區(qū)碩俊 岑建斌 梁俊發(fā)* 李秀英 郭新東尋知慶 羅曼妮 曾廣豐

1(廣州海關(guān)技術(shù)中心, 廣東省動植物食品進出口措施研究重點實驗室， 廣州 510623)2(廣州檢驗檢測認證集團有限公司, 國家加工食品質(zhì)量檢驗中心(廣東), 廣州 511447)3(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院, 廣州 511447)

1 引 言

烷基胺是脂鏈烴類和脂環(huán)烴類等烷烴的氨基取代物, 屬于一類親核型固化促進劑。在接觸性食品塑料包裝材料及塑料制品的生產(chǎn)過程中, 烷基胺類固化促進劑能同時對環(huán)氧樹脂和酸酐起雙重作用, 因此在塑料包裝材料的生產(chǎn)工業(yè)中廣泛應用[1,2]。隨著塑料包裝材料與食品的接觸時間增長, 塑料包裝材料及塑料制品中殘留的有機胺會向食品中遷移, 從而對食品造成污染[3,4]。烷基胺類物質(zhì)具有一定的毒性, 如乙醇胺對雌性小鼠經(jīng)口服的半數(shù)致死量為2650 mg/kg[5]。此外, 一些有機胺在亞硝化劑的條件下容易形成具有強致癌性的N-亞硝基化合物[6]。GB4806.6-2016規(guī)定1,6-己二胺在食品接觸材料 聚酰胺(Polyamide, PA) 中的特定遷移限量為2.4 mg/kg[7], 而歐盟指令(EU)No.10/2011要求, 食品接觸材料的芳香族伯胺 PAAs 在食品或食品模擬物中的遷移限量為0.01 mg/kg[8]。建立準確測定食品接觸材料中烷基胺類化合物的方法具有重要的實際意義。

目前, 關(guān)于塑料包裝材料中的胺類物質(zhì)研究主要是針對毒性較強的不飽和芳香胺和酰胺類物質(zhì)的檢測技術(shù)和遷移行為, 對烷基胺類物質(zhì)的相關(guān)報道較少。已報道的胺類物質(zhì)相關(guān)檢測方法主要為高效液相色譜法[4,9,10]、氣相色譜法[11,18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12,20,21]和氣相色譜-質(zhì)譜法[13]。針對食品接觸材料中較多使用的2,2,4-三甲基-1,6-己二胺(2,2,4-Trimethyl-1,6-hexanediamine)、N,N'-二甲基-1,3-丙二胺(N,N'-Dimethyl-1,3-propanediamine)、N,N-二乙基-1,3-丙二胺 (N,N-Diethyl-1,3-propanediamine)、1,6-己二胺 (1,6-Hexanediamine)、1,4-丁二胺 (1,4-butanediamine)、5-氨基-1,3,3-三甲基環(huán)己甲胺 (5-amino-1,3,3-trimethylcyclohexylamine)和4,4'-亞基雙環(huán)己胺(4,4'-methylenebiscyclohexylamine)等烷基胺類物質(zhì)的相關(guān)報道僅有離子色譜法[14～16]、毛細管電泳法[17]、氣相色譜法[18]、氣相色譜-質(zhì)譜法[19]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[20,21], 但離子色譜法要求檢測成分之間的含量差不宜太大, 而塑料材料中的烷基胺含量差異較大; 毛細管電泳法則存在電滲會因樣品組成而變化的問題, 進而影響分離重現(xiàn)性; 高效液相色譜法檢出限高, 且色譜圖雜質(zhì)較多, 影響分析結(jié)果, 同時因為烷基胺類化合物極性較大, 在色譜分析的過程中, 難以保留, 導致色譜行為較差, 且分析時間長; 同樣難以應用于氣相色譜分析, 盡管可對目標物進行衍生, 但仍難以消除雜質(zhì)對目標物的影響; 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有檢出限低, 雜質(zhì)影響小, 不需衍生即可測定的優(yōu)點, 因此更適用于實際分析, 但同樣存在色譜行為較差的情況, 對于分子量小的烷基胺, 儀器的響應低, 檢出限高, 重復性較差。為實現(xiàn)對食品接觸材料中的烷基胺進行準確測定, 本研究以氯甲酸芐酯為衍生劑, 對烷基胺進行酰胺化衍生, 增強了烷基胺的穩(wěn)定性, 并提高了檢測的靈敏度, 同時降低了分析物極性, 有效改善了色譜行為, 結(jié)合高分辨飛行時間質(zhì)譜精確測定分子量, 相比直接測定的LC-MS/MS法具有更高的定性分析能力, 進一步降低假陽性, 建立了同時測定接觸性食品塑料包裝材料及塑料制品中的7種烷基胺類物質(zhì)(結(jié)構(gòu)式見圖1)的HPLC-Q-TOF/MS法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Triple TOF?5600+高分辨質(zhì)譜儀 (美國ABsciex公司); LC-20AD高效液相色譜儀 (日本島津公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。塑料包裝材料(廣州市售), 樣品包括酸奶杯(PP), 礦泉水瓶(PET), 食品包裝袋(PE)和一次性塑料杯(PC)。 無水Na2CO3、NaCl(分析純, 廣州試劑廠); 氯甲酸芐酯Cbz-Cl(≥ 96%, CNW Technologies GmbH); 乙腈(色譜純, 美國Fisher公司);N,N-二乙基-1,3-丙二胺、 1,4-丁二胺、 1,6-己二胺、N,N'-二甲基-1,3-丙二胺、 2,2,4-三甲基-1,6-己二胺、 5-氨基-1,3,3-三甲基環(huán)己甲胺、 4,4'-亞基雙環(huán)己胺標準品(≥ 98%, 德國CNW公司); 實驗用水為經(jīng)Milli-Q純水系統(tǒng)制得的超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準溶液的配制分別準確稱取7種烷基胺標準品各0.1000 g, 用乙腈溶解并定容至100 mL棕色具塞容量瓶中, 配制成1000 mg/L儲備液。吸取上述7種標準的儲備液, 用乙腈稀釋并配制成10 mg/L混合標準工作溶液。分別準確移取混合標準工作溶液各0、5、10、25、50、100和250 μL至已加入5 mL 1.5% Na2CO3溶液的頂空進樣瓶中, 補加0.4% Cbz-Cl-乙腈溶液至5 mL, 得到混標待測樣品， 濃度分別為0、10.0、20.0、50.0、100、200和500 μg/L。

2.2.2 樣品前處理用剪刀將樣品剪成面積小于0.5 cm×0.5 cm的碎片, 混合均勻。準確稱取1.00 g樣品于頂空進樣瓶中, 加入5 mL 1.5% Na2CO3溶液, 再加入5 mL 0.4% Cbz-Cl-乙腈溶液, 加蓋, 于50℃水浴90 min, 取出后放冷， 加入1.5 g NaCl, 加蓋, 搖勻10 s, 靜置分層, 上清液用0.22 μm濾膜過濾, 待測。

2.2.4 色譜及質(zhì)譜條件X-Bridge C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm, Waters公司); 柱溫: 40℃; 進樣量: 2 μL; 流動相A為乙腈, B為0.1%甲酸, 采用梯度洗脫方式洗脫分離; 流速: 0.5 mL/min。梯度洗脫程序: 0.0～10 min, 5%～90% A; 10～13 min, 90% ～100% A; 13～16 min, 100% A; 16～17 min, 100%～5% A； 17～20 min, 5% A。

離子源: ESI和APCI復合源(ESI為化合物測定離子源, APCI為校準離子源); 正離子掃描方式; APCI源連接AB sciex公司自動校正系統(tǒng)(CDS), 每10個樣品自動校正1次, APCI正離子校正液流速0.30 mL/min, 氣簾氣: 40 psi(1 psi=6.895 kPa), 離子源霧化氣: 50 psi, 離子源加熱輔助氣: 50 psi, 離子源溫度: 550℃, 離子源電壓5500 V。一級TOF-MS掃描準確質(zhì)量范圍: 100～1000 Da, 數(shù)據(jù)采集時間100 ms, 去簇電壓: 90 V, 碰撞能量: 10 V; 二級IDA-MS掃描準確質(zhì)量范圍: 50～1000 Da, 去簇電壓: 90 V, 碰撞能量: (35±15) V; 高靈敏模式, 數(shù)據(jù)采集時間50 ms, 信號閾值100 cps, IDA實驗每循環(huán)采集6次數(shù)據(jù), 動態(tài)背景減法扣除。

2.2.5 數(shù)據(jù)分析方法所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)AB Sciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集, 數(shù)據(jù)用PeakView 2.0, MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等軟件定性定量處理分析。根據(jù)TOF-MS和IDA-MS高分辨質(zhì)譜獲得7種烷基胺衍生物的準確分子量, 結(jié)合各級碎片參數(shù)進行定性和定量分析。

2.2.6 響應曲面設(shè)計前期研究發(fā)現(xiàn), 前處理條件對7種烷基胺的衍生有影響, 因此, 基于優(yōu)化后的衍生溫度和時間, 采用響應曲面設(shè)計優(yōu)化Na2CO3比例、Cbz-Cl比例和NaCl用量3個前處理衍生條件。采用Box Behnken設(shè)計模型設(shè)計衍生因素條件。該設(shè)計模型的理論是xi=Xi-X0=ΔX, 其中,xi為Xi獨立變量值,X0為Xi獨立變量的中心值, ΔX為變量截距值。三因素響應因素設(shè)計變量分別是Na2CO3比例(X1), Cbz-Cl比例(X2), NaCl用量(X3), 變量參數(shù)見表1。

表1 響應曲面設(shè)計因素水平表

Table 1 Factors and levels of response surface methodology

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇及定性和定量分析依據(jù)

7種待分析的烷基胺衍生物均含有N原子, 因此更傾向于得到質(zhì)子, 初步掃描后, 在ESI+模式下均得到[M+H]+的準分子離子峰, 因此,在流動相中加入甲酸可增加離子化效率?？疾炝艘译?0.1%甲酸和甲醇-0.1%甲酸為流動相體系時烷基胺衍生物的色譜行為和離子化程度, 結(jié)果表明, 乙腈-0.1%甲酸為流動相時, 7種烷基胺衍生物的響應均高于甲醇-0.1%甲酸為流動相時的響應值, 且峰形更好, 故選擇乙腈-0.1%甲酸作為流動相, 并優(yōu)化了梯度洗脫程序, 7種烷基胺衍生物可在13 min內(nèi)完成分析。

在一級質(zhì)譜的模式下, 用保留時間和分子離子的精確質(zhì)量數(shù)對待測的7種烷基胺衍生物進行初步定性分析。6個加標樣品連續(xù)進樣后, 7種烷基胺衍生物保留時間的相對標準偏差均小于0.2%; 實驗測定的分子離子質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)的誤差在-0.6×10-6～0.9×10-6之間(表2)。在IDA-MS模式下, 可獲得待測物的二級質(zhì)譜圖, 通過特征性子離子精確質(zhì)量數(shù), 確定元素組成, 從而推測母離子裂解途徑, 進一步增強了對待測物的確證能力。7種烷基胺衍生物的母離子提取離子流色譜圖和裂解途徑分別見圖2和圖3。

表2 7種烷基胺衍生物的母離子元素組成及精確質(zhì)量

Table 2 Elemental composition and accurate mass measurement of seven alkylamine-derivatives

圖2 7種烷基胺衍生物母離子的提取離子流色譜圖?；衔锞幪柡兔Q與表2中對應

Fig.2 Extracted ion chromatograms of parent ions of seven alkylamine-derivatives The numbers and name of compounds are corresponding to those in Table 2

圖3 7種衍生物母離子的二級質(zhì)譜裂解圖, 化合物編號和名稱與表2中對應Fig.3 Cleavage pathway of parent ions of seven derivatives. The number and name of compounds are corresponding to those in Table 2

3.2 衍生條件的優(yōu)化

由于7種烷基胺中有6種具有兩個伯胺和仲胺, 因此衍生過程中會產(chǎn)生單胺衍生物和雙胺衍生物兩種。 而雙胺衍生物較單胺衍生物分子量更大, 響應更高且極性也更低, 有助于在前處理中隨乙腈層析出, 因此為準確測定, 需要優(yōu)化衍生化反應條件使伯胺和仲胺得到充分衍生?？疾炝藴囟群蜁r間對烷基胺衍生效率的影響, 結(jié)果表明, 50℃下衍生率最高, 隨著溫度升高, 衍生率下降(圖4); 在衍生反應時間為90 min時, 7種衍生物的響應強度達到最高, 隨著反應時間延長, 響應強度變化不明顯(圖5)。因此, 本研究選擇在50℃下衍生反應90 min, 在此條件下, 烷基胺最終衍生產(chǎn)物的響應值與相應的濃度呈良好的線性關(guān)系。7種烷基胺各形態(tài)衍生物信號強度見圖6, 雙胺衍生物響應遠高于單胺衍生物, 說明反應進行完全, 反應平衡系數(shù)較大。

圖4 衍生溫度對響應強度的影響, 化合物編號和名稱與表2中對應Fig.4 Effect of derivatization temperature on response (500 μg/L, 60 min). The number and name of compounds are corresponding to those in Table 2

圖5 衍生時間對響應強度的影響, 化合物編號和名稱與表2中對應Fig.5 Effect of derivatization time on response(500 μg/L, 50℃). The number and name of compounds are corresponding to those in Table 2

圖6 7種烷基胺衍生物響應強度, 化合物編號和名稱與表2中對應Fig.6 Response intensity of derivatives of seven alkylamine (500 μg/L). The number and name of compounds are corresponding to those in Table 2

3.3 響應曲面設(shè)計優(yōu)化衍生條件

為了得到前處理方法對測定食品接觸塑料材料中7種烷基胺的最佳衍生條件, 采用響應曲面設(shè)計優(yōu)化Na2CO3比例(X1)、Cbz-Cl比例(X2)和NaCl用量(X3)等衍生條件?？疾炝搜苌鷾囟群蜁r間對目標衍生物響應值的影響, 結(jié)果表明, 在50℃下衍生反應90 min目標衍生物響應值最高, 因此, 在此條件下進行響應曲面設(shè)計優(yōu)化實驗, 結(jié)果見表3。

表3 響應曲面設(shè)計優(yōu)化實驗結(jié)果

Table 3 Results of response surface methodology optimization

標準Std運行RunNa2CO3比例X1Cbz-Cl比例X2NaCl用量X35-氨基-1,3,3-三甲基環(huán)己甲胺衍生物回收率5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexylamine-derivative Recoveries(%)311.00.51.592.5521.00.31.095.4731.00.32.092.61241.50.52.094.5852.00.32.092.1262.00.11.588.4672.00.31.094.1981.50.11.085.31191.50.12.090.8

續(xù)表3(Continued to Table 3)

標準Std運行RunNa2CO3比例X1Cbz-Cl比例X2NaCl用量X35-氨基-1,3,3-三甲基環(huán)己甲胺衍生物回收率5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexylamine-derivative Recoveries(%)14101.50.31.598.74112.00.51.592.917121.50.31.595.615131.50.31.594.81141.00.11.585.416151.50.31.599.713161.50.31.597.510171.50.51.093.7

為進一步表示模型中三因素及三因素交互效應對烷基胺回收率的影響, 得到相應曲面設(shè)計的影響因素三維立體圖(圖7)。響應曲面設(shè)計模型根據(jù)實驗所得5-氨基-1,3,3-三甲基環(huán)己甲胺的回收率, 進行模型建立與預測, 獲得最佳的因素水平組合, 即Na2CO3比例為1.5%, Cbz-Cl比例為0.4%, NaCl用量為1.5 g。在此優(yōu)化后的因素水平組合下, 可以獲得最佳的烷基胺的平均回收率, 因此, 實際檢測樣品時, 均采用此因素水平組合和優(yōu)化后的衍生溫度和時間進行樣品前處理。

圖7 響應曲面設(shè)計實驗結(jié)果三維圖Fig.7 3D plot of response surface methodology of different parameters on isophorondiamine recovery

3.4 基質(zhì)效應

按照2.2.2節(jié)的前處理方法分別對實驗空白(不添加樣品)和7種烷基胺呈陰性的PET樣品進行處理, 得到溶劑空白液和基質(zhì)液。分別移取500 μg/L的衍生后標準溶液50 μL各兩份, 其中一份加入950 μL的溶劑空白液, 另一份加入950 μL基質(zhì)液, 搖勻后進行測定。以基質(zhì)標準液和溶劑標準液的響應比值K為評判依據(jù), K值范圍在0.90～1.10之間, 則認為基質(zhì)效應不明顯。結(jié)果表明, 7種烷基胺衍生物的K值在0.95～1.01之間, 說明本方法基質(zhì)效應不明顯, 因此采用溶劑標準曲線進行定量分析。

3.5 分析方法線性方程、檢出限與定量限

按照優(yōu)化的前處理及色譜、質(zhì)譜條件進行分析, 以峰面積Y對進樣濃度X(μg/L)進行線性回歸, 7種烷基胺衍生物的響應值與其濃度呈良好的線性關(guān)系, 相關(guān)系數(shù)均大于0.9957, 7種烷基胺的檢出限(LOD,S/N=3)為0.5～1.0 μg/kg, 定量限(LOQ,S/N=10)為2.0～4.0 μg/kg, 表明本方法具有較高的靈敏度。目標分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表4。

3.6 回收率及精密度

為進一步驗證酰胺化衍生前處理方法對測定食品接觸性塑料材料中烷基胺分析方法的可行性, 選擇陰性樣品, 進行3個濃度水平的加標回收實驗。在1.00 g樣品中分別加入10、20和50 μL濃度為100 μg/L的乙腈混合標準溶液, 得到濃度為1.0、2.0和5.0 μg/kg的加標樣品, 對每個水平日內(nèi)重復測定6次。由表5可知, 7種烷基胺的平均回收率為82.0%～108.0%, RSD為3.5%～6.8%, 表明本方法可滿足7種烷基胺的分析測定要求。

表4 7種烷基胺的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

Table 4 Linear ranges, linear regression equations, correlation coefficient, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of seven kinds of alkylamines

烷基胺Alkylamines線性范圍Linear range(μg/L)線性方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient(R2)檢出限LOD(μg/kg)定量限LOQ(μg/kg)N,N-Diethyl-1,3-propanediamine1.0～500Y=3984X-284.40.99780.502.01,4-Butanediamine1.0～500Y=15010X+1563590.99720.752.51,6-Hexanediamine1.0～500Y=25172X+2012670.99770.752.5N,N'-Dimethyl-1,3-propanediamine1.0～500Y=18448X+910380.99910.752.52,2,4-Trimethyl-1,6-hexanediamine1.0～500Y=15589X+380440.99941.004.05-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexylamine1.0～500Y=5722X+237560.99770.752.54,4'-Methylenebiscyclohexylamine1.0～500Y=13414X+886010.99571.004.0

表5 食品接觸性塑料材料中7種烷基胺的加標回收率(n=6)

Table 5 Recoveries of 7 kinds of alkylamines in food contact plastic materials (n=6)

烷基胺Alkylamines添加量Added(μg/kg)測得值Found(μg/kg)平均回收率Recovery(%)相對標準偏差RSD(%)N,N-Diethyl-1,3-propanediamine1,4-Butanediamine1,6-HexanediamineN,N'-Dimethyl-1,3-propanediamine2,2,4-Trimethyl-1,6-hexanediamine5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexylamine4,4'-Methylenebiscyclohexylamine1.01.05105.05.82.01.9999.56.15.04.3386.63.51.01.08108.04.12.01.9497.14.15.04.5591.04.41.01.04104.04.12.01.9698.15.25.04.8597.04.51.01.02102.06.22.02.08104.04.35.05.37107.04.11.01.04104.04.42.02.06103.05.55.05.16103.04.31.00.89589.56.02.01.6582.34.35.04.2585.03.71.00.82082.05.22.01.6482.06.85.04.9198.24.2

圖8 陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.8 Extracted ion chromatograms obtained for thepositive sample. The number and names are corresponding to those in Table 2

3.7 實際樣品分析

采用本方法分析隨機抽取的4種食品接觸塑料材料, 包括酸奶杯(PP)、礦泉水瓶(PET)、食品包裝袋(PE)和一次性塑料杯(PC)各10種。分析結(jié)果表明, 所有酸奶杯(PP)均檢測到N,N-二乙基-1,3-丙二胺和1,4-丁二胺, 濃度范圍分別為5.20～5.80 μg/kg和90.0～125 μg/kg, 而其中有一部分酸奶杯(PP)檢出5-氨基-1,3,3-三甲基環(huán)己甲胺。N,N-二乙基-1,3-丙二胺和1,4-丁二胺也在水瓶(PET)中檢出, 濃度為7.70～8.80 μg/kg和68.0～82.5 μg/kg。 陽性樣品的提取離子色譜圖見圖8。

4 結(jié) 論

建立了HPLC-TOF/MS同時測定食品接觸塑料材料中的7種烷基胺方法， 對烷基胺進行酰胺化柱前衍生, 增大了分析目標物的響應值; 結(jié)合響應曲面設(shè)計, 優(yōu)化了烷基胺的酰胺化衍生條件。結(jié)果表明, 目標物在13 min內(nèi)分離良好, 分析速度快; 利用高分辨質(zhì)譜對目標物進行了定性與定量分析。本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、準確度高, 可為烷基胺類物質(zhì)的毒理研究及評估食品接觸塑料材料中烷基胺類物質(zhì)危害提供靈敏且可靠的分析測定方法。