旱、鹽、低溫和ABA 等逆境脅迫響應(yīng),尤其是在干旱和ABA 信號(hào)途徑中起重要作用。干旱處理下谷子不同生育期SiCIPK19基因的表達(dá)分析表明,SiCIPK19基因參與了谷子在拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期等不同生育期對(duì)干旱脅迫的響應(yīng),尤其是在抽穗期和灌漿期的干旱應(yīng)答信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用。本研究不僅驗(yàn)證了在SiCIPK19 啟動(dòng)子區(qū)域存在逆境相關(guān)順式元件,且與已報(bào)道的大量CIPK基因能響應(yīng)非生物逆境應(yīng)答的研究結(jié)果相一致。此外,功能預(yù)測(cè)顯示,SiCIPK19可能參與蛋白質(zhì)、大分子、有機(jī)物質(zhì)的生物合成以及細(xì)胞代謝,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),刺激應(yīng)答以及生物調(diào)節(jié)等生物過(guò)程;順式元件分析也發(fā)現(xiàn)在SiCIPK19 啟動(dòng)子區(qū)域存在眾多激素類應(yīng)答元件(脫落酸、茉莉酮酸甲酯、水楊酸、乙烯),逆境類應(yīng)答元件以及其他類元件,包括厭氧誘導(dǎo)、生長(zhǎng)素、激發(fā)響應(yīng)元件、種子特異調(diào)控元件。表明SiCIPK19基因不僅在逆境應(yīng)答中起關(guān)鍵作用,而且在其他環(huán)境脅迫信號(hào)系統(tǒng)應(yīng)答所涉及的植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化過(guò)程中也可能發(fā)揮一定作用。下一步應(yīng)構(gòu)建SiCIPK19基因的超表達(dá)和缺失載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化谷子進(jìn)一步研究該基因在逆境應(yīng)答中的功能和機(jī)制。此外,在啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了大量的光應(yīng)答元件,而谷子是光溫敏感性作物[31],預(yù)示SiCIPK19基因也可能參與調(diào)控谷子的光溫應(yīng)答調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究系統(tǒng)分析了谷子SiCIPK19 (Seita.5G145900)基因的蛋白結(jié)構(gòu)、特征、功能域、順式元件等參數(shù)特征,證明SiCIPK19 參與了谷子苗期干旱、鹽、低溫和ABA 等逆境脅迫響應(yīng),可能在干旱脅迫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用。本研究豐富和完善了植物CIPK 家族成員,為進(jìn)一步闡明CBL/CIPK 信號(hào)系統(tǒng)在谷子逆境應(yīng)答中的功能、機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。