倪鵬輝，劉春峰，謝 玲，王曉麗，郭麗娜*，王偉明*

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學院 中藥研究所，黑龍江 哈爾濱150036；2.齊齊哈爾市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江 齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾市康盛中藥材飲片加工廠，黑龍江 齊齊哈爾161006；4.齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾161006）

白鮮皮為蕓香科植物白鮮（Dictamnus dasycarpus Turcz）的干燥根皮，有羊膻氣。味苦，性寒，歸脾、胃、膀胱經(jīng)。具有清熱燥濕，祛風解毒之功效，用于濕熱瘡毒，黃水淋漓，濕疹，風疹，疥癬瘡癩，風濕熱痹，黃疸赤尿等癥。國內(nèi)外學者對其化學成分和藥理活性進行了研究。發(fā)現(xiàn)白鮮皮含有揮發(fā)油、生物堿類、檸檬苦素類和多糖等多種化合物，具有抗腫瘤、止血、抗氧化、抗炎及殺蟲等藥理活性。經(jīng)文獻檢索未見采用超臨界流體萃取技術（SFE）提取白鮮皮抗氧化活性成分的報道，因此，設計并進行了以下實驗研究。

響應面法（RSM）是利用合理的實驗設計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。用響應面法優(yōu)化工藝過程主要涉及3步：實驗設計、建立數(shù)學模型評估相關性、預測響應值考察模型的準確性。

1 實驗部分

1.1 實驗設備

Spe-ed SFE-2型超臨界流體萃取儀（美國ASI公司）；紫外可見光分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）；AE-240型電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；FZ102型微型植物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；18目型標準檢驗篩（浙江上虞市華豐五金儀器有限公司）。

1.2 實驗原料與試劑

白鮮皮藥材購自康盛中藥材飲片加工廠（經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院郭麗娜教授鑒定為白鮮科植物白鮮的根皮）；1.1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH；東京化成工業(yè)株式會社）；L（+）-抗血酸（VC天津市科密歐化學試劑有限公司）；乙酸乙酯、甲醇（AR天津市富宇精細化工有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 超臨界流體萃取 將白鮮皮藥材粉碎，過18目篩，稱取約15g，裝入萃取釜，將萃取釜連接到超臨界流體萃取裝置，設置萃取壓力、萃取溫度、萃取時間等實驗條件，進行提取。萃取結束，收集白鮮皮SFE萃取物，計算得率。計算公式：提取率%=萃取物量/白鮮皮藥材量×100%。

1.3.2 響應面法優(yōu)化萃取條件 首先，針對影響超臨界流體萃取較大的影響因素做單因素考察，并確定響應面實驗的水平區(qū)間。利用Design-Expert.V8.0.6軟件根據(jù)中心組合設計（Central Composite Design,CCD）原理，針對實驗影響因素，以提取率為響應值進行響應面實驗設計。按照設計結果進行實驗得到各組實驗條件對應的提取率。利用Design-Expert.V8.0.6軟件分析實驗結果，優(yōu)化實驗條件。

1.3.3 DPPH法測定萃取物清除自由基能力 取約100mg超臨界流體提取的白鮮皮萃取物樣品，溶于2mL乙酸乙酯，分別在2mL的DPPH甲醇溶液中加入 0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05mL 的樣品溶液，補加乙酸乙酯至3mL。形成8個溶度梯度，分別為 6.73、5.89、5.05、4.21、3.37、2.53、1.68、0.84mg·mL-1?？瞻讓φ战M加入1mL乙酸乙酯。樣品與DPPH反應30min，用紫外分光光度計測517nm處的吸光度值。以抗壞血酸為陽性對照，按同樣方法測DPPH自由基清除率。樣品組吸光度值為Ax、空白對照組吸光度值為A0。自由基清除率計算公式：清除率%=（A0-Ax）/A0×100%。利用SPSS Statistics軟件進行抗氧化活性IC50值計算。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行響應面實驗設計，數(shù)據(jù)分析。利用SPSS Statistics軟件進行抗氧化活性IC50值計算。

2 結果與討論

2.1 單因素影響試驗

2.1.1 萃取壓力 萃取溫度固定在50℃，萃取時間固定在30min，考察不同萃取壓力提取率的影響，結果見圖1。

從圖1可以看出，隨著提取壓力的增加，3.00×107Pa壓力前提取率迅速上升，后增加壓力提取率呈緩慢下降趨勢。為減少能耗，選擇萃取壓力范圍為2.00×107～4.00×107Pa。2.1.2 萃取溫度 萃取壓力固定在3.00×107Pa，萃取時間固定在30min，考察萃取溫度對白鮮皮提取率的影響，結果見圖2。

圖2 萃取溫度對白鮮皮萃取物提取率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on the extraction rate of Cortex Dictamni

從圖2可以看出，隨著提取溫度的上升，60℃前提取率迅速上升，后溫度增加提取率不再增加。固選擇萃取溫度范圍為50～70℃。

2.1.3 萃取時間 萃取壓力固定在3.00×107Pa，萃取溫度固定在60℃，考察萃取時間對白鮮皮提取率的影響，結果見圖3。

圖3 萃取時間對白鮮皮萃取物提取率的影響Fig.3 Influence of extraction time on the extraction rate of Cortex Dictamni

從圖3可以看出，隨著提取時間的增加，30min前提取率上升，后睡著時間加長提取率略有降低。固選擇萃取時間范圍為20～40min。

2.2 采用RSM優(yōu)化白鮮皮SFE工藝

2.2.1 響應面分析因素水平設計與方案設計及結果 根據(jù)CCD原理，在上述單因素影響實驗結果的基礎上，采用三因素三水平的響應面分析方法，試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面設計的因素與水平Tab.1 Factors and levels in the response surface design

利用Design-Expert.V8.0.6軟件設計響應面實驗方案，共20個點，其中14個為析因點，6個為零點，以白鮮皮萃取物性成分的提取率為響應值（y），設計方案與實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計與結果Tab.2 Response surface designexperiments and results

2.2.2 實驗數(shù)據(jù)分析 利用軟件Design-Expert.V8.0.6進行多元回歸擬合、方差分析和顯著性檢驗，得到以白鮮皮提取率為目標的函數(shù)，關于各影響因素的二次回歸方程為：y=1.39+0.18×A+0.14B+0.048C-0.0062AB+0.036AC-0.049BC-0.13A2-0.083B2+0.053C2。式中，萃取壓力、萃取溫度、萃取時間分別對應A、B、C。方程中各項系數(shù)的絕對值大小直接反應了各項萃取因素對響應值的影響程度大小，系數(shù)的正負反映了影響的方向。由回歸方程可知，萃取壓力和萃取溫度的線性項及萃取壓力的二次項對提取率的影響較為顯著。

對響應值進行方差分析，結果見表3。

表3 響應值方差分析表Tab.3 Variance analysis of response value

由表3可知，模型p值為0.0003，遠小于0.01，說明該模型極其顯著；其中R2=91.67%，表明91.67%的實驗數(shù)據(jù)可用該模型解釋，說明方程的可靠性。模型RSD值顯示實驗操作的穩(wěn)定性，RSD值越低，顯示實驗穩(wěn)定性越好，本實驗RSD=8.12%，較低，說明實驗操作穩(wěn)定性較好。該模型擬合度好，實驗誤差較小，可以此模型分析預測CO2超臨界流體萃取白鮮皮的工藝結果。由方程各項系數(shù)及表中對各項系數(shù)的顯著性分析顯示，A、B極顯著，C不顯著；交互項不顯著；二次項A2、B2極顯著，C2不顯著。表明萃取壓力和萃取溫度對超臨界流體萃取白鮮皮具有很大影響，萃取時間影響較小。影響程度依次為萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時間。

2.2.3 白鮮皮SFE工藝響應面分析

圖4～6通過響應面的走勢及坡度，體現(xiàn)出各實驗參數(shù)對響應值的影響程度。在這組圖中，萃取壓力和萃取溫度側曲線變化陡峭，萃取時間側相對平緩，說明壓力和溫度較時間因素對響應值影響明顯。

圖4 萃取壓力和溫度對提取率的影響Fig.4 Extraction pressure and temperature on the extraction yield

圖5 萃取壓力和時間對提取率的影響Fig.5 Extraction pressure and time on the extraction yield

圖6 萃取溫度和時間對提取率的影響Fig.6 Extraction temperature and time on the extraction yield

圖4中響應面走勢陡峭，等高線密集，表明萃取壓力和萃取溫度相互作用較顯著。圖5較圖4響應面走勢較平緩，等高線較稀疏，表明萃取壓力和萃取時間相互作用較弱。圖6響應面走勢平緩、等高線稀疏，表明萃取溫度和萃取時間相互作用不明顯。

通過軟件分析得到最佳萃取條件為壓力3.71×107Pa，溫度 67.2222℃，時間 31.8148min，最大提取率為1.51%，根據(jù)實際操作修正后得到的最佳條件為 3.71×107Pa，67℃，32min。白鮮皮萃取物提取率理論值可達到1.51%。為驗證響應面優(yōu)化所得結果，按上述萃取條件平行試驗3次，平均提取率為1.50%，與預測值相比誤差較小。

2.3 DPPH法[5]測定白鮮皮萃取物清除自由基活性

表4 不同濃度白鮮皮萃取物及VC與對應DPPH清除率Tab.4 Extraction,VC with different concentrations and Scavenging rate on DPPH

圖7 不同濃度白鮮皮萃取物對DPPH的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of extraction with different concentrations on DPPH

圖8 不同濃度VC對DPPH的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of VC with different concentrations on DPPH

由表4和圖7、8可知，白鮮皮萃取物具有一定的清除DPPH自由基能力，且隨濃度的增加而增強。利用SPSS Statistics軟件計算得白鮮皮萃取物樣品DPPH 清除率的 IC50=3.79mg·mL-1，VC的 DPPH 清除率的 IC50=0.04mg·mL-1。

3 結論

（1）采用響應面試驗設計方法得到白鮮皮萃取物CO2超臨界流體提取工藝參數(shù)的二次回歸方程：y=1.39+0.18×A+0.14B+0.048C-0.0062AB+0.036AC-0.049BC-0.13A2-0.083B2+0.053C2。該方程能較好的預測超臨界流體萃取白鮮皮的提取率隨各參數(shù)變化的規(guī)律。

（2）利用軟件進行數(shù)據(jù)分析并根據(jù)實際操作修正后得到最優(yōu)實驗條件為：萃取壓力3.71×107Pa，萃取溫度67℃，萃取時間32min。以此條件進行3次平行試驗，得到白鮮皮平均提取率為1.50%。

（3）本研究還測試了用超臨界流體萃取的白鮮皮萃取物清除自由基的能力。白鮮皮萃取物對DPPH自由基有一定的的清除能力且有濃度依賴性，IC50=3.79mg·mL-1。與陽性對照品 VC 的 IC50=0.04mg·mL-1相比差很多。