李琳 金鵬 劉亞

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstrutive Sleep Apnea-Hypopnea Syndrome,OSAHS)是臨床上的常見(jiàn)病。早期癥狀主要為打鼾，隨著病情發(fā)展，夜間睡覺(jué)會(huì)出現(xiàn)呼吸暫停、間斷性缺氧，這些癥狀將直接影響血流動(dòng)力學(xué)及心血管損害，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及生命健康[1]。目前臨床上對(duì)OSAHS的診斷主要依靠患者的臨床表現(xiàn)和多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，常因各種外在因素影響，致使其診斷受限。睡眠中發(fā)生“呼吸暫停-間斷缺氧”的過(guò)程與“缺血-再灌注”過(guò)程相似，其反復(fù)間斷缺氧會(huì)促進(jìn)血漿內(nèi)的炎性因子釋放[2]。而血液中含有豐富的miRNA，其中微小分子miR-223是表達(dá)量較高且研究較多一種。有研究證明，miRNA能夠調(diào)控循環(huán)中單個(gè)核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活性，減少血液中炎性因子的產(chǎn)生[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)作為一種蛋白水解酶，屬于炎性因子之一。因此，了解OSAHS患者外周血miR-223及MMP-9表達(dá)水平，可能對(duì)OSAHS的診治有一定指導(dǎo)價(jià)值。本研究探討OSAHS患者的外周血miR-223、MMP-9的表達(dá)水平，旨為OSAHS的診治提供一種新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2017年1月至2018年12月在我院收治的OSAHS患者作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料完整；(2)年齡≥18歲；(3)疾病組符合《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(2011年修訂版)》[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(4)所有入組對(duì)象均對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情，且自愿簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有哮喘、風(fēng)濕疾病、嚴(yán)重心律失常者；(2)伴有嚴(yán)重高血壓者；(3)伴有凝血功能障礙；(4)合并心、肝、腎等嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病者；(5)合并感染性疾病者；(6)近三個(gè)月內(nèi)有創(chuàng)傷及手術(shù)史。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的患者共有50例，并將其納入觀察組，其中男性37例，女性13例，年齡20～59歲，平均年齡(41.67±7.62)歲；根據(jù)觀察組患者的睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)數(shù)值分為輕度17例(AHI≤10次/h)、中度22例(10次/h20次/h)。以同期健康體檢的健康者50例作為對(duì)照組，其中男性35例，女性15例，年齡21～59歲，平均年齡(40.51±8.61)歲。兩組性別、年齡等基線(xiàn)資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，(見(jiàn)表1)，具有可比性。本研究已經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

表1 觀察組與對(duì)照組的基線(xiàn)資料對(duì)比

二、方法

1 樣本收集 分別于早晨(7:00～9:00)時(shí)間段，在無(wú)菌條件下，抽取觀察組患者的空腹靜脈血5 mL，在健康體檢當(dāng)日抽取對(duì)照組空腹靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管內(nèi)，并在20min內(nèi)，以3000r/min離心15～20min，提取血清到EP管內(nèi)，EP管口標(biāo)識(shí)樣本的名稱(chēng)、編號(hào)。置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存待測(cè)。離心儀器(生產(chǎn)廠家：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司，型號(hào)：LDZ5-2)。

2 外周血miR-223表達(dá)量測(cè)定 總RNA提?。簩⒊蜏乇渲醒鍢?biāo)本取出，采用TRIzol試劑提取血清中的總RNA，取1微升，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度、純度。在提取過(guò)程中用到的器械及耗材均經(jīng)高溫及水浸泡消除RNA酶。miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：miR-223逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司的TaqMan miRNA試劑盒。miR-223上游引物：5′-CAGAAAGCCCAATTCCATCT-3′；下游引物：5′-GGGCAAATGGATACCATCC-3′； 采用熒光定量PCR法檢測(cè)，內(nèi)參為U6RNA，40個(gè)循環(huán)(95℃ 1min、60℃1min、72℃1min)延伸72℃(7min)。根據(jù)公式2-△△CT分別計(jì)算miR-223的相對(duì)表達(dá)量。

3 外周血MMP-9表達(dá)水平測(cè)定 將超低溫冰箱中血清標(biāo)本取出，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中的MMP-9表達(dá)水平，所用試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特公司，檢測(cè)者按照試劑盒操作步驟進(jìn)行加樣，采用酶標(biāo)儀在450mm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制軟件下完成繪制曲線(xiàn)，并計(jì)算出MMP-9表達(dá)水平。

4 觀察指標(biāo) (1)對(duì)比分析對(duì)照組和觀察組的miR-223相對(duì)表達(dá)量及MMP-9表達(dá)水平間的差異。(2)觀察OSAHS不同病情程度的miR-223、MMP-9表達(dá)情況，并分析miR-223相對(duì)表達(dá)量及MMP-9表達(dá)水平在預(yù)測(cè)OSAHS病情程度的特異性和敏感度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS21.0軟件對(duì)本次研究數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。其中計(jì)量資料比較，采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)或F方差分析,多組之間兩兩比較采用SNK-Q檢驗(yàn)的方法；通過(guò)ROC曲線(xiàn)下面積(area under the cure,AUC)評(píng)價(jià)miR-223相對(duì)表達(dá)量及MMP-9表達(dá)水平的診斷效能。設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、觀察組和對(duì)照組的外周血miR-223、MMP-9表達(dá)對(duì)比

觀察組患者的外周血miR-223相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，而MMP-9表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

二、不同OSAHS病情程度的miR-223、MMP-9表達(dá)水平對(duì)比

OSAHS患者病情輕度、中度及重度的miR-223相對(duì)表達(dá)量及MMP-9表達(dá)水平對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)行兩兩比較中度、重度的miR-223相對(duì)表達(dá)量均低于輕度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，重度miR-223相對(duì)表達(dá)量低于中度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中度、重度的MMP-9表達(dá)水平均高于輕度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，重度的MMP-9表達(dá)水平高于中度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 觀察組和對(duì)照組的外周血miR-223、MMP-9表達(dá)對(duì)比

表3 不同OSAHS病情程度的miR-223、MMP-9表達(dá)水平對(duì)比

注：*表示與輕度對(duì)比，P<0.05；#表示與中度對(duì)比，P<0.05。

三、外周血miR-223、MMP-9表達(dá)水平在預(yù)測(cè)OSAHS病情程度的ROC曲線(xiàn)分析

外周血miR-223相對(duì)表達(dá)量及MMP-9表達(dá)水平在預(yù)測(cè)OSAHS病情程度的AUC面積為：miR-223(0.696)、MMP-9(0.832)(見(jiàn)圖1，表3)。

圖1 外周血miR-223相對(duì)表達(dá)量及MMP-9表達(dá)水平在預(yù)測(cè)OSAHS病情程度的ROC曲線(xiàn)分析

表4 miR-223相對(duì)表達(dá)量及MMP-9水平的ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果

討 論

OSAHS屬于一種慢性睡眠呼吸障礙疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前臨床上普遍認(rèn)為是患者在夜間睡眠時(shí)因舌根后墜等原因引起上呼吸道阻塞、狹窄，致使呼吸減弱或呼吸暫停，出現(xiàn)缺氧，夜間被憋醒，睡眠中斷[5-8]。而反復(fù)的出現(xiàn)呼吸氣息減弱或呼吸暫停，會(huì)發(fā)生間歇性的高碳酸血癥和低氧血癥，繼而誘發(fā)機(jī)體發(fā)生相關(guān)的病理改變，進(jìn)而導(dǎo)致晨起頭痛、白天嗜睡、疲累、乏力、性欲下降、記憶力減退等癥狀，對(duì)患者的生命質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。由于現(xiàn)階段OSAHS缺乏有效的生物學(xué)標(biāo)志物[9]。尋找能夠準(zhǔn)確評(píng)估OSAHS病情的特異指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行早期防治具有意義重大。

微小miRNA是一類(lèi)高度保守的內(nèi)源性非編碼微小RNA分子,長(zhǎng)度約有18～22個(gè)核苷酸。miRNA可通過(guò)與靶基因3′端非編碼區(qū)堿基區(qū)域的miRNA調(diào)節(jié)元件結(jié)合，引起靶mRNA降解或抑制其翻譯。從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10]。因此，循環(huán)miRNA也被認(rèn)為在諸多病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如免疫炎癥、心腦血管疾病、癌癥等[11-13]。微小分子miR-223是miRNA家族中的一員，位于X染色體的q12基因組內(nèi)，能夠作用于眾多靶基因，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)。有研究證實(shí)，miR-223能夠調(diào)節(jié)循環(huán)中單個(gè)核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活性，減少血清中的炎性因子釋放[14]。有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-223可作用于靶基因TRAF6、TAB1、Cul1a/B控制細(xì)胞中的NF-κB通路，阻斷炎癥因子反應(yīng)[15-18]。而OSAHS患者常反復(fù)表現(xiàn)“呼吸暫停-間斷缺氧”，這一過(guò)程恰好是會(huì)促進(jìn)血粘度的增加、血管受損，從而引起血清內(nèi)的炎性因子大幅增加[19-20]。其中MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，是一個(gè)重要的炎性因子。因此，血漿中MMP-9異常增加可能與OSAHS患者外周血循環(huán)中巨噬細(xì)胞激活有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組的血清miR-223相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，而MMP-9表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；OSAHS患者病情輕度、中度及重度的miR-223相對(duì)表達(dá)量呈依次降低，MMP-9濃度呈依次升高。其原因分析：(1)OSAHS患者反復(fù)間斷性缺氧與復(fù)氧，導(dǎo)致ROX系統(tǒng)被激活，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，從而造成血管內(nèi)壁損傷，高脂血癥；脂質(zhì)可迫使病變部位的巨噬細(xì)胞分泌脂蛋白酶，而內(nèi)膜巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體與低密度脂蛋白結(jié)合，形成泡沫細(xì)胞分泌MMP-9,MMP-9的啟動(dòng)可使血管平滑肌細(xì)胞增加、遷移，從而導(dǎo)致外周血MMP-9表達(dá)水平上調(diào)。(2)外周血miR-223低表達(dá)可能與其在調(diào)節(jié)促炎活化功能和抑制脂質(zhì)刺激啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)受阻有關(guān)。OSAHS患者外周血的IL-6、hs-CRP表達(dá)水平與AHI呈正相關(guān)[21]，而IL-6被認(rèn)為是導(dǎo)致miRNA-223低表達(dá)的主要分子之一[22]， miRNA-223低表達(dá)狀態(tài)時(shí)會(huì)調(diào)節(jié)受體，如Toll樣受體觸發(fā)的免疫反應(yīng)，又會(huì)誘導(dǎo)巨核細(xì)胞產(chǎn)生并分泌IL-6[23]，如此循環(huán)，進(jìn)而OSAHS患者癥狀越嚴(yán)重，表現(xiàn)出miRNA-223水平進(jìn)一步下調(diào)?？梢?jiàn)，miRNA-223的表達(dá)水平與OSAHS患者癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)。通過(guò)ROC曲線(xiàn)進(jìn)一步分析miR-223、MMP-9在預(yù)測(cè)OSAHS病情程度的特異性和靈敏度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周血miR-223相對(duì)表量及MMP-9表達(dá)水平在預(yù)測(cè)OSAHS病情程度的AUC面積為：miR-223(0.696)、MMP-9(0.832)。以最大約登指數(shù)計(jì)算出miR-223及MMP-9最大AUC面積相應(yīng)的截?cái)嘀?，其中miR-223截?cái)嘀禐?.637(敏感度=73.30%，特異性=84.70%)，MMP-9截?cái)嘀禐?297.323 ng/L(敏感度=86.20%，特異性=91.30%)。這可能是OSAHS患者在反復(fù)間斷性缺氧與復(fù)氧的癥狀下，導(dǎo)致血液粘度增加，刺激巨噬細(xì)胞大幅釋放MMP-9炎性因子，致使MMP-9的特異性較強(qiáng)。由于血清檢測(cè)具有取材方便、無(wú)創(chuàng)傷、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。提示血清miR-223及MMP-9表達(dá)水平可作為OSAHS患者病情輔助診斷標(biāo)志物。

綜上所述，OSAHS患者外周血miR-223呈低表達(dá)狀態(tài)，MMP-9呈高表達(dá)狀態(tài)，與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。