張娟，方祥位，劉漢龍，肖楊，張楠，曹小方

(1.重慶大學(xué) a.產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院；b.土木工程學(xué)院；c.山地城鎮(zhèn)建設(shè)與新技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400045；2.重慶工商大學(xué) 通識學(xué)院，重慶 400020)

石油是一種重要的能源，對經(jīng)濟(jì)和人民的生活水平都有很大的推動作用，但在石油的開采、加工以及運(yùn)輸過程中會發(fā)生石油泄漏等問題，資料表明，中國目前直接進(jìn)入到環(huán)境中的石油約有6×105t，對土壤以及地下水造成嚴(yán)重污染。而汽油是用量最大的輕質(zhì)石油產(chǎn)品之一，汽油物質(zhì)進(jìn)入土壤后，主要從兩個方面對土壤的理化性質(zhì)造成影響：一是會影響土壤的通透性，使得土壤的結(jié)構(gòu)遭到破壞[1]；二是汽油中的反應(yīng)基能夠與土壤中的無機(jī)氮和磷結(jié)合并限制土壤的硝化作用和脫磷酸作用，導(dǎo)致土壤中有機(jī)質(zhì)的碳氮比和碳磷比增大[2-4]。此外，汽油中的某些烴類具有致病變、致癌甚至致畸形的作用，通過污染土進(jìn)入人體后，大量積累會嚴(yán)重危害到人體的健康[5]。因此，汽油污染土的治理和修復(fù)一直受到高度重視。

傳統(tǒng)的污染土治理方法有物理法和化學(xué)法，物理修復(fù)法主要有挖掘填埋法、電解法、洗滌法和氣體吹脫法等，但物理法所用的設(shè)備價格昂貴且可能破壞土壤的結(jié)構(gòu)和組分?；瘜W(xué)法主包括氧化劑氧化法、萃取法、熱分解法和光化學(xué)氧化法等，主要技術(shù)是利用化學(xué)浸出進(jìn)行除油，但此方法有可能對土體造成二次污染[6]。

生物修復(fù)法是一種綠色節(jié)能的方法，主要利用微生物及其他生物，將土壤中的有毒烴類污染物降解為二氧化碳和水等無毒無害物質(zhì)，從而達(dá)到修復(fù)土壤的目的[7]。研究發(fā)現(xiàn)，有大量微生物能夠以石油中的烴類作為唯一碳源進(jìn)行繁殖生長，微生物繁殖較快且比表面積大，因此，微生物修復(fù)污染土成為研究熱點(diǎn)[8]。目前，關(guān)于原油生物降解的研究主要集中在降解菌的篩選與鑒定[9-10]和生物降解機(jī)理[11-12]。閆志宇等[13]分離篩選出的菌株BacillussubtilusL3能高效降解乙草胺。Guo等[14]從柴油污染的土壤中分離出兩種耐寒的石油烴降解菌株CHD1和CHD2。而汽油作為用量最大的石油提取物，對土壤造成的污染也最多。

已有研究表明，多種微生物都能對汽油烴類物質(zhì)進(jìn)行降解，但降解能力存在較大差異，因此，篩選降解汽油烴能力較強(qiáng)的菌種將會大大提高污染土的修復(fù)效率[15]。筆者通過從石油污染土中的微生物進(jìn)行分離鑒定以及通過正交試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對其降解汽油性能進(jìn)行測定和優(yōu)化，從而為汽油污染土的生物修復(fù)法提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

石油污染土來源于甘肅省成縣油氣管道轉(zhuǎn)換站，圖1所示為采集的土樣。主要取自表層以下2～15 cm處的污染土。

圖1 汽油污染土

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸出粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，配制200 mL，pH值調(diào)節(jié)為7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的分離與鑒定 稱取石油污染土1.0 g放入到裝有9.0 mL的無菌生理鹽水的試管內(nèi)，在漩渦混合器中充分混勻，此時，溶液的稀釋度為10-1。利用梯度稀釋法對其繼續(xù)進(jìn)行稀釋，稀釋的梯度分別為10-2、10-3、10-4和10-5。用移液器從10-3、10-4和10-5這3個梯度中吸取20 μL的稀釋液，然后，在超凈工作臺內(nèi)將其接種到滅菌過的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，涂布均勻后，將培養(yǎng)基放入32 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)24 h[16-17]。培養(yǎng)完成后，觀察并記錄菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)的單菌落接種到固體培養(yǎng)基中，重復(fù)多次。對菌種進(jìn)行純化后，分別進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，然后，將純化后的菌株接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，保存于4 ℃的冰箱內(nèi)。對每個菌種的DNA進(jìn)行提取[4,18-19]，利用細(xì)菌的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 bp條帶后，通過Sanger法進(jìn)行測序(擎科興業(yè)生物有限公司完成)，將得到的序列利用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，從而確定菌株的類別。

1.3.2 優(yōu)良降解菌株的篩選 將純化后的菌種在超凈工作臺內(nèi)接種到200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，然后置于32 ℃、180 r/min的搖床內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，測定菌液在600 nm處的吸光度。吸取2 mL菌液，接種到200 mL的降油培養(yǎng)基內(nèi)，同樣在32 ℃、180 r/min的搖床內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)2、4、6 d后，分別對培養(yǎng)基內(nèi)的汽油含量進(jìn)行測定，并計(jì)算最終的汽油降解率。每個菌種做3組平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，從而對具有高效汽油降解能力的菌種進(jìn)行篩選。

1.3.3 汽油降解率的測定方法 將降解后的培養(yǎng)液放入離心機(jī)內(nèi)離心(轉(zhuǎn)速為100 r/min)，20 min后提取上清液到新的滅菌過的錐形瓶內(nèi)，每1 L上清液加入5 mL硫酸進(jìn)行酸化，然后加入40 mL的石油醚，將培養(yǎng)基內(nèi)殘余的汽油提取后對其質(zhì)量進(jìn)行測定，汽油降解率的計(jì)算式為[20]

汽油降解率=(m0-m1)/m0×100%

式中：m0為初始汽油的質(zhì)量；m1為培養(yǎng)基中殘余的汽油質(zhì)量。

1.3.4 菌種降解性能的測定

1)單因素試驗(yàn) 以LB培養(yǎng)基作為基質(zhì)，按照表1的3組實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng)20 h后，吸取20 μL菌液加入到降油培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)6 d后，對培養(yǎng)基中殘余汽油含量進(jìn)行測定，計(jì)算并記錄汽油降解率。

2)在單因素試驗(yàn)的結(jié)果之上，對具有高效汽油降解能力的菌種進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，然后按照實(shí)驗(yàn)方案所列的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)[3,21]。利用Design-expert軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析以及最優(yōu)求解從而確定菌種降解汽油的最佳培養(yǎng)條件。

表1 單因素試驗(yàn)方案

2 結(jié)果與分析

2.1 汽油降解菌的分離與鑒定

從汽油污染土中共分離出9株菌株，除了菌1和菌5形態(tài)特征較為明顯之外，其余在平板上的特征較為相似。將這9種菌株進(jìn)行編號為菌1～菌9，并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，這9種菌上的特點(diǎn)見圖2。

圖2 菌落在平板上的形態(tài)特征

對每種菌進(jìn)行分離純化后進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2所示。

對刀操作是數(shù)控車床加工調(diào)試的關(guān)鍵所在,是保證車床正常運(yùn)行的重要步驟。在實(shí)際操作中，深入了解對刀的原理和方法，能減少因機(jī)械原因造成的零件報(bào)廢，提高生產(chǎn)效率和零件的車削質(zhì)量。

利用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast對測序結(jié)果和己知序列進(jìn)行比對，分析其相似度，具體的鑒定結(jié)果為：菌1為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，菌2為假單胞菌屬(Pseudomonas)，菌3為蒼白桿菌屬(Pleurobacter)，菌4為博得特氏菌屬(Bordetella)，菌5為戈登氏菌屬(Gordonia)，菌6為同溫層芽孢桿菌(Bacillus)，菌7為洛菲不動桿菌(Acinetobacter)，菌8為瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii)，菌9為暹羅芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，且相似率均大于99.9%。

表2 菌株的生理生化反應(yīng)特點(diǎn)Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strains

注：“+”表示陽性；“—”表示陰性。

2.2 優(yōu)良降解菌的篩選

對9株菌在降油培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)6 d后的汽油降解率進(jìn)行測定,結(jié)果見表3。

根據(jù)表3可知，菌1、2、3、4、5的汽油降解率均超過60%，證明菌1、2、3、4、5降解汽油的能力較好，即銅綠假單胞菌、假單胞菌菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬以及戈登氏菌屬對汽油有著較好的降解能力，且這5種菌無致病性，對環(huán)境無污染性。

表3 9株菌株的汽油降解率

2.3 菌株降解性能的測定

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 培養(yǎng)溫度對5種菌的汽油降解率的影響如圖3所示。由圖3可知，培養(yǎng)溫度對5種菌的汽油降解率的影響趨勢大致相同，當(dāng)溫度小于35 ℃時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，汽油降解率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)溫度大于35 ℃，汽油降解開始下降，對于這5種菌來說，35 ℃是較為合適的培養(yǎng)溫度。

圖3 培養(yǎng)溫度對5種菌汽油降解率的影響

培養(yǎng)基的pH值對5種菌的汽油降解率的影響如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基pH值對5種菌的汽油降解率的影響趨勢大致相同，除了菌4在培養(yǎng)基pH為7.5時汽油降解率達(dá)到最大值，其余4種菌均在培養(yǎng)基pH為7時，汽油降解率達(dá)到最大值。

圖4 培養(yǎng)基pH值對汽油降解率的影響

培養(yǎng)時間對5種菌汽油降解率的影響如圖5所示。由圖5可知，菌1在培養(yǎng)24 h時汽油降解率達(dá)到最大值，超過24 h后開始下降，菌1在20、24 h的汽油降解率較為穩(wěn)定，但超過24 h后開始下降，其余3種菌的汽油降解率均在培養(yǎng)20 h時達(dá)到最大值。

圖5 培養(yǎng)時間對5種菌汽油降解率的影響

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果確定的正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平如表4所示。

表4 實(shí)驗(yàn)因素和水平

根據(jù)設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，對每組的殘余汽油量進(jìn)行測定后對汽油降解率進(jìn)行計(jì)算，得到的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入軟件進(jìn)行分析，菌1～菌5的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表6～表10所示。

表5 5種菌降解率研究的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 菌1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

注：“*”表示顯著;“**”表示極顯著;“nc”表示不顯著。

表7 菌2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

注：“*”表示顯著;“**”表示極顯著;“nc”表示不顯著。

表8 菌3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

注：“*”表示顯著;“**”表示極顯著;“nc”表示不顯著。

表9 菌4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

注：“*”表示顯著;“**”表示極顯著;“nc”表示不顯著。

表10 菌5正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

注：“*”表示顯著;“**”表示極顯著;“nc”表示不顯著。

由表6～表10可知，這5個模型的F值分別為91.75、2 042.52、14 452.75、1 091.50以及79 620.51，且P值都小于0.000 1，說明這5個模型的回歸方程極顯著，且這5個模型的失擬項(xiàng)都不顯著，說明這5個模型都具有較好的模擬性，因此，這5個模型可以對石油降解率進(jìn)行分析和預(yù)測。

F值的大小反映出因素對實(shí)驗(yàn)因變量的影響程度，F(xiàn)值越大,表示因素對實(shí)驗(yàn)因變量的影響越顯著。由表6可知，對菌1的汽油降解率影響大小的因素依次是：因素A>因素C>因素B(培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)基pH值)；由表7可知，對菌2的汽油降解率的影響大小的因素依次為：因素B>因素C>因素A(培養(yǎng)基pH值>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度)；由表8可知，對菌3的汽油降解率影響大小的因素依次為：因素C>因素A>因素B(培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基pH值)；由表9可知，對菌4的汽油降解率影響大小的因素依次為：因素B>因素A>因素C(培養(yǎng)基pH值>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間)；由表10可知，對菌5的汽油降解率影響大小的因素依次為：因素C>因素A>因素B(培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基pH值)。

利用Design-Expert 8.0.6軟件聯(lián)合求解這5個模型，得到結(jié)果為：菌1的最佳培養(yǎng)溫度為32.14 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.00，最佳培養(yǎng)時間為20.12 h，在此條件下算出的石油降解率為70.167 4%；菌2的最佳培養(yǎng)溫度為32.00 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.01，最佳的培養(yǎng)時間為20.07 h，在此條件下算出的汽油降解率為76.416 8%；菌3的最佳培養(yǎng)溫度為32.03 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.00，最佳培養(yǎng)時間為20.05 h,在此條件下算出的汽油降解率為75.676 6%；菌4的最佳培養(yǎng)溫度為31.84 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為6.97，最佳培養(yǎng)時間為19.84 h，在此條件下算出的汽油降解率為77.524 6%；菌5的最佳培養(yǎng)溫度為32.02 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.00，最佳的培養(yǎng)時間為20.06 h，在此條件下算出的汽油降解率為73.250 6%。

由于這些最佳條件的參數(shù)在實(shí)際操作水平中很難實(shí)現(xiàn)，考慮到因素對于結(jié)果的影響大小，做以下調(diào)整：將菌1的培養(yǎng)溫度調(diào)整為32.1 ℃，培養(yǎng)時間調(diào)整為20 h，在此條件下再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為70.17%；將菌2的培養(yǎng)基pH值調(diào)整為7，培養(yǎng)時間為20 h，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為76.42%；將菌3的培養(yǎng)溫度調(diào)整為32.0 ℃，培養(yǎng)時間為20 h，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為75.66%；將菌4的培養(yǎng)溫度調(diào)整為31.8 ℃，培養(yǎng)基pH值調(diào)整為7.0，培養(yǎng)時間為20 h，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為77.50%；將菌5的培養(yǎng)溫度調(diào)整為32 ℃，培養(yǎng)時間為20 h，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的汽油降解率為73.22%。

3 結(jié)論

1)從石油污染土中分離出的9種菌分別為：銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬、戈登氏菌屬、同溫層芽孢桿菌、洛菲不動桿菌、瓊氏不動桿菌以及暹羅芽孢桿菌，均對汽油具有一定的降解能力。

2)篩選出的高效汽油降解能力的5種菌為銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬以及戈登氏菌屬，5種菌的汽油降解率均超過60%。

3)5種具有較高汽油降解能力的菌降解汽油的最佳培養(yǎng)條件分別為：假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、戈登氏菌屬、銅綠假單胞菌以及博得特氏菌屬的最佳培養(yǎng)溫度均為32 ℃；培養(yǎng)基pH值均為7.0；培養(yǎng)時間均為20 h。銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌以及戈登氏菌的汽油降解率分別為70.12%、76.42%、75.66%、77.50%和73.22%，且這5種菌對人體沒有致病性，也不會對環(huán)境造成污染，可為污染土的生物修復(fù)提供優(yōu)良菌種。