孫春霞 李瑞琴 蘇丹華 閆五玲 李珊珊 呂凌燕 李志剛

近年來，肺癌發(fā)病率和致死率始終高居國內(nèi)惡性腫瘤之首，組織學類型以非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)最為常見，根據(jù)NSCLC組織起源又可分為腺癌和鱗狀細胞癌，前者更為多見，通常起病隱匿、侵襲性強[1]。近年來，人們的健康體檢意識、臨床相關(guān)診斷、治療技術(shù)均較以往取得了長足進步，越來越多的肺癌患者能夠在疾病早期得到明確診斷，并能夠獲得較為理想的治療[2]。但一直以來，由于肺腺癌生物學特性復(fù)雜、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，即使手術(shù)切除后長期生存率仍較低[3]。因此，進一步研究相關(guān)因子及分子機制有助于早期監(jiān)測肺腺癌的發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)測預(yù)后。叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子M1(forkhead box M1，F(xiàn)oxM1)是叉頭蛋白家族中的重要成員，與細胞增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)，且僅在增殖細胞中表達，目前已證實在乳腺癌[4]、賁門癌[5]、肝癌[6]等腫瘤組織中呈高表達，但在肺腺癌組織中的表達情況尚不完全明確。同時，環(huán)氧合酶2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)蛋白的致癌性已得到廣泛證實，已有實驗證實其與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]，但其促進肺腺癌進展的具體機制仍在進一步探究中，且其是否與FoxM1存在協(xié)同作用也未明確?；诖耍F(xiàn)通過免疫組織化學法檢測FoxM1和COX-2在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達情況，明確二者的相關(guān)性，并探究其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

一、臨床標本

研究標本來源于我院病理科2015年1月～5月的存檔蠟塊，包括60份肺腺癌組織和35份癌旁正常肺組織(距癌組織>5cm)，通過細胞學檢驗查實和病理證實為肺腺癌，癌旁組織經(jīng)HE染色證實無癌細胞浸潤，取得病理結(jié)果前未接受手術(shù)、放化療及其他抗腫瘤治療，臨床資料詳實，能夠定期取得電話或微信隨訪，以確診之日為隨訪開始時間，終止事件為因腫瘤而死亡，已排除非腫瘤相關(guān)死亡。肺腺癌組織對應(yīng)患者中，男41例，女19例；年齡48～80(57.27±9.55)歲；有吸煙史者42例；癌變位置：左肺36例，右肺24例；TNM病理分期：Ⅰ期14例、Ⅱ期20例、Ⅲ期19例、Ⅳ期7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。

二、主要試劑與儀器

鼠抗人FOXM1單克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗人COX-2單克隆抗體購自美國Santa cruz公司，SP-9001二抗試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DH4000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱產(chǎn)自天津市泰斯特儀器有限公司，恒溫冰箱產(chǎn)自青島海爾公司，LH50A型倒置相差顯微鏡產(chǎn)自日本OLYMPUS公司，免疫組織化學孵育盒與免疫組織化學抗原修復(fù)盒，產(chǎn)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

三、方法

以標準化親和素-生物素-過氧化物酶免疫組織化學法檢測FoxM1和COX-2在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達。肺腺癌組織、癌旁組織經(jīng)福爾馬林固定后石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度4μm；操作步驟嚴格按照說明書進行，水化及抗原修復(fù)后，以3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；分別使用單克隆抗體FoxM1(1 ∶400稀釋)、COX-2(1 ∶200稀釋)作為一抗 4℃孵育過夜，二抗與SP復(fù)合物各孵育30 min，均以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照；之后依次完成DAB染色、蘇木精復(fù)染、乙醇脫水及中性樹脂封片操作。結(jié)果根據(jù)陽性細胞率得分、染色強度判定，其中陽性細胞率=陽性細胞數(shù)/觀察細胞數(shù)×100%，陽性細胞率<10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別記0分、1分、2分、3分、4分；染色強度：黃色、棕黃色、棕褐色分別記1分、2分、3分；將陽性細胞率得分、染色強度得分相乘，參考文獻[8]以最終得分>2分視為陽性結(jié)果。所有切片均由兩名資深病理醫(yī)師采用盲法(閱片時不知對應(yīng)患者臨床資料)獨立評估。

四、統(tǒng)計學方法

研究數(shù)據(jù)以SPSS19.0統(tǒng)計學軟件分析和處理，計數(shù)資料采取率(%)描述，癌組織、癌旁組織中FoxM1、COX-2表達對比進行χ2檢驗，二者的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)性分析，并借助χ2檢驗分析FoxM1、COX-2表達與肺腺癌病理特征的關(guān)系；通過Kaplan-Meier法(log-rank檢驗)分析生存情況，并以COX回歸模型分析預(yù)后的影響因素；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、FoxM1、COX-2表達情況

免疫組織化學顯示FoxM1陽性主要表達于細胞核，COX-2陽性主要表達于細胞膜或細胞質(zhì)；FoxM1、COX-2在肺腺癌組織中陽性表達率分別為58.33%、68.33%，均明顯高于癌旁組織的17.14%、28.57%(P<0.05)。Spearman等級相關(guān)分析示，肺腺癌組織中FoxM1與COX-2表達無明顯相關(guān)性(r=0.141，P=0.359)(見圖1、2，表1)。

圖1 FoxM1在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(×200)

注：A、B分別為FoxM1在肺腺癌組織中的陽性表達、癌旁組織中的陰性表達。

圖2 COX-2在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(×200)

注：A、B分別為COX-2在肺腺癌組織中的陽性表達、癌旁組織中的陰性表達。

表1 肺腺癌組織及癌旁組織中FoxM1、COX-2表達情況比較[n(%)]

二、FoxM1、COX-2表達與肺腺癌各臨床病理特征的關(guān)系

60份肺腺癌組織標本對應(yīng)患者中，性別、年齡、癌變位置、腫瘤直徑以及是否吸煙與FoxM1、COX-2表達均無明顯相關(guān)性(P>0.05)；而Ⅲ～Ⅳ期肺腺癌組織中FoxM1、COX-2陽性表達率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者FoxM1、COX-2陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，即FoxM1、COX-2表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(見表2)。

表2 FoxM1、COX-2表達與肺腺癌各臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

三、FoxM1、COX-2表達與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

截至2019年4月30日，所有肺腺癌患者隨訪至少48個月，23例死亡，死亡率38.33%。Kaplan-Meier生存分析顯示，F(xiàn)oxM1陽性、陰性表達者中位生存期、生存率分別為16.6個月、31.4個月，48.57%、80.00%，有統(tǒng)計學差異(log-rankχ2=6.094，P=0.014)；COX-2陽性、陰性表達者中位生存期、生存率分別為21.2個月、35.0個月，43.24%、84.21%，亦有統(tǒng)計學差異(log-rankχ2=5.978，P=0.013)。以性別、年齡、吸煙史、癌變位置、腫瘤直徑、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FoxM1、COX-2表達情況為自變量，以生存時間為因變量，采用COX比例風險回歸模型分析，結(jié)果顯示，TNM分期(HR=4.118，95%CI：3.160～9.855)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=1.956，95%CI：1.148～3.394)及FoxM1陽性(HR=2.063，95%CI：1.335～4.251)、COX-2陽性(HR=1.467，95%CI：1.008～3.574)是肺腺癌預(yù)后的影響因素(P<0.05)(見圖3、4，表3)。

圖3 FoxM1陽性、陰性表達者的生存曲線

圖4 COX-2陽性、陰性表達者的生存曲線

表3 多因素COX回歸模型分析

討 論

FoxM1與其他叉頭蛋白家族成員不同，其主要通過對細胞周期進行調(diào)控來刺激細胞增生與有絲分裂進行，故與細胞增殖、代謝、凋亡有關(guān)，且僅在正在增殖的細胞中表達，而在細胞終末分化階段消失，在胚胎發(fā)育、組織再生過程中FoxM1起著不可替代的作用[9]。近年來其在DNA損傷、腫瘤形成和進展等多種生理過程中的重要作用逐漸引起了臨床學者的關(guān)注。既往研究[10]顯示，F(xiàn)oxM1能促進腫瘤細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使基質(zhì)金屬蛋白酶表達及血管上皮生長因子表達上調(diào)，從而增強腫瘤細胞遷移、浸潤能力，促進血管形成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)FoxM1在肺腺癌組織中陽性表達率均明顯高于癌旁組織，且與肺腺癌患者性別、年齡、癌變位置、腫瘤直徑及是否吸煙無關(guān)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明肺腺癌組織中FoxM1表達增高，且與腫瘤進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。李冰等[11]的報道中，F(xiàn)oxM1高表達于肝細胞肝癌組織中而不表達于癌旁組織，在低分化癌組織中表達更顯著，且抑制FoxM1表達能夠下調(diào)肝癌細胞株分泌甲胎蛋白。李佩琴等[12]采用qRT-PCR及免疫組織化學技術(shù)檢測FoxM1，發(fā)現(xiàn)在食管鱗狀細胞癌及癌旁組織中FoxM1表達水平存在明顯差異，且下調(diào)KYSE-30細胞中FoxM1表達后，細胞增殖速度受抑制，認為FoxM1可能參與調(diào)控人食管鱗狀細胞癌細胞KYSE-30的增殖。對于FoxM1與肺癌的關(guān)系，Xiu[13]等發(fā)現(xiàn)FoxM1在A549和H1299細胞中的表達上調(diào)，沉默F(xiàn)oxM1后可抑制經(jīng)紅外處理的A549和H1299細胞的遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，認為FoxM1可能在人肺癌放射治療抵抗中發(fā)揮作用。Hsieh等[14]發(fā)現(xiàn)在人類肺癌細胞中，F(xiàn)oxM1與MED28相互作用，二者均可促使基質(zhì)金屬蛋白酶2基因表達水平升高，從而增強NSCLC細胞的遷移、侵襲能力，與本研究FoxM1與肺腺癌進展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的觀點具有一致性。此外，F(xiàn)oxM1還屬于調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要基因之一，可在多種呼吸系統(tǒng)疾病對應(yīng)組織或細胞中存在表達，并進行DNA復(fù)制和有絲分裂，如Tahmasbpour等[15]的近期研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中也存在FoxM1表達，且長期過度表達可促進癌變，導(dǎo)致腫瘤細胞增殖，增加肺癌風險，也從另一個角度闡釋了FoxM1與肺腺癌的關(guān)系。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)COX-2在肺腺癌組織中陽性表達率均明顯高于癌旁組織，且與肺腺癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明肺腺癌組織中COX-2表達增高，與腫瘤進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。國內(nèi)張愛麗[16]等的研究也顯示肺腺癌組織中COX-2表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并認為可能與表皮生長因子等表達異常有關(guān)。李靜[17]等的報道顯示，43例表皮生長因子受體突變型晚期肺腺癌患者中COX-2表達陽性率高，為53.4%，但顯示COX-2表達與腫瘤分化程度、臨床分期等無明顯相關(guān)性，與本研究有所出入，可能由樣本量及患者肺腺癌分期等差異所致。近年來，COX-2的致癌性已被廣泛報道，如Carvalho等[18]認為其主要通過促進前列腺素合成增多來實現(xiàn)，COX-2不但可經(jīng)MAPK/ERK信號通路抑制凋亡、促進血管生成及轉(zhuǎn)移，而且能夠直接活化表皮生長因子受體及促使其過表達。張蕊[19]等的研究表明，在腫瘤微環(huán)境中髓樣細胞觸發(fā)受體-1(具有參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)的作用)的表達依賴于COX-2信號通路，抑制COX-2可引起髓樣細胞觸發(fā)受體-1表達衰減，繼而可能促進腫瘤細胞逃脫特異性免疫應(yīng)答。另有薈萃研究表明COX-2可指導(dǎo)惡性腫瘤的臨床治療，如食管癌中聯(lián)合應(yīng)用COX-2抑制劑能減少或抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，或降低相關(guān)癌基因表達[20]；Gitlitz[21]等發(fā)現(xiàn)COX-2過表達的NSCLC中，聯(lián)合應(yīng)用COX-2抑制劑能改善對酪氨酸激酶抑制劑耐藥。

由以上分析可知，F(xiàn)oxM1與COX-2的分子機制不同，故本研究相關(guān)性分析顯示肺腺癌組織中FoxM1與COX-2表達無明顯相關(guān)性，提示二者可能不存在協(xié)同作用。此外，本研究進一步隨訪及進行Kaplan-Meier法、COX回歸模型分析，結(jié)果顯示隨訪至少48個月，F(xiàn)oxM1陽性、COX-2陽性表達者生存率均明顯高于陰性表達者，且除了常規(guī)指標TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以外，F(xiàn)oxM1和COX-2陽性也被證實是肺腺癌預(yù)后的影響因素，故認為二者均可能成為預(yù)測肺腺癌侵襲性、生物學行為及判斷預(yù)后的指標，且二者可能成為新的藥物作用靶點，為肺腺癌的個體化用藥選擇提供新的思路。由于本研究樣本量較小，隨訪期較短，相關(guān)結(jié)論仍進一步論證，且FoxM1與COX-2的分子機制仍需深入探究。