邱 局 程首超

咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院（湖北咸寧 437100）

丙酮酸激酶缺乏癥（pyruvate kinase deficiency，PKD）是一種常見(jiàn)的遺傳性紅細(xì)胞酶相關(guān)疾病，可引起遺傳性非球形紅細(xì)胞溶血性貧血，是僅次于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的最常見(jiàn)紅細(xì)胞酶病，為常染色體隱性遺傳[1-2]。丙酮酸激酶是糖酵解過(guò)程中關(guān)鍵的限速酶之一，催化磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸嵬瑫r(shí)產(chǎn)生ATP 供能[3]。PKLR基因編碼丙酮酸激酶關(guān)鍵同工酶，該基因異?？蓪?dǎo)致紅細(xì)胞對(duì)鉀離子通透性增強(qiáng)，致使紅細(xì)胞膜鈉鉀泵供能障礙，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞在肝脾及骨髓內(nèi)破壞發(fā)生溶血。PKD臨床診斷較為困難，基因檢測(cè)可協(xié)助臨床診斷。本研究通過(guò)對(duì)2 個(gè)PKD家系的回顧分析，探討PKD的臨床及致病基因突變特點(diǎn)。

1 臨床資料

例1，女，3 歲8 個(gè)月，因面色蒼白3 年余就診。患兒生后有新生兒高膽紅素血癥，予以藍(lán)光照射治療。5 個(gè)月時(shí)因皮膚、鞏膜黃染加重在外院輸血治療后好轉(zhuǎn)。半年前因肺炎入院，發(fā)現(xiàn)血紅蛋白（Hb）＜50 g/L，再次輸血治療。患兒父母身體健康，無(wú)類似疾病家族史。體格檢查：面色及鞏膜黃染，口唇蒼白，身高92 cm（-2SD），體質(zhì)量11.5 kg（-2SD），多動(dòng)，語(yǔ)言發(fā)育落后于同齡兒童，腹部平坦，肝脾肋下未觸及。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)紅細(xì)胞2.34×1012/L，Hb 60 g/L，平均紅細(xì)胞體積（MCV）92.0 f L，網(wǎng)織紅細(xì)胞（RET）0.086，血清鐵 32.5 μmol/L，鐵蛋白 136.5 μg/L，Coombs實(shí)驗(yàn)陰性，Hams 實(shí)驗(yàn)陰性；血涂片示紅細(xì)胞大小不均、偏大，可見(jiàn)嗜多色性紅細(xì)胞。

例2，女，3歲10個(gè)月，因面色蒼白，反復(fù)咳嗽2周就診。患兒6月齡體檢時(shí)提示貧血，1歲6個(gè)月時(shí)因肺炎入院發(fā)現(xiàn)Hb＜60 g/L，輸血治療后貧血好轉(zhuǎn)。住院期間骨髓細(xì)胞學(xué)檢查提示增生性貧血。患兒父母體檢未見(jiàn)異常，無(wú)類似疾病家族史?；純浩綍r(shí)體弱。入院體格檢查：全身皮膚發(fā)黃，口唇、甲床蒼白，鞏膜黃染；身高93 cm（-2SD），體質(zhì)量12.2 kg（-2SD），語(yǔ)言、運(yùn)動(dòng)發(fā)育可；肝肋下3 cm，脾肋下3 cm。實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞2.87×1012/L，Hb 56 g/L，MCV 90.0fL，RET 0.057，血清鐵33.8 μmol/L，鐵蛋白 225.5 μg/L，Coombs實(shí)驗(yàn)陰性；血涂片示紅細(xì)胞輕度大小不均，余未見(jiàn)明顯異常。腹部B超提示膽囊結(jié)石。

為進(jìn)一步明確診斷，經(jīng)咸寧市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)，家屬知情同意，對(duì)患兒進(jìn)行致病基因檢測(cè)。采集患者及其家屬的外周靜脈血各2 mL，委托第三方公司進(jìn)行全外顯子（WES）測(cè)序，并利用Sanger測(cè)序驗(yàn)證。以全血基因組核酸提取試劑盒提取基因組DNA，致病基因PKLR的引物由上海生工合成；PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，例1患兒PKLR基因存在復(fù)合雜合突變，c.106G>T以及c.817C>T（NM_000298），其中c.106G>T突變遺傳自父親，導(dǎo)致基因編碼的蛋白36位由甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸（p.Ala 36 Ser）；c.817 C>T 錯(cuò)義突變遺傳自母親，導(dǎo)致編碼273 位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔╬.Arg273Cys）；患兒的弟弟及姑姑均為c.106G>T突變攜帶者。見(jiàn)圖1。例2患兒PKLR基因存在復(fù)合雜合突變，c.1279G>T以及IVS6-1G>T，其中c.1279G>T突變遺傳自母親，使編碼的427 位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)榻K止密碼子（p.Glu427Term）；IVS6-1G>T剪接位點(diǎn)突變遺傳自父親；患兒的姑姑為IVS 6-1G>T突變攜帶者。見(jiàn)圖2。檢索數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，c.106G>T和 c.1279 G>T 為已知的致病突變（HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)中有收錄）；IVS 6-1 G>T 突變位于經(jīng)典的保守剪接位點(diǎn)區(qū)域，依據(jù)ACMG指南，為致病性證據(jù)非常強(qiáng)的突變，突變可引起PKLR基因RNA異常剪接；c.817C>T突變?cè)谇嘶蚪M以及HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄，mutationtaster在線軟件預(yù)測(cè)為致病性改變，Polyphen2及SIFT軟件預(yù)測(cè)突變影響蛋白質(zhì)的功能。

圖1 例1 家系圖及PKLR 基因測(cè)序圖

圖2 例2 家系圖及PKLR 基因測(cè)序圖

取患兒新鮮靜脈血1 mL，裂解紅細(xì)胞后得到白細(xì)胞，利用Trizol 方法提取總RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用PKLR基因特異性生物引物進(jìn)行相對(duì)定量分析（以GAPDH 為內(nèi)參基因）。結(jié)果顯示，相對(duì)于同齡健康對(duì)照，例1 的PKLR基因表達(dá)量未見(jiàn)異常，例2的PKLR基因表達(dá)水平顯著下降。推測(cè)例1的2個(gè)錯(cuò)義突變未影響PKLR基因轉(zhuǎn)錄，而例2 的剪接位點(diǎn)突變可能影響基因表達(dá)，熒光定量PCR結(jié)果顯示與同齡的正常對(duì)照相比，例2 的PKLR基因mRNA 水平顯著降低（P＜0.001）

2 討論

PKD的貧血嚴(yán)重程度不一，部分患兒在新生兒期即發(fā)生高膽紅素血癥，需要輸血治療。隨著年齡增長(zhǎng)，PKD 的貧血程度可減輕[4]。成年P(guān)KD 患者貧血癥狀較為穩(wěn)定，但在感染、疲勞等條件下貧血可加重。此外PKD患者也常伴有黃疸、脾大以及膽囊結(jié)石等癥狀[5]。紅細(xì)胞酶活性測(cè)定是診斷PKD的金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)酶活性測(cè)定可幫助大多數(shù)患者明確診斷，但仍有部分患者酶活性變化不顯著而需要基因檢測(cè)或其他方法協(xié)助診斷[6]。本研究由于實(shí)驗(yàn)室條件限制，未檢測(cè)紅細(xì)胞酶活性。

PKD在全球均見(jiàn)報(bào)道，但多數(shù)分布在北歐地區(qū)[7]。PKLR基因突變是導(dǎo)致PKD的常見(jiàn)病因。截止到目前，已經(jīng)報(bào)道的PKLR基因約有300種，包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、堿基插入缺失等類型，且存在熱點(diǎn)突變。美國(guó)、歐洲地區(qū)1529A和1456T突變常見(jiàn)，而亞洲地區(qū)1468T為熱點(diǎn)[6,8]。

本組2 例患兒均表現(xiàn)為面色蒼黃，皮膚黃染，貧血貌，均有輸血史。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hb嚴(yán)重低下，骨髓涂片顯示增生性貧血。對(duì)患兒及其父母等進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2 例患兒的PKLR基因均存在復(fù)合雜合變異。例1為c.106G>T以及c.817C>T 復(fù)合雜合突變，其中c.106G>T是已經(jīng)報(bào)道的致病突變，而c.817C>T文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)收錄。生物信息學(xué)分析c.817 C>T在不同的物種之間保守、且突變影響蛋白的功能，依據(jù)ACMG指南，其可能為致病突變；例2為c.1279G>T和IVS 6-1 G>T 復(fù)合雜合突變，其中剪接位點(diǎn)突變IVS 6-1 G>T 位于經(jīng)典的剪接區(qū)域（內(nèi)含子6 的3’受體端），依據(jù)RNA加工成熟機(jī)制推測(cè)其可能導(dǎo)致外顯子跳躍，影響mRNA 成熟。對(duì)患兒外周血PKLR基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于同齡正常對(duì)照，例1的PKLR基因表達(dá)水平未見(jiàn)明顯異常，而例2 的PKLR基因表達(dá)顯著下降，推測(cè)剪接位點(diǎn)突變影響mRNA 成熟，導(dǎo)致RNA 易降解。依據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)以及基因檢測(cè)結(jié)果，2例患兒均可診斷為PKD。

目前PKD的主要治療方法為維持Hb水平穩(wěn)定的輸血治療、脾切除治療以及造血干細(xì)胞移植[9]。通過(guò)紅細(xì)胞輸注可使Hb水平維持在70～90 g/L的水平，但需要長(zhǎng)期治療以滿足患兒的生長(zhǎng)和發(fā)育；脾切除已被證實(shí)可有效提高PKD的Hb水平及網(wǎng)織紅細(xì)胞總數(shù)[10]。理論上，造血干細(xì)胞移植可治愈PKD。研究發(fā)現(xiàn)，采用同胞供者骨髓干細(xì)胞移植治療PKD，3年后患兒Hb水平及丙酮酸激酶活性均正常[11]，但仍需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。本組2例患兒目前均接受紅細(xì)胞輸注治療，需要進(jìn)一步觀察預(yù)后。

綜上所述，PKD 臨床表現(xiàn)為不同程度的貧血，皮膚、鞏膜黃染等，疾病相關(guān)基因檢測(cè)可幫助臨床盡早診斷，并進(jìn)行對(duì)癥治療及遺傳咨詢。此外，發(fā)現(xiàn)2個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的PKLR基因突變，豐富了基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，為今后該疾病的研究提供一定的參考。