陳洪清

(寧德市水產(chǎn)技術(shù)推廣站,福建寧德 352100)

大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)是中國(guó)主要的海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，福建省寧德市的大黃魚(yú)產(chǎn)量占全國(guó)的80%[1]。溶藻弧菌廣泛存在于海水中，溶藻弧菌病是大黃魚(yú)的主要病害之一[2]。目前溶藻弧菌病的防控以抗菌素為主，2017年,冼鈺茵等[3]對(duì)從廣州市出售水產(chǎn)品中分離得到的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌的耐藥性分析結(jié)果表明，水產(chǎn)動(dòng)物的主要病原菌的副溶血弧菌和溶藻弧菌對(duì)萬(wàn)古霉素等抗生素有明顯抗性，多重耐藥比例達(dá)100%，溶藻弧菌的多重耐受現(xiàn)象較為突出。病原菌耐藥性的產(chǎn)生與盲目地大量使用抗菌素有關(guān)。由于病原菌普遍存在耐藥性，因此有必要對(duì)病原菌進(jìn)行耐藥性分析，以達(dá)到精準(zhǔn)用藥、科學(xué)用藥的目的。

筆者于2018年用TCBS和TSA培養(yǎng)基從表現(xiàn)出體表和鰭條潰瘍、出血、鰓缺損癥狀的患病大黃魚(yú)上分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌，該菌株可在TCBS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落顏色為黃色；生理生化鑒定結(jié)果與溶藻弧菌一致，16SrDNA分析結(jié)果表明該菌與溶藻弧菌的同源率為99%，證實(shí)該菌為溶藻弧菌，命名為Val180620。攻毒結(jié)果顯示：Val180620菌株對(duì)大黃魚(yú)具有較強(qiáng)的致病力，在水溫25℃時(shí)腹腔注射感染，其對(duì)規(guī)格(20±2)g的大黃魚(yú)的LD50為2.38×106CFU(另文發(fā)表)。采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)和倍比稀釋法檢測(cè)了該菌的耐藥性，并對(duì)相關(guān)的耐藥性基因進(jìn)行了分析，以期了解該菌的耐藥性情況，為溶藻弧菌病的科學(xué)防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

溶藻弧菌Val180620分離自表現(xiàn)出體表潰瘍等癥狀的大黃魚(yú)，保藏于-80℃。TSA培養(yǎng)平板和TSB培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司?；前芳讎f唑、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、紅霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、土霉素、恩諾沙星、硫酸新霉素、氨芐西林鈉購(gòu)自Sigma公司，用于紙片擴(kuò)散法的藥敏片來(lái)源于溫州市康泰生物科技有限公司[4-7]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

將溶藻弧菌Val180620接種于TSA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)挑取單菌落，接種于10 mL TSB培養(yǎng)液，150 rpm震蕩培養(yǎng)24 h，平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù), 用TSB培養(yǎng)液將菌液稀釋到2×106CFU·mL-1備用。

1.2.2 紙片擴(kuò)散法

在超凈工作臺(tái)中用移液器吸取700 μL濃度為2×106CFU·mL-1的菌液，均勻涂布于TSA平板上，5 min后，將藥敏片貼于平板上，于28℃靜置培養(yǎng)24 h后觀察。各含藥紙片的藥物含量如表1所示。

1.2.3 倍比稀釋法

按表2配置藥品溶液，配制9種藥物的母液初始濃度為2 048 μg·mL-1。在超凈工作臺(tái)中，將藥物于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中使用滅菌TSB肉湯以2n進(jìn)行倍比梯度稀釋?zhuān)灿?jì)12個(gè)稀釋度。各藥物的起始濃度均為1 024 μg·mL-1，配好的藥物最終濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1，每孔藥液體積為120 μL。再往96孔細(xì)胞板內(nèi)加入與藥液等體積，濃度為2×106CFU·mL-1的菌液，于28℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察試驗(yàn)結(jié)果，無(wú)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。取MIC孔前3個(gè)稀釋度的培養(yǎng)液各100 μL，涂布于TSA培養(yǎng)基上，于28℃靜置培養(yǎng)24 h，無(wú)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度判定為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。

1.2.4 耐藥基因的PCR檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道耐藥基因引物序列(表3)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。從TSA平板挑取單菌落，接種于TSB培養(yǎng)基，于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集菌體，按照OMEGA細(xì)菌DNA提取試劑盒方法提取菌體DNA作為PCR模板，PCR體系為：Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)25 μL，菌DNA模板 1 μL，上游引物(10 μM)2 μL，下游引物(10 μM)2 μL，滅菌水 20 μL。PCR反應(yīng)條件95℃ 3 min；94℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72℃ 40 s 34個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。反應(yīng)完成后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 紙片擴(kuò)散法

以紙片擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定菌株Val180620對(duì)9種藥物的敏感性結(jié)果見(jiàn)表4。參照 CLSI標(biāo)準(zhǔn)[8]可以得知，菌株對(duì)氨芐西林鈉耐藥，對(duì)氟苯尼考、磺胺甲噁唑高度敏感。

表1 藥敏紙片含藥量Tab.1 Drug content in drug sensitive slips

表2 各藥物稀釋所用的稀釋液Tab.2 Diluents used for drug dilution

注：A:無(wú)菌水；B:蒸餾水；C:90%丙二醇；D:90%甲醇；E:pH為8的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液；F：pH為6的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液；G：2.5 mol·L-1NaOH；H:95%乙醇

Note: A：aquae sterilisata; B: DD H2O; C:90% propylene glycol; D: 90% CH3OH; E: pH 8，0.1 mol·L-1phosphate buffer; F: pH 6.0，0.1 mol·L-1phosphate buffer; G: 2.5 mol·L-1NaOH; H: 95% CH3CH2OH

2.2 倍比稀釋法

按CLSI(2010)，由表5可知，恩諾沙星、土霉素、硫酸新霉素、磺胺甲噁唑、氟苯尼考對(duì)菌株Val180620有較好的抑菌和殺菌效果，鹽酸多西環(huán)素、紅霉素抑菌和殺菌效果較差。

2.3 耐藥性基因檢測(cè)

耐藥性基因PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥性基因blaCTX-M和喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnrVC擴(kuò)增片段大小與目標(biāo)基因一致。qnrVC5以及四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tetS、tetM擴(kuò)增片段大小與目標(biāo)基因相比有差異(見(jiàn)圖1)，將片段回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明分離菌株含有耐藥基因blaCTX-M和qnrVC。

表4 菌株Val180620對(duì)9種藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Sensitivity of strain Val180620 to 9 kinds of antibiotics

注：S表示敏感，R表示耐藥

Note: S is sensitive, R is resistant

表5 菌株Val180620對(duì)9種藥物的MIC和MBCTab.5 MIC and MBC of strain Val180620 to 9 kinds of antibiotics

注：按照 CLSI標(biāo)準(zhǔn)，MIC值和MBC值大于16為耐藥

Note: According to CLSI standards, MIC and MBC values more than 16 are resistant

3 結(jié)果與討論

溶藻弧菌廣泛存在于海水中，可危害魚(yú)、蝦、貝等多種水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[9]。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的細(xì)菌病防控仍以抗菌素等藥物為主，養(yǎng)殖戶(hù)用藥多憑經(jīng)驗(yàn)，存在一定的盲目性，所使用的藥物常不能得到理想的治療效果，不僅延誤了病情，同時(shí)加重了藥物殘留，因此有必要檢測(cè)病原菌的耐藥性，為精準(zhǔn)用藥提供依據(jù)。

紙片擴(kuò)散法結(jié)果表明，來(lái)自大黃魚(yú)的致病溶藻弧菌對(duì)氟苯尼考、磺胺甲噁唑等藥物高度敏感，對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星，四環(huán)素類(lèi)藥物鹽酸多西環(huán)素、土霉素，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物紅霉素等敏感，而對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物氨芐西林鈉等耐藥。氟苯尼考、鹽磺胺甲噁唑、氨芐西林鈉等藥物MIC和MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果與紙片法基本一致，但四環(huán)素類(lèi)藥物鹽酸多西環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物紅霉素MIC和MBC結(jié)果與紙片擴(kuò)散法不一致。據(jù)報(bào)道，在未加入穩(wěn)定劑的情況下，鹽酸多西環(huán)素、紅霉素水溶液的穩(wěn)定性較差[10-11]，推測(cè)本研究中鹽酸多西環(huán)素、紅霉素的MIC和MBC的試驗(yàn)結(jié)果與紙片法的試驗(yàn)結(jié)果存在差異，與鹽酸多西環(huán)素和紅霉素水溶液的穩(wěn)定性差有關(guān)。

水產(chǎn)常用藥氨芐西林鈉屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物，恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星屬于喹諾酮類(lèi)藥物，鹽酸多西環(huán)素、土霉素屬于四環(huán)素類(lèi)藥物，為了進(jìn)一步分析菌株耐藥的內(nèi)在原因，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了菌株β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥性基因blaCTX-M，喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnrVC、qnrVC5以及四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tetS、tetM的攜帶情況，結(jié)果顯示菌株Val180620同時(shí)攜帶有blaCTX-M和qnrVC這兩種耐藥基因。雖然攜帶喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnrVC，但菌株Val180620卻對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星敏感。推測(cè)該基因可能不是喹諾酮類(lèi)藥物恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星的唯一決定性耐藥基因，有必要對(duì)更多的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)序分析。

韓風(fēng)杰等[12]發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)魁蚶中的溶藻弧菌對(duì)氨芐西林鈉表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性，胡夢(mèng)華等[13]從發(fā)病蝦中分離的一株溶藻弧菌對(duì)磺胺甲噁唑具有一定的耐藥性，與本研究的結(jié)果不一致，說(shuō)明不同環(huán)境條件、不同養(yǎng)殖方式、不同宿主上得到的溶藻弧菌對(duì)藥物的敏感性存在差異。因此在防治溶藻弧菌病時(shí)使用抗菌藥，不應(yīng)僅憑經(jīng)驗(yàn)或照搬書(shū)本，而應(yīng)進(jìn)行藥敏檢測(cè)，根據(jù)藥敏檢測(cè)結(jié)果選擇合適的藥物，以達(dá)到精準(zhǔn)用藥、科學(xué)用藥的目的。