梁田田，李日恒，張愛民，鄭三龍，丁麗坤，彭鑫宇，問明，郗欣，郭劍，王偉森，李杰

（1.河北大學(xué)，河北 保定，071002；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000；3.保定淶源縣醫(yī)院，河北 淶源 074300）

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)常見的一種癌癥。2012年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中排第3位，女性中排第2位，死亡率高達(dá)49%[1]。

孕酮及脂聯(lián)素受體3（progestin and adipoQ receptor 3,PAQR3）參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝及細(xì)胞分裂分化等多種生物學(xué)過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PAQR3在食管癌、喉鱗狀細(xì)胞癌及腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[2-4]。普魯卡因作為局部麻醉藥物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中PAQR3基因表達(dá)的研究報(bào)道 較少。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、SW480、COLO205，胎牛血清（美國(guó)Gemini公司），L-15、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），普魯卡因（日本TCT公司），RT-PCR 試劑盒（日本TaKaRa公司）、EpiTect MSP 試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），兔抗人PAQR3 抗體、辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體等均購自石家莊華沃科瑞生物公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2 儀器與設(shè)備 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)EPOCH 基因有限公司），ChampGel 5000 全自動(dòng)凝膠成像儀（中國(guó)容智創(chuàng)業(yè)），7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Veriti 普通PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620培養(yǎng)于L-15 完全培養(yǎng)基，置于低二氧化碳CO2培養(yǎng)箱。人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、COLO205培養(yǎng)于RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱。將SW480細(xì)胞以5.0×105個(gè)/100 mm2的濃度接種于培養(yǎng)皿中，隨機(jī)標(biāo)記為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組：對(duì)照組用RPMI 1640 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別用0.5、1.0、2.0、5.0及10.0 mmol/L 不同濃度的普魯卡因處理細(xì)胞。普魯卡因溶于RPMI 1640 完全培養(yǎng)基中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）使用日本TaKaRa 株式會(huì)社SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒，7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。引物序列查閱文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)PAQR3 引物，正向引物：5′-TCTGTATGCTTTGCTCTGTGGG-3′；反向引物：5′-TTTGCCATTGCTGCGTGAG-3′，長(zhǎng)度252 bp。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，正向引物：5′-GTGGACAT CCGCAAAGAC-3′；反向引物：5′-AAAGGGTGTA ACGCAACTAA-3′，長(zhǎng)度302 bp。記錄△Ct 值進(jìn)行分析。

1.2.3 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylationspecific PCR,MSP）依據(jù)EpiTect MSP試劑盒說明書，以PAQR3 特異性甲基化及非甲基化 引物進(jìn)行擴(kuò)增。甲基化正向引物：5′-TTGTTGAAGA GCGCGTATTATATC-3′；反向引物：5′-TAAAAA CCCGAAAATCTACTCGTA-3′，長(zhǎng)度109 bp。非甲 基化正向引物：5 ′ -TTGTTGAAGAGTGTGTATT ATATTGA-3′；反向引物：5′-TAAAAAACCCAAAA ATCTACTCATA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度109 bp。擴(kuò)增完成后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)凝膠成像 儀分析結(jié)果。甲基化百分比=甲基化條帶光密度值/（甲基化條帶光密度值+非甲基化條帶光密度值）×100%。

1.2.4 Western blotting 收集對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，按RIPA 法提取細(xì)胞總蛋白；Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，定量上樣后電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h。加入一抗，4℃過夜，TTBS 漂洗，二抗37℃孵育1 h，TTBS 漂洗，ECL 發(fā)光，C-DIGIT 印跡掃描器掃描，Image Studio Didits 系統(tǒng)分析。

1.2.5 藥物處理及MSP 將結(jié)腸癌細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，2 mmol/L 普魯卡因處理細(xì)胞24 h后，進(jìn)行MSP 反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q法；計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAQR3 mRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果顯示，PAQR3在結(jié)腸癌細(xì)胞株中呈低表達(dá)。3種結(jié)腸癌細(xì)胞株中（SW480、COLO205及SW620）PAQR3 mRNA分 別 為（7.68±0.20）、（8.62±0.37）和（14.14±0.56），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=458.391，P=0.000），SW620表達(dá)量高于COLO205和SW480（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同結(jié)腸癌細(xì)胞中PAQR3 mRNA的表達(dá)（±s）

2.2 PAQR3基因啟動(dòng)子在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的甲基化程度

MSP 檢測(cè)結(jié)果顯示，SW480、COLO205及SW620細(xì)胞株可見甲基化特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶（見圖2）。SW480、COLO205及SW620細(xì)胞株甲基化條帶光密度值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SW480、COLO205及SW620 細(xì) 胞 株 中PAQR3基因甲基化百分比比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SW480和COLO205細(xì)胞中PAQR3甲基化百分比較SW620細(xì)胞低（P＜0.05）。見表1。

圖2 PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

表1 3種結(jié)腸癌細(xì)胞株中PAQR3基因甲基化比較

2.3 普魯卡因處理后3種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中PAQR3甲基化程度

MSP 顯示，SW480、COLO205及SW620細(xì)胞株可見甲基化特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶和非甲基化特異性擴(kuò)增條帶（見圖3）。普魯卡因處理后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組3種細(xì)胞株中PAQR3甲基化百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組PAQR3甲基化百分比降低（P＜0.05）。見表2。

圖3 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

表2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組3種細(xì)胞中PAQR3甲基化 比較 %

2.4 不同濃度普魯卡因處理SW480細(xì)胞后PAQR3 蛋白的表達(dá)

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，各組PAQR3 蛋白表達(dá)情況（見圖4）。對(duì)照組、0.5 mmol/L 實(shí)驗(yàn)組、1 mmol/L 實(shí)驗(yàn)組、2 mmol/L 實(shí)驗(yàn)組、5 mmol/L實(shí)驗(yàn)組及10 mmol/L 實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸癌細(xì)胞中PAQR3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中PAQR3 蛋白相對(duì)表達(dá)量增加（P＜0.05）。見表3。

圖4 普魯卡因?qū)AQR3 蛋白表達(dá)的影響（±s）

表3 各組細(xì)胞中PAQR3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n =3，±s）

表3 各組細(xì)胞中PAQR3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n =3，±s）

組別 PAQR3 蛋白對(duì)照組 0.217±0.032 0.5 mmol/L 實(shí)驗(yàn)組 0.350±0.060 1.0 mmol/L 實(shí)驗(yàn)組 0.533±0.061 2.0 mmol/L 實(shí)驗(yàn)組 1.240±0.120 5.0 mmol/L 實(shí)驗(yàn)組 0.753±0.130 10.0 mmol/L 實(shí)驗(yàn)組 0.620±0.085 F 值 49.424 P 值 0.000

3 討論

近年來，基因甲基化的研究成為熱點(diǎn)。SHALABY等[6]發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者血液和組織中MGMT和ERCC1甲基化頻率高于良性腫瘤者，且MGMT和ERCC1基因甲基化與其mRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)。KATZENMAIER等[7]分析9種大腸癌細(xì)胞系中調(diào)控半乳糖凝集素表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在未分化的大腸癌細(xì)胞系中半乳糖凝集素-12的表達(dá)缺失和其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化有關(guān)。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過檢測(cè)結(jié)腸癌組織中SFRP2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，也證實(shí)啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)甲基化水平與結(jié)直腸癌的臨床及病理特點(diǎn)有相關(guān)性[8]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究都證實(shí)，基因甲基化在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起重要作用。

PAQR3在多種腫瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)降低，而過表達(dá)則可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲表型，提示PAQR3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用[2-4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，PAQR3在前列腺癌、乳腺癌等腫瘤組織出現(xiàn)基因甲基化，而這可能與PAQR3表達(dá)沉默相 關(guān)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)組前期檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中PAQR3的表達(dá)水平及甲基化狀態(tài)[5]，與上述研究結(jié)論一致[9-10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PAQR3在3種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中呈低表達(dá)狀態(tài)；在3種結(jié)直腸癌細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)PAQR3 呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)。隨后筆者又用普魯卡因進(jìn)行逆甲基化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在其濃度為2 mmol/L 時(shí)，可上調(diào)PAQR3 蛋白相對(duì)表達(dá)量。最后以最佳濃度普魯卡因處理3種結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，PAQR3在3種細(xì)胞株中甲基化率降低。通過實(shí)驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)，PAQR3甲基化是其在結(jié)直腸癌中表達(dá)沉默的重要因素，而普魯卡因可以逆轉(zhuǎn)甲基化，上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞株中PAQR3蛋白相對(duì)表達(dá)。

綜上所述，PAQR3甲基化在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。而普魯卡因可以逆轉(zhuǎn)PAQR3甲基化，上調(diào)PAQR3 蛋白的表達(dá)。