朱宗文 田守波 楊學東 張 輝 張永平

(上海市農(nóng)業(yè)科學院設施園藝研究所/上海市設施園藝技術(shù)重點實驗室,上海 201403)

輻射誘變是培育作物新品種及創(chuàng)制新種質(zhì)的一種有效方法,常用的誘變源包括60Co-γ射線、紫外線、X射線和激光等[1-3]。自20世紀90年代以來,電子束輻照已成為誘導植物變異的一種新方法。電子束輻照誘變育種是利用電子加速器產(chǎn)生的電子束處理植物種子、花粉或者植物幼苗等,從而誘導植物發(fā)生變異。電子束輻照技術(shù)能量利用率高且操作簡單[3-4],已在多種作物的誘變育種中得到較廣泛的應用。如,黃強等[5]用電子束輻照玉米自交系,獲得了較豐富的遺傳變異;林祖軍等[6]用不同劑量的電子束輻照菊花組培苗、唐菖蒲及百合種球,3種花卉在花期和花色等方面都發(fā)生了一定的變化;張容等[7]用電子束處理小麥干種子,小麥產(chǎn)生了豐富的變異類型;許競早等[8]利用高劑量電子束處理酒精酵母菌株篩選出耐高溫的菌株。目前,在番茄(Solanum lycopersicum)誘變育種中,利用電子加速器進行輻照的報道較鮮見。上海市農(nóng)業(yè)科學院番茄育種課題組曾利用電子束輻照處理番茄種子,發(fā)現(xiàn)電子束會降低種子發(fā)芽率,并對植株生物量的累積和生長形態(tài)造成一定的影響[9-11]。但是上述研究未分析電子束輻照后幼苗體內(nèi)的理化性質(zhì),且無品種間的比較。

植物在遇到逆境時會發(fā)生一系列的生理變化,如改變滲透調(diào)節(jié)和增強抗氧化酶活性等[12-13],從而減少逆境對遺傳物質(zhì)的損傷[14]。本研究選用兩個番茄品種的干種子,用不同劑量的電子束進行處理,分析輻照后種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),并進一步分析M0幼苗體內(nèi)的生理生化特性,了解電子束輻照對番茄生理特性的影響,以期為電子束誘變技術(shù)應用于番茄及其他作物的誘變育種提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄品種:黃盆栽和1479,兩品種的種子在2008年同一批次收獲,由上海市農(nóng)業(yè)科學院提供。

預試驗結(jié)果證明,同一批次的番茄種子發(fā)芽率相同,且發(fā)芽整齊度一致。

1.2 輻照處理試驗

將以上兩個番茄品種的干種子分別裝入牛皮紙袋,用電子束進行輻照處理,輻照劑量分別為200、300、400、500、600 Gy,以未輻照種子為對照。每個處理100粒種子,設3次重復。電子束處理試驗由上海市農(nóng)業(yè)科學院束能輻照技術(shù)有限公司利用日本IHI公司生產(chǎn)的ESS-010-03型電子直線加速器進行操作,額定能量10 MeV,功率10 kW。

1.3 種子發(fā)芽試驗

將經(jīng)過輻照的種子和對照種子一起在恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)進行發(fā)芽試驗,每個處理100粒種子,設3次重復。在透明塑料發(fā)芽盒(12 cm×12 cm×5 cm)內(nèi)鋪2層發(fā)芽紙,把種子放在發(fā)芽紙上,保持恒溫25℃。從培養(yǎng)第3天開始,到第14天為止,每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)和幼苗生長情況。各項發(fā)芽指標計算公式如下:

式中,Nt表示在td時的發(fā)芽種子個數(shù);Dt表示相應的發(fā)芽天數(shù);N表示種子總數(shù);H表示發(fā)芽終期幼苗的高度,cm。

1.4 播種和定植試驗

將每個處理約100粒種子分別播種到無孔穴盤內(nèi),待植株長出真葉時,在不同處理間選取長勢較好、生長相對一致的植株移植于32 孔穴盤。每個處理32株。無孔穴盤所用基質(zhì)為草炭∶蛭石=2 ∶1(v/v)。

1.5 番茄幼苗各項生理指標的測定

待番茄幼苗長出6～8片葉時,選取植株上部3～5片新鮮葉片,稱取0.2 g。把葉片洗凈后置于預冷的研缽中(-20℃),加入2 mL 預冷(-20℃)的磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1,pH值7.8),在冰浴上研磨成勻漿,轉(zhuǎn)入離心管中,低溫(4℃) 12 000 ×g離心20 min,取上清液用于抗氧化酶活性的測定[14]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測定采用氮藍四唑(nitrogen blue tetrazole,NBT) 法[15],過 氧 化 物 酶(peroxidase,POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[15],過氧化氫酶(catalase,CAT)活性測定采用紫外吸收法[16]。

對于輻照處理,選取生長發(fā)育較典型的植株,取自上向下數(shù)第4片完全展開葉測定丙二醛(malondialdehyde,MDA)、游離脯氨酸(proline,Pro)、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量。采用硫代巴比妥酸法(thiobarbiturate,TBA)[15]測定MDA含量,考馬斯亮藍G-250 法測定可溶性蛋白含量,蒽酮比色法測定可溶性糖含量,磺基水楊酸法測定Pro含量[17]。以上每項生理指標的測定,每處理均設3次重復。

1.6 統(tǒng)計分析

用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件和Microsoft Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束處理對番茄種子萌發(fā)的影響

黃盆栽和1479的干種子經(jīng)電子束輻照后,其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)(Gi)和活力指數(shù)(Vi)都發(fā)生了變化,但是電子束對兩品種番茄種子的影響不完全相同(表1)。對于1479,當輻照劑量為200和300 Gy時,其發(fā)芽率與CK 無顯著差異,當輻照劑量達400 Gy后,其發(fā)芽率開始顯著下降,而當輻照劑量達到600 Gy時,種子發(fā)芽率僅為CK的77.2%;同時,1479的Gi和Vi都隨著輻照劑量的增加而降低,輻照劑量達到300 Gy時,Gi和Vi均顯著低于CK;輻照劑量為600 Gy時,Gi和Vi分別為8.4和11.6,僅分別為CK的38.0%和10.2%,且Vi下降幅度大于Gi,這主要是因為輻照處理嚴重抑制了胚芽和胚根的生長。而對于黃盆栽種子,當輻照劑量為200～600 Gy時,其發(fā)芽率與CK均無顯著差異;當輻照劑量為200～400 Gy時,黃盆栽種子的Gi和Vi均顯著高于CK,而輻照劑量達到500～600 Gy時,黃盆栽種子Gi與對照無顯著差異,Vi開始顯著低于CK,且隨著輻照劑量的增加而快速降低。上述結(jié)果表明,番茄種子發(fā)芽率會隨著電子束輻照劑量的增加而降低,且兩個番茄栽培品種對電子束敏感性不同,1479 較黃盆栽更敏感。

2.2 電子束處理對番茄幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖1可知,1479和黃盆栽的種子經(jīng)電子束處理后,其幼苗葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量明顯增加,且隨著輻照劑量的增加而增加。但2個番茄品種對電子束的反應不同。對于1479,當輻照劑量為200 Gy時,幼苗葉片中可溶性蛋白含量顯著下降,僅為CK的30.77%,繼續(xù)增加輻照劑量,其可溶性蛋白含量緩慢上升,當輻照劑量達到600 Gy時,幼苗葉中可溶性蛋白含量達到2.31 mg·g-1FW,顯著高于CK,是CK的126.92%;對于黃盆栽,當輻照劑量為200和300 Gy時,其幼苗葉片中可溶性蛋白含量與CK 無顯著差異,繼續(xù)增加輻照劑量,葉片中可溶性蛋白含量顯著增加,當輻照劑量達到600 Gy時,幼苗葉片中可溶性蛋白含量達到最大值(6.24 mg·g-1FW),顯著高于CK,是CK的183.46%。

表1 電子束處理對番茄種子萌發(fā)的影響Table1 Effects of electron beam treatment on the seed germination rate of tomato

圖1 電子束處理對番茄幼苗葉片中可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effects of electron beam treatment on the soluble protein content in tomato seedlings

番茄種子經(jīng)電子束處理后,幼苗中可溶性糖含量總體呈升高趨勢(圖2)。在本試驗輻照劑量范圍內(nèi),隨著輻照劑量的增加,黃盆栽幼苗葉片中可溶性糖含量表現(xiàn)出緩慢上升趨勢,而1479 幼苗葉片中可溶性糖含量的變化比較復雜。對于1479,當輻照劑量為200 Gy時,幼苗葉片中可溶性糖含量顯著低于CK;當輻照劑量為300～500 Gy時,幼苗葉片中可溶性糖含量隨著輻照劑量的增加而增加;當輻照劑量達到500 Gy時,可溶性糖含量達到最大值(2.53 mg·g-1FW),為CK的202.4%;而當輻照劑量達到600 Gy時,其可溶性糖含量迅速下降至1.87 mg·g-1FW,為CK的149.6%。

圖2 電子束處理對番茄幼苗葉片中可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of electron beam treatment on the soluble sugar content in tomato seedlings

番茄種子經(jīng)電子束處理后,其幼苗葉片中Pro含量隨輻照劑量的增加呈直線上升趨勢(圖3)。當輻照劑量為600 Gy時,兩番茄品種幼苗葉片中Pro含量都達到最大值,其中,1479 幼苗葉片中Pro含量為2.4 μg·g-1FW,為CK的338.03%;黃盆栽中Pro含量為5.32 μg·g-1FW,為CK的217.14%。

圖3 電子束處理對番茄幼苗葉片中Pro含量的影響Fig.3 Effects of electron beam treatment on the free proline content in tomato seedling

綜上,電子束處理顯著影響了番茄幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量。兩番茄品種幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白和Pro含量總體都隨著輻照劑量的增加呈上升趨勢,1479 幼苗葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量在低劑量(200 Gy)處理時出現(xiàn)顯著下降,而后隨著輻照劑量增加呈現(xiàn)上升趨勢,而黃盆栽無此現(xiàn)象。

2.3 電子束處理對番茄幼苗葉片MDA含量和抗氧化酶活性的影響

由圖4可知,兩番茄品種種子經(jīng)過電子束處理后,其幼苗葉片中MDA含量隨輻照劑量的增加而增加。對于1479,當輻照劑量為0～300 Gy時,幼苗葉片中MDA含量隨著輻照劑量的增加而緩慢增加;當輻照劑量為400～600 Gy時,幼苗葉片中MDA含量隨著輻照劑量的增加而快速增加;當輻照劑量達到600 Gy時,其MDA含量達到最大值(6.54 μmol·g-1FW),為CK的416.56%。對于黃盆栽,當輻照劑量為0～500 Gy時,其幼苗葉片中MDA含量一直緩慢增加,當輻照劑量達到600 Gy時,幼苗葉片中MDA含量開始迅速增加,并達到最大值(7.52 μmol·g-1FW),為CK的204.91%。

圖4 電子束處理對番茄幼苗葉片中MDA含量的影響Fig.4 Effects of electron beam treatment on the MDA content in tomato seedlings

番茄種子經(jīng)電子束輻照后,其幼苗葉片中SOD活性也發(fā)生了明顯的變化,但兩品種呈現(xiàn)不同的變化趨勢(圖5)。當輻照劑量低于300 Gy時,1479 幼苗葉片中SOD活性隨著輻照劑量的增加而升高;當輻照劑量為300 Gy時,其SOD活性達到最大值(153.04 U·g-1FW),為CK的138.11%;當輻照劑量高于300 Gy后,幼苗葉片中SOD活性隨著輻照劑量的增加而逐漸降低,輻照劑量達到600 Gy時,SOD活性降為113.66 U·g-1FW,為CK的102.57%。黃盆栽種子經(jīng)電子束輻照后,其幼苗葉片中SOD活性隨輻照劑量的增加而升高;當輻照劑量為0～300 Gy時,其SOD活性增加非常緩慢;當輻照劑量為400～600 Gy時,葉片中SOD活性迅速升高,且在輻照劑量為600 Gy時達到最大值(280.31 U·g-1FW),為CK的146.50%。

圖5 電子束處理對番茄幼苗葉片中SOD活性的影響Fig.5 Effects of electron beam treatment on the SOD activity in tomato seedlings

兩番茄品種種子經(jīng)電子束輻照后,其幼苗葉片中POD活性總體呈升高趨勢,但兩品種對電子束的反應不同(圖6)。對于1479,當輻照劑量為0～300 Gy時,幼苗葉片的POD活性隨著輻照劑量的增加而升高;當輻照劑量為400 Gy時,POD活性下降,與CK 無顯著差異;當輻照劑量大于500 Gy時,POD活性又隨著輻照劑量的增加急劇上升,且在輻照劑量為600 Gy時達到最大值(77.75 U·g-1FW)。對于黃盆栽,其幼苗葉片中POD活性隨著輻照劑量的增加一直緩慢升高,輻照劑量為600 Gy時,POD活性達到最大值(51.98 U·g-1FW),為CK的142.65%。

圖6 電子束處理對番茄幼苗葉片中POD活性的影響Fig.6 Effects of electron beam treatment on the POD activity in tomato seedlings

番茄種子經(jīng)過電子束處理后,其幼苗葉片中CAT活性變化趨勢完全不一致,甚至在一定的輻照劑量范圍內(nèi),兩品種的CAT活性呈現(xiàn)相反的變化趨勢(圖7)。對于1479,當輻照劑量為0～400 Gy時,幼苗葉片中CAT活性隨著輻照劑量的增加出現(xiàn)小幅度波動;當輻照劑量為500 Gy時,幼苗葉片CAT活性降至最低值(310.28 U·g-1FW);輻照劑量增加到600 Gy時,CAT活性又急劇上升,達到最高值(376.16 U·g-1FW)。對于黃盆栽,隨著輻照劑量的增加,幼苗葉片中CAT活性總體呈降低趨勢,但輻照劑量為300 Gy時,幼苗葉片中CAT活性較CK 略有升高;當輻照劑量為600 Gy時,幼苗葉片中CAT活性降至最低值(323.46 U·g-1FW),為CK的91.02%。

圖7 電子束處理對番茄幼苗葉片中CAT活性的影響Fig.7 Effects of electron beam treatment on the CAT activity in tomato seedlings

綜上,電子束處理顯著影響了番茄幼苗MDA含量和抗氧化酶活性。兩個番茄品種MDA含量都隨輻照劑量的增加呈現(xiàn)一致的上升趨勢;隨著輻照劑量的增加,1479 幼苗葉片SOD活性呈先上升后下降趨勢,POD活性呈先上升再下降而后又上升的趨勢;CAT活性總體變化不大;而黃盆栽幼苗葉片SOD和POD活性都隨輻照劑量增加呈現(xiàn)上升趨勢,CAT活性在低劑量(低于300 Gy)輻照處理時無顯著變化,在高劑量(高于300 Gy)輻照處理時呈緩慢下降趨勢。

3 討論

在輻射誘變育種過程中,適宜的輻照劑量是有效誘變的關(guān)鍵。研究表明,低劑量輻射可以促進種子萌發(fā),而過高劑量輻射會抑制種子活力[18-21]。目前關(guān)于輻照適宜劑量的研究大多集中在γ射線[18,22-23]等傳統(tǒng)的輻射方式,對電子束誘變研究較少,關(guān)于電子束適宜輻照劑量的研究更鮮見。本研究利用不同輻照劑量的電子束處理1479和黃盆栽兩個番茄品種的干種子,當電子束劑量為600 Gy時(本試驗中的最高輻照劑量),番茄種子胚的結(jié)構(gòu)及種子萌發(fā)的生理過程產(chǎn)生了一定的變化,種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都顯著降低,但未達到半致死劑量。此外,兩番茄品種種子對電子束輻照處理的反應不完全相同,在高劑量電子束處理下,1479種子活力較黃盆栽種子下降幅度大,即1479種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)較黃盆栽種子下降快。由此可見,黃盆栽種子抗電子束輻照能力強于1479種子,這與前人利用γ 輻射處理種子的研究結(jié)果[19-21,23]類似。

電子束輻照后,生物體的細胞膜、細胞器及遺傳物質(zhì)等都會受到不同程度的損傷[24-25],但是生物體可以通過滲誘調(diào)節(jié)在一定程度上減緩傷害。本試驗測定了番茄幼苗葉片中可溶性蛋白、可溶性糖及Pro含量,發(fā)現(xiàn)隨著輻照劑量的增加,幼苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、Pro含量都呈增加趨勢,其中Pro含量增加尤其明顯。這與前人研究結(jié)果[26-28]類似,但也有不同之處。其原因可能是電子束輻照引起了一些遺傳物質(zhì)的改變,導致相應蛋白的合成發(fā)生變化。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對于植株體本身抵抗外來逆境具有重要意義,因而在受到輻照時會發(fā)生顯著的變化。本研究中Pro含量增加最為明顯,很可能是Pro 合成及降解途徑相關(guān)酶活性發(fā)生變化導致了Pro的大量積累。因此,電子束處理不但改變了番茄種子活力,而且顯著影響了其幼苗的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

此外,植株體受到逆境脅迫時會發(fā)生膜脂過氧化,導致MDA含量的積累,造成植株體相應細胞器及一些器官的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)兩番茄品種幼苗葉片MDA含量都隨著輻照劑量的增加呈現(xiàn)上升趨勢,說明電子束輻照處理導致了膜脂過氧化,對細胞膜造成了一定的破壞。這與吳建慧等[26]和李杰等[29]的研究結(jié)果較為一致。電離輻射會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS 會誘導生物體內(nèi)抗氧化酶活性升高,這也在一定程度上減緩了電子束造成的傷害[30-31]。因此,番茄種子受到電子束輻照后,其幼苗體內(nèi)氧化酶活性也會相應升高[11]。本研究分析了番茄幼苗中SOD、POD和CAT 3種抗氧化酶活性的變化,發(fā)現(xiàn)當電子束輻照劑量較低時,1479 幼苗葉片中SOD和POD活性隨輻照劑量的增加而升高,而當輻照劑量較高時,這2種氧化酶活性會隨輻照劑量的增加而降低或變化無規(guī)律;對于黃盆栽,其幼苗葉片中SOD和POD活性一直隨著電子束輻照劑量的增加而升高。上述結(jié)果表明,黃盆栽抗輻射能力較強,而1479 對輻射更為敏感。但這兩個番茄品種中,幼苗葉片中CAT活性均未隨輻射劑量的增加而表現(xiàn)出特定的變化趨勢,甚至黃盆栽幼苗CAT活性隨著輻射劑量的增加而降低。這與前人研究結(jié)果[21,27]不完全一致,有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究用5種不同劑量的電子束輻照處理兩個品種的番茄種子,分析電子束處理對番茄種子萌發(fā)及幼苗生理生化的影響。結(jié)果表明,隨著電子束輻照劑量的增加,番茄種子的發(fā)芽率逐漸降低,當輻照劑量為600 Gy時,黃盆栽和1479種子發(fā)芽率分別為CK的97.2%和77.2%。此外,電子束處理使幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)出現(xiàn)大量積累,抗氧化酶活性也發(fā)生一定的變化,但不同番茄品種對電子束輻照的抗性存在差異。從種子萌發(fā)和幼苗生理生化指標的變化可知,電子束輻照處理對番茄幼苗生長的影響效果顯著,不同品種間差異顯著。因而,輻照誘變是一個復雜的過程,具有誘變的不確定性和盲目性,需要確定合適的誘變劑量和相應的檢測手段。