王依朝, 樊 麗, 王紅霞, 楊思路, 崔雅妮,段奕鋆, 段靜靜, 任來峰, 蘇 文

(1. 山西醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030013； 2. 山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究所，太原 030013)

基因組不穩(wěn)定是腫瘤的標(biāo)志性特征之一。各種內(nèi)外源性基因毒因素如紫外線、電離輻射(ionize radiation，IR)、化學(xué)因素、活性氧、DNA復(fù)制錯(cuò)誤等皆可誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA損傷，包括單鏈斷裂(single strand breaks,SSBs)、鏈間二聚體及雙鏈斷裂(double strand breaks,DSBs)等而引起基因組不穩(wěn)定[1]。DNA損傷形成后，可激活細(xì)胞內(nèi)稱為DNA損傷應(yīng)答的精密調(diào)控反應(yīng)，招募一系列的損傷應(yīng)答蛋白到損傷位點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯修復(fù)損傷的DNA或誘導(dǎo)凋亡清除修復(fù)無望的細(xì)胞，維持基因組穩(wěn)定性[2-3]。

DSBs損傷是最為嚴(yán)重的DNA損傷類型，其修復(fù)主要通過非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HR)兩種方式[2]。DSBs損傷形成后其斷裂點(diǎn)的組蛋白H2AX(組蛋白H2A變體)139位絲氨酸被迅速磷酸化形成所謂的γH2AX而參與DNA損傷應(yīng)答過程，用特異性抗體染色后可在熒光顯微鏡下看到相應(yīng)的焦點(diǎn)(foci)，γH2AX foci分析已被公認(rèn)為是DSBs損傷的標(biāo)志之一[4-5]。53BP1是另外一種參與DSBs損傷應(yīng)答的關(guān)鍵蛋白，其foci分析也成為評(píng)價(jià)DSBs損傷的標(biāo)志[3]。RAD51則是參與DSBs的HR修復(fù)的關(guān)鍵蛋白之一，用于分析DSBs損傷修復(fù)的HR途徑[6-7]。

γH2AX foci分析是目前最常用的DSBs損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)，然而，近來有研究[8-14]發(fā)現(xiàn)γH2AX foci在某些情況下與DSBs損傷并不完全一致。因此，本實(shí)驗(yàn)通過電離輻射和喜樹堿作為不同類型的DNA損傷誘導(dǎo)方法，研究以上幾種修復(fù)蛋白在DSBs損傷時(shí)的動(dòng)力學(xué)變化，探討各指標(biāo)用于評(píng)估DSBs合理性。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購自GIBCO公司；抗53BP1抗體購自Thermo公司；抗γH2AX抗體購自Millipore公司；抗RAD51抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；FITC熒光標(biāo)記抗鼠和Cy3標(biāo)記的抗兔二抗均購自Sigma公司；DAPI染料購自Vector公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SMMC-7721肝癌細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM高糖培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清及1%抗生素)，置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃連續(xù)培養(yǎng)，每1～2 d換液，細(xì)胞生長至80%～90%匯合度時(shí)使用胰酶消化傳代。

1.2.2 X-ray誘導(dǎo)DNA損傷

將細(xì)胞接種到細(xì)胞爬片上，待其長至對(duì)數(shù)生長期且匯合度達(dá)70%～80% 時(shí)，X光輻照儀(RX-650)照射2 Gy 或10 Gy，繼續(xù)培養(yǎng)并分別在照射后1、4、12、24和36 h收樣進(jìn)行免疫熒光檢測，同時(shí)以設(shè)未照射組為對(duì)照(0 h)。

1.2.3 CPT誘導(dǎo)DNA損傷

將細(xì)胞接種到細(xì)胞爬片上，待其長至約40%～50% 匯合度時(shí)用CPT(2 μmol/L)持續(xù)處理，并分別在處理后3、24和36 h收樣進(jìn)行免疫熒光檢測，同時(shí)設(shè)未處理組為對(duì)照組(0 h)。

1.2.4 免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測

細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛室溫下固定10 min，0.3% Triton X-100(PBS配制)通透10 min；再經(jīng)2% BSA(PBS配制)室溫封閉30 min后，先后用特異性一抗和熒光素標(biāo)記二抗?jié)窈袃?nèi)37 ℃分別孵育30 min；最后經(jīng)DAPI染色并封片后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，每組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)至少分析100個(gè)細(xì)胞的foci數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，顯著性分析通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 電離輻射誘導(dǎo)的γH2AX和53BP1 foci分析

分別用2 Gy和10 Gy的X-ray照射7721細(xì)胞誘導(dǎo)DSBs損傷，并在照射后不同時(shí)間點(diǎn)收樣，通過免疫熒光染色分析γH2AX與53BP1 foci動(dòng)力學(xué)變化情況。結(jié)果顯示，未照射的細(xì)胞幾乎無γH2AX及53BP1 foci形成，經(jīng)2 Gy劑量照射后γH2AX及53BP1 foci數(shù)在1 h后達(dá)到峰值且?guī)缀?00% 細(xì)胞都為γH2AX及53BP1 foci陽性細(xì)胞，然后隨著時(shí)間的推移逐漸減少，24 h后已基本消失；此外，γH2AX及53BP1 foci基本上可以共定位在DNA損傷位點(diǎn)(圖1-A、B)。細(xì)胞經(jīng)大劑量(10 Gy)X-ray照射后，γH2AX與53BP1 foci數(shù)在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)明顯多于2 Gy照射組，其變化趨勢類似2 Gy照射組；需要注意的是，隨著時(shí)間的推移γH2AX及53BP1 foci 消退速度減慢，直到照射后36 h仍有較多foci(圖1-C、D)。這些結(jié)果提示：γH2AX與53BP1在細(xì)胞DSBs形成后可被募集到損傷部位參與損傷修復(fù)進(jìn)程，隨著損傷DNA逐漸被修復(fù)，γH2AX與53BP1逐漸恢復(fù)到基線水平；而大劑量X-ray照射引起更為嚴(yán)重的損傷，其修復(fù)進(jìn)程相應(yīng)減緩。

A 和 C：用抗γH2AX和53BP1抗體染色，分析經(jīng)X-ray 2 Gy(A)和10 Gy(C)輻照的7721細(xì)胞，并計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)foci數(shù)； B和D：統(tǒng)計(jì)分析A和C中γH2AX及53BP1 foci數(shù)量，誤差線代表n=3的標(biāo)準(zhǔn)差

圖1γH2AX和53BP1foci在IR處理后的動(dòng)力學(xué)變化

Figure 1 The dynamic changes of γH2AX and 53BP1 foci after IR treatment

2.2 電離輻射誘導(dǎo)的RAD51 foci動(dòng)力學(xué)變化

7721細(xì)胞經(jīng)2 Gy或10 Gy的電離輻射后，RAD51 foci數(shù)均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。2 Gy劑量組，RAD51 foci計(jì)數(shù)峰值為4 h，36 h后foci基本消退；而10 Gy劑量組foci高峰延遲至12 h，且36 h后仍有較多foci(圖2-A、B)。結(jié)果提示RAD51也參與了細(xì)胞DSBs損傷修復(fù)動(dòng)力學(xué)過程。

A：用抗RAD51抗體染色，分析經(jīng)X-ray 2 Gy或10 Gy照射的7721細(xì)胞，并計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)foci數(shù)； B：統(tǒng)計(jì)分析A中RAD51 foci數(shù)量，誤差線代表n=3的標(biāo)準(zhǔn)差

圖2RAD51foci在IR處理后的動(dòng)力學(xué)變化

Figure 2 The dynamic changes of RAD51 foci after IR treatment

此外，如圖3所示，電離輻射誘導(dǎo)的RAD51 foci也可與γH2AX foci共定位，但RAD51 foci陽性細(xì)胞僅約占所有細(xì)胞的20%～30%，而幾乎100%細(xì)胞產(chǎn)生γH2AX foci。這就說明，與γH2AX不同，RAD51僅參與部分DSBs損傷細(xì)胞的修復(fù)過程。

用X-ray 2 Gy照射的7721細(xì)胞4 h后，經(jīng)抗γH2AX和RAD51抗體染色并分析結(jié)果

圖3電離輻射誘導(dǎo)的γH2AX和RAD51foci模式

Figure 3 γH2AX and RAD51 foci modes induced by IR

2.3 CPT誘導(dǎo)的γH2AX和53BP1 foci 動(dòng)力學(xué)變化

為進(jìn)一步研究γH2AX和53BP1 foci用于評(píng)估DNA雙鏈斷裂損傷的準(zhǔn)確性，我們用CPT(短期處理主要誘導(dǎo)DNA單鏈損傷，長時(shí)間處理引起大量雙鏈斷裂)處理細(xì)胞不同的時(shí)間，然后進(jìn)行免疫熒光染色分析。如圖4-A和4-B所示：CPT未處理組(對(duì)照組)細(xì)胞幾乎無γH2AX和53BP1 foci形成；CPT處理3 h組細(xì)胞形成兩種模式的γH2AX foci, 模式1為亮而離散的類似于電離輻射誘導(dǎo)的foci類型，模式2為小而致密的泛核γH2AX染色(泛核磷酸化)，模式1約占γH2AX陽性細(xì)胞的(20.67±3.62)%；隨著處理時(shí)間的延長，呈現(xiàn)模式1型γH2AX染色的細(xì)胞比例逐漸增高，CPT處理12 h組約占γH2AX陽性細(xì)胞的(59.33±2.58)%，而CPT處理24 h組約占γH2AX陽性細(xì)胞的(79.00±2.12)%。此外，53BP1 foci僅出現(xiàn)在模式1類型的γH2AX陽性細(xì)胞，且與γH2AX foci共定位。

A：經(jīng)CPT處理7721細(xì)胞預(yù)示時(shí)間點(diǎn)后，免疫熒光分析γH2AX和53BP1 foci變化情況(箭頭代表模式1，即亮而離散的類似于電離輻射誘導(dǎo)的foci類型；三角代表模式2，即為小而致密的γH2AX泛核磷酸化染色)。B：統(tǒng)計(jì)分析A中γH2AX和53BP1 foci陽性細(xì)胞比例，誤差線代表n=3的標(biāo)準(zhǔn)差

圖4CPT誘導(dǎo)的γH2AX和53BP1foci的動(dòng)力學(xué)變化

Figure 4 The dynamic changes of γH2AX and 53BP1 foci induced by CPT

3 討論

DSBs損傷形成后，γH2AX可在損傷位點(diǎn)迅速形成，30～60 min達(dá)峰值，隨著DSBs修復(fù)的完成逐漸消退，其foci數(shù)與DSBs數(shù)量正相關(guān), 故γH2AX foci分析成為目前評(píng)估DSBs修復(fù)動(dòng)力學(xué)的最常用指標(biāo)[4-5]。53BP1在DSBs損傷后被招募到損傷位點(diǎn)參與NHEJ修復(fù)過程，也是廣泛應(yīng)用的DSBs損傷修復(fù)評(píng)價(jià)指標(biāo)[5]。Yan等[15]的研究顯示，DSBs損傷后，細(xì)胞γH2AX和53BP1 foci迅速達(dá)峰值(1 h)且呈現(xiàn)出動(dòng)力學(xué)變化過程。Tsvetkova等[16]的研究表明，IR誘導(dǎo)細(xì)胞DSBs損傷后，γH2AX和53BP1 foci數(shù)量相當(dāng)且可共定位；而Reindl等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，DSBs形成后γH2AX和53BP1 foci 數(shù)量和大小大致相同，但定位存在細(xì)微差異。本研究中，我們首先以X-ray為DSBs損傷誘導(dǎo)劑，研究了γH2AX和53BP1 foci的動(dòng)力性變化。結(jié)果表明(圖1)，細(xì)胞經(jīng)X-ray(2/10 Gy) 照射后誘導(dǎo)γH2AX和53BP1 foci形成，且二者具有高度一致性(數(shù)量相近，能共定位)，均在照射后1 h達(dá)峰值，隨時(shí)間延長foci數(shù)逐漸降低，反映了DSBs損傷的動(dòng)力性修復(fù)過程；需注意的是，高劑量(10 Gy)X-ray照射后在各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)γH2AX和53BP1 foci數(shù)明顯多于低劑量照射組。由此可見，我們的研究結(jié)果同國內(nèi)外報(bào)道基本符合，γH2AX和53BP1 foci分析均可較為準(zhǔn)確地反映電離輻射誘導(dǎo)的DSBs損傷修復(fù)過程，是理想的DSBs損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)。

RAD51則參與DSBs損傷的HR修復(fù)過程，僅在S/G2期細(xì)胞的損傷修復(fù)中發(fā)揮作用[6-7，18]。Anastasia Tsvetkovazu等[16]的研究表明，DSBs誘導(dǎo)時(shí)RAD51 foci僅出現(xiàn)在增殖細(xì)胞(Ki67陽性)中。Judith Reindl等[17]的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，RAD51 foci僅出現(xiàn)部分53BP1 foci陽性細(xì)胞可共定位但尺寸小于后者，可能是損傷部位的53BP1 foci被驅(qū)出后RAD51進(jìn)入而介導(dǎo)同源重組。我們的RAD51 foci染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2-A、B，圖3)：1)RAD51 foci也在損傷誘導(dǎo)后呈現(xiàn)動(dòng)力性變化，照射后4 h達(dá)峰值，以后逐漸消退；2)與γH2AX foci(幾乎100%細(xì)胞陽性)不同，僅有20%～30%的細(xì)胞產(chǎn)生明顯的RAD51 foci。這與RAD51僅參與S/G2期細(xì)胞的HR修復(fù)的研究結(jié)果一致。

最近有研究表明，γH2AX誘導(dǎo)可不依賴于DSBs損傷，單鏈損傷、復(fù)制阻滯及凋亡等均可誘導(dǎo)γH2AX形成[8-14]。

為進(jìn)一步探討γH2AX和53BP1 foci與DSBs損傷的一致性，我們采用DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑CPT作為DNA損傷誘導(dǎo)劑，其可誘導(dǎo)的損傷類型較為復(fù)雜，包括單鏈損傷和雙鏈斷裂損傷等[4]。我們的結(jié)果(圖4-A、B)顯示，CPT處理后細(xì)胞形成兩種模式的γH2AX染色,亮而離散的foci和泛核磷酸化；53BP1 foci僅出現(xiàn)在亮而離散的γH2AX foci陽性細(xì)胞中，且與γH2AX foci共定位；這就提示γH2AX泛核磷酸化很可能與DSBs損傷不相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間(3 h)處理后，γH2AX染色以泛核磷酸化為主，隨著處理時(shí)間的延長，γH2AX染色逐漸轉(zhuǎn)向以亮而離散的foci為主；我們推測CPT短時(shí)間作用主要引起DNA的單鏈損傷而形成泛核磷酸化形式的γH2AX，隨著作用時(shí)間延長，單鏈損傷逐步積累而形成雙鏈單鏈，γH2AX染色也相應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榱炼x散的foci類型。

本研究系統(tǒng)探討了DNA損傷時(shí)γH2AX、53BP1及RAD51 foci的動(dòng)力性變化及其在DSBs損傷評(píng)估中的合理應(yīng)用。我們的結(jié)果表明，γH2AX和53BP1 foci分析均可較準(zhǔn)確的用于電離輻射誘導(dǎo)的DSBs損傷修復(fù)評(píng)價(jià)，而RAD51 foci分析僅適用于DSBs損傷的同源重組修復(fù)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在CPT處理時(shí)可形成不依賴DSBs損傷的γH2AX染色。因此，應(yīng)用γH2AX染色評(píng)估DSBs損傷需保持謹(jǐn)慎，必須充分考慮損傷誘導(dǎo)因素并結(jié)合53BP1 foci分析等綜合評(píng)價(jià)。