安 春 杜佩瑤 張 振 盧小泉*，2

1(天津市分子光電科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系， 天津 300072)2(甘肅省生物電化學(xué)與環(huán)境分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 蘭州 730070)

1 引 言

銅(Cu)被廣泛應(yīng)用于電子設(shè)備、機(jī)械、建筑等領(lǐng)域[1]，同時(shí)也是人體所需的基本元素。Cu2+在動(dòng)物和人體的多種代謝過程(如血紅蛋白的形成、骨骼的發(fā)育、結(jié)締組織的代謝及維持神經(jīng)元的正常功能等)中發(fā)揮了重要作用[2,3]，但過量的Cu2+會(huì)導(dǎo)致腸胃不適[4]、腎臟和肝臟損傷、紅細(xì)胞形成異常、身體虛弱、帕金森綜合癥、威爾遜病等[5]，對(duì)身體造成不良影響。因此，建立一種高選擇性、快速、靈敏監(jiān)測(cè)體內(nèi)和環(huán)境中Cu2+含量的方法具有重要意義。目前，檢測(cè)Cu2+的方法包括如電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES)[6]、電化學(xué)法[7]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[8]、原子吸收光譜法(AAS)[9]等。然而，測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)、復(fù)雜的樣品制備過程、繁瑣的分析程序限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。

熒光檢測(cè)技術(shù)是一種高靈敏度、高選擇性、操作簡(jiǎn)便、快速響應(yīng)的技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地進(jìn)行待測(cè)物的分析檢測(cè)。Adinarayana等[10]通過在大環(huán)化合物中引入2,2-聯(lián)吡啶單元，形成了單陰離子中心，可以穩(wěn)定Zn2+，進(jìn)而誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)，且在所研究的金屬離子中，只有Zn2+可以導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，因此，可以選擇性檢測(cè)Zn2+。Pathan等[11]發(fā)現(xiàn)，As(III)與磁性石墨烯氧化物量子點(diǎn)結(jié)合，限制了分子內(nèi)振動(dòng)，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，從而可以定性與定量檢測(cè)As(III)，檢出限低至5.1 μg/L。有機(jī)熒光染料[2]和熒光半導(dǎo)體量子點(diǎn)[12]可用于分析檢測(cè)，但抗光漂白性差、尺寸大等問題限制了二者在生物體內(nèi)的應(yīng)用[13]。

目前，金屬納米簇(<2 nm)由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)如斯托克斯位移大、熒光壽命長(zhǎng)、生物相容性好、從紫外到近紅外可調(diào)的寬帶熒光發(fā)射和強(qiáng)的抗光漂白能力等[13～18]引起了廣泛關(guān)注。Yuan等[19]采用一鍋法合成了聚乙烯亞胺(PEI)包裹的藍(lán)綠色發(fā)射的銀簇，用于Cu2+的檢測(cè)。Yu等[20]合成了萬(wàn)古霉素包裹的藍(lán)綠色發(fā)射的金納米簇(Gold nanoclusters, AuNCs)，基于電子轉(zhuǎn)移機(jī)制導(dǎo)致熒光猝滅， 可用于檢測(cè)Fe3+。Roy等[21]合成了具有藍(lán)色熒光的AuNCs，量子產(chǎn)率為41.3%，可用于檢測(cè)As(III)，檢出限為53.7 nmol/L。Yuan等[22]通過相轉(zhuǎn)移的方法制備了發(fā)射藍(lán)色熒光的銀簇，可以高選擇性、免標(biāo)記地檢測(cè)Hg2+，檢出限為5 nmol/L。Li等[23]通過配體交換的方法制備了發(fā)射藍(lán)綠色熒光的AuNCs，可以高選擇性地檢測(cè)Cu2+，檢出限為71.24 nmol/L。Zhang等[24]通過刻蝕方法在水溶液中合成了pH依賴的、發(fā)射綠色熒光的銀簇，該銀簇具有良好的穩(wěn)定性，可以高選擇性地檢測(cè)Hg2+，檢出限低至4 nmol/L。Deng等[25]通過主客體效應(yīng)制備了發(fā)射綠色熒光的AuNCs，量子產(chǎn)率高達(dá)65%。Zhou等[26]通過組氨酸還原制備出發(fā)射綠色熒光的AuNCs，具有雙光子效應(yīng)，可以選擇性檢測(cè)Fe3+; 在5～125 μmol/L 較寬的濃度范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度與濃度之間呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。雖然金屬納米簇的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但是其通常發(fā)射藍(lán)綠色的熒光，限制了其在生物體內(nèi)的應(yīng)用。

本研究利用谷胱甘肽(GSH)作為還原劑和穩(wěn)定劑，制備了發(fā)射紅色熒光的AuNCs，在pH=5.5的條件下，可快速、靈敏、高選擇性地檢測(cè)水中痕量Cu2+。GSH包裹的AuNCs水溶性好、毒性低，便于制備和使用。AuNCs的紅色熒光可避免復(fù)雜生物基質(zhì)背景熒光的干擾，提高Cu2+檢測(cè)的準(zhǔn)確性。利用本方法檢測(cè)水中Cu2+，檢出限低至23 nmol/L，低于我國(guó)飲用水Cu2+限量標(biāo)準(zhǔn)(15.6 μmol/L)[30]，為水中Cu2+的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便快捷的方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

JEOL Model JEM-2100透射電子顯微鏡(200 kV，日立高新技術(shù)有限公司); T6 New Century 紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用有限責(zé)任公司); F-7000 熒光光譜儀(日本日立公司); Nicolet-iS50 傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)賽默飛公司); XD-3A X-射線衍射儀(40 kV，λ=0.15406 nm， 10°～80°，日本島津公司); Axis Ultra Dld X-射線光電子能譜(英國(guó)Axis Ultradld 公司)。

HAuCl4·3H2O，L-GSH(上海阿拉丁試劑有限公司); K2HPO4、KH2PO4(3A化學(xué)試劑公司); 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、NaCl、KCl、CaCl2、MnCl2、CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、CdCl2·5/2H2O、ZnCl2、HgCl2、CuCl2·2H2O、FeCl2·4H2O、MgSO4、BaCl2·2H2O、FeCl3·6H2O、Al(NO3)3·9H2O、Pb(NO3)2、Cr(NO3)3·9H2O(上海阿拉丁試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。自來水樣品取自實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)用鼠為Wistar大鼠。

2.2 AuNCs的制備

AuNCs的合成參照文獻(xiàn)[18]的方法并略作改進(jìn)。HAuCl4(101.566 mmol/L，0.0985 mL)和GSH(100 mmol/L，0.15 mL)依次加入到4.7 mL超純水中，在N2保護(hù)下，70℃反應(yīng)24 h。得到的亮黃色AuNCs溶液于4℃條件下儲(chǔ)存，備用。

2.3 pH值的優(yōu)化

取20 μL AuNCs原液與980 μL不同pH值的PBS緩沖液(10 mmol/L，由K2HPO4、KH2PO4、KCl配制)混勻，反應(yīng)3 min，測(cè)量熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，狹縫寬度10 nm; 取20 μL AuNCs原液、3 μL Cu2+(1 mmol/L)溶液與977 μL不同pH值的PBS緩沖液(10 mmol/L)混勻，反應(yīng)3 min，測(cè)量熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，狹縫寬度10 nm。

2.4 Cu2+的檢測(cè)

配制1 mmol/L Cu2+溶液，逐步稀釋成不同濃度的Cu2+溶液，備用。取3 μL不同濃度的Cu2+溶液、20 μL AuNCs原液與977 μL PBS緩沖液(10 mmol/L，pH 5.5)混勻，反應(yīng)3 min，測(cè)量熒光光譜。

2.5 選擇性和抗干擾測(cè)試

配制10 mmol/L(Co2+、Fe2+、Ni2+、Al3+、Zn2+、Cd2+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、K+、Ba2+)、5 mmol/L (Fe3+、Hg2+、Cr3+)和4 mmol/L Pb2+金屬離子的溶液。取3 μL不同金屬離子的溶液、20 μL AuNCs原液與977 μL PBS(10 mmol/L，pH 5.5)緩沖液混勻，反應(yīng)3 min，測(cè)量熒光光譜。

先取3 μL不同金屬離子的溶液，加入20 μL AuNCs原液和977 μL PBS(10 mmol/L，pH 5.5)混合溶液中，反應(yīng)3 min。隨后，在混合液中再加入3 μL Cu2+(1 mmol/L)溶液，反應(yīng)3 min，測(cè)定加入Cu2+前后的熒光強(qiáng)度。

2.6 實(shí)際樣品處理和分析

取10 mL自來水，煮沸，除去其中的氯氣，備用。取5 mL大鼠全血置于抗凝管中，靜置30 min， 3000 r/min離心10 min，取上層清液，于-80℃保存，備用。為了評(píng)估本方法的實(shí)用性，在自來水或血清樣品中，添加不同濃度的Cu2+(200、 500和2000 nmol/L)。隨后，加入AuNCs原液，反應(yīng)3 min，測(cè)定熒光光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 材料表征

圖1 (A，B) AuNCs的高分辨透射電鏡圖; (C)AuNCs的紫外-可見吸收譜圖(a)和熒光發(fā)射譜圖(激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm)(b)，插圖為AuNCs在可見光下的照片(左)和365 nm紫外燈下的照片(右); (D)紅外譜圖: (a)谷胱甘肽，(b)AuNCs; (E)AuNCs的X-射線電子衍射譜圖; (F)Au 4f的X-射線光電子能譜Fig.1 (A, B) High-resolution transmission electron microscope images of gold clusters (AuNCs); (C) UV-vis absorption spectrum (a) and fluorescence spectrum (λex=365 nm) (b) of AuNCs, inset is the photograph of AuNCs solution under daylight (left) and 365 nm UV-light irradiation (right); (D) Fourier transform infrared spectra of (a) glutathione (GSH) and (b) AuNCs; (E) X-ray diffraction spectrum of AuNCs; (F) X-ray photoelectron spectroscopy of Au 4f

3.2 可行性測(cè)試及檢測(cè)條件的優(yōu)化

如圖2A所示， Cu2+可導(dǎo)致AuNCs熒光猝滅，且熒光猝滅程度隨著Cu2+濃度的逐漸增大而增強(qiáng)?？紤]到溶液pH值和反應(yīng)時(shí)間對(duì)AuNCs的熒光強(qiáng)度均有影響，對(duì)影響AuNCs熒光強(qiáng)度的因素進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，AuNCs的熒光強(qiáng)度對(duì)pH值具有依賴性，如圖2B所示，隨著pH值從3.0增加到10.0， AuNCs的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。Cu2+對(duì)AuNCs熒光的猝滅效果同樣與pH值有關(guān)，如圖2C所示，溶液pH值從3.0變化到5.5，Cu2+對(duì)AuNCs的熒光猝滅程度隨著pH值升高而急劇增大，pH>5.5時(shí), Cu2+對(duì)AuNCs的熒光猝滅程度略有減小。在pH=5.5時(shí), 熒光猝滅程度最大。因此， 檢測(cè)Cu2+的實(shí)驗(yàn)均在pH=5.5條件下進(jìn)行。

對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，如圖2D所示，在1 min內(nèi), AuNCs的熒光幾乎被Cu2+完全猝滅， 3 min后保持不變。

綜上，實(shí)驗(yàn)條件確定為: pH=5.5; 反應(yīng)時(shí)間3 min; 激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm。

圖2 (A)AuNCs檢測(cè)Cu2+可行性實(shí)驗(yàn): (a)AuNCs，(b)AuNCs + Cu2+(200 nmol/L)和(c)AuNCs + Cu2+(1 μmol/L)的熒光光譜; (B)AuNCs隨pH變化的熒光光譜曲線(pH值(a～h): 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0); (C)在pH 3.0～11.0之間AuNCs中加入3 μmol/L Cu2+熒光強(qiáng)度變化情況(F、F0分別表示有和無Cu2+時(shí)AuNCs熒光強(qiáng)度); (D)Cu2+(3 μmol/L)猝滅AuNCs熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化Fig.2 (A) Feasibility test of AuNCs for detection of Cu2+: (a) AuNCs, (b) AuNCs+Cu2+ (200 nmol/L) and (c) AuNCs+Cu2+ (1 μmol/L); (B) Fluorescence spectra of AuNCs at different pH values (from a to h: 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0); (C) Fluorescence intensity of AuNCs in the presence of Cu2+ (3 μmol/L) in pH 3.0-11.0 (F and F0 stand for the fluorescence intensity of AuNCs with and without Cu2+, respectively); (D) Fluorescence intensity of AuNCs varies with time after addition of 3 μmol/L Cu2+

3.3 AuNCs檢測(cè)Cu2+的靈敏性和選擇性

測(cè)定了不同Cu2+濃度下AuNCs的熒光光譜，如圖3A所示，AuNCs對(duì)Cu2+表現(xiàn)出超靈敏的響應(yīng)特性，隨Cu2+濃度從0 μmol/L增加到6 μmol/L，610 nm處AuNCs的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，當(dāng)Cu2+濃度為6 μmol/L時(shí)，熒光幾乎完全猝滅。如圖3B所示，隨著Cu2+的濃度從25 nmol/L增加到6.0 μmol/L，在610 nm處F0/F值(F0和F分別代表不存在和存在Cu2+時(shí)AuNCs的熒光強(qiáng)度)逐漸增大,并在兩段濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。在25 nmol/L～1.2 μmol/L之間的線性關(guān)系如圖3C所示，F(xiàn)0/F=0.9831+0.0007908[Cu2+] (R2=0.9963)，檢出限為23 nmol/L(S/N=3)。在1.2～6.0 μmol/L之間的線性關(guān)系如圖3D所示，F(xiàn)0/F=0.0047[Cu2+]-4.7913 (R2=0.9845)。本方法的檢出限低于美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)規(guī)定飲用水中Cu2+的最高限量(20 μmol/L)[1]，也低于我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對(duì)Cu2+的限量水平(15.6 μmol/L)[30]。相比于其它文獻(xiàn)報(bào)道，本研究合成的AuNCs對(duì)Cu2+的檢測(cè)具有更高的靈敏度，如表1所示。

圖3 (A)不同濃度Cu2+時(shí)AuNCs熒光發(fā)射光譜圖， Cu2+濃度(a～o): 0、100、200、300、400、600、800、1000、1100、1300、1500、2000、3000、4000和6000 nmol/L; (B)AuNCs熒光猝滅程度隨Cu2+濃度變化曲線; (C、D)Cu2+濃度與AuNCs熒光強(qiáng)度之間線性曲線(B、C、D中F和F0分別代表有和沒有Cu2+時(shí)AuNCs熒光強(qiáng)度)Fig.3 (A) Changes of AuNCs fluorescence emission spectra with different concentrations of Cu2+ (from a to o: 0, 100, 200, 300, 400, 600, 800, 1000, 1100, 1300, 1500, 2000, 3000, 4000 and 6000 nmol/L); (B) Change of fluorescence quenching degree of AuNCs with different concentrations of Cu2+; (C, D) Linear curves of concentration of Cu2+ and fluorescence intensity of gold cluster (F and F0 stand for the fluorescence intensity of AuNCs with and without Cu2+ in B, C and D, respectively)

測(cè)試了AuNCs對(duì)多種常見的金屬離子(Co2+、Fe2+、Ni2+、Al3+、Zn2+、Cd2+、Fe3+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Hg2+、K+、Cr3+、Pb2+、Ba2+和Cu2+)的熒光響應(yīng)。由圖4A可見，只有Cu2+能夠急劇猝滅AuNCs的熒光，而其它金屬離子對(duì)AuNCs的熒光強(qiáng)度幾乎沒有影響?？垢蓴_實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4B所示，將多種常見金屬離子(Co2+、Fe2+、Ni2+、Al3+、Zn2+、Cd2+、Fe3+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Hg2+、K+、Cr3+、Pb2+、Ba2+)分別加入到AuNCs中，隨后加入Cu2+，其它金屬離子的加入對(duì)AuNCs的熒光強(qiáng)度影響較小，表明AuNCs可以高選擇性地檢測(cè)Cu2+，而不受其它離子的干擾。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所合成的AuNCs可以高選擇性、高靈敏性檢測(cè)Cu2+。

表1 基于不同納米材料的分析方法檢測(cè)Cu2+的性能比較

Table 1 Comparison of analytical performance of analytical methods based on different nanomaterials for detection of Cu2+

納米材料Nanomaterials線性范圍Linear range(nmol/L)檢出限D(zhuǎn)etection limit(nmol/L)參考文獻(xiàn)Ref.dNSiO2-AuAg NCs200～200060[15]Au NCs/N-CDs10000～1500003500[31]MOF-525-67[32]SiO2@QDs@CDs0～3000140[33]CuNPs14000～350005600[34]AuNCs25～600023本工作 This work

圖4 (A)AuNCs對(duì)不同金屬離子的響應(yīng)情況; (B)干擾離子存在時(shí)， AuNCs對(duì)Cu2+的響應(yīng)情況(Cu2+: 3 μmol/L; Hg2+、Cr3+、Fe3+: 15 μmol/L; Pb2+: 12 μmol/L; 其它離子: 30 μmol/L)Fig.4 (A) Response of AuNCs to different metal ions; (B) Fluorescence response of AuNCs in the presence of interfering metal ions to Cu2+ (Cu2+: 3 μmol/L; Hg2+, Cr3+ and Fe3+: 15 μmol/L; Pb2+: 12 μmol/L; others: 30 μmol/L)

3.4 檢測(cè)機(jī)理

圖5 AuNCs檢測(cè)Cu2+示意圖Fig.5 Schematic illustration of detection of Cu2+ with AuNCs

圖6 (a)AuNCs、(b)AuNCs + Cu2+(2.5 μmol/L)和(c)AuNCs + Cu2+(2.5 μmol/L)+ EDTA的熒光譜圖Fig.6 Fluorescence spectra of (a) AuNCs, (b) AuNCs+Cu2+ (2.5 μmol/L) and (c) AuNCs+Cu2+ (2.5 μmol/L) + EDTA

據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道，由于配體-金屬間電子轉(zhuǎn)移或配體-金屬-金屬間電子轉(zhuǎn)移，金屬中心的三重態(tài)產(chǎn)生輻射躍遷，使AuNCs產(chǎn)生熒光。如圖5所示，谷胱甘肽表面包含有大量的氨基和羧基，它們與Cu2+之間有強(qiáng)的配位作用[35]，可以將Cu2+絡(luò)合到AuNCs表面形成復(fù)合物，阻斷配體-金屬間或者配體-金屬-金屬間的電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致非輻射躍遷增強(qiáng)，AuNCs的熒光猝滅[36～38]，而EDTA與Cu2+之間配位作用強(qiáng)于AuNCs與Cu2+之間配位作用，可將Cu2+從AuNCs表面移除，AuNCs熒光再次恢復(fù)。由圖6可見，加入Cu2+，使AuNCs的熒光急劇猝滅(曲線b); 加入EDTA后，AuNCs的熒光再次恢復(fù)(曲線c)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，Cu2+阻斷配體-金屬間電子轉(zhuǎn)移或配體-金屬-金屬間電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致AuNCs的熒光猝滅。

3.5 實(shí)際樣品中Cu2+的檢測(cè)

為更進(jìn)一步評(píng)估AuNCs熒光納米傳感器在實(shí)際樣品中檢測(cè)Cu2+的準(zhǔn)確性和可靠性，測(cè)定了自來水、血清中Cu2+含量。AuNCs對(duì)空白樣品沒有明顯的熒光響應(yīng)，表明空白樣品中不存在或存在的Cu2+含量低于本方法的檢出限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，自來水和血清中Cu2+的加標(biāo)回收率在96.2%～100.1%范圍內(nèi)，表明基于AuNCs熒光納米傳感器可檢測(cè)實(shí)際樣品中Cu2+的含量。

表2 實(shí)際樣品中 Cu2+的測(cè)定結(jié)果

Table 2 Determination results of Cu2+in real samples

樣品Sample加入值A(chǔ)dded(nmol/L)測(cè)定值Found(nmol/L)回收率Recovery(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%, n=3)自來水Tap water0ND——200.0192.496.21.6500.0496.899.40.42000199699.82.3樣品Sample加入值A(chǔ)dded(nmol/L)測(cè)定值Found(nmol/L)回收率Recovery(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%, n=3)大鼠血清Rat serum0ND——200.0196.098.02.9500.0500.3100.11.02000198499.22.6ND 未檢出 Not detectable

4 結(jié) 論

制備了一種特異性識(shí)別Cu2+的AuNCs熒光納米傳感器。此納米傳感器利用AuNCs表面的氨基和羧基與Cu2+存在強(qiáng)配位作用，阻斷AuNCs中的電子轉(zhuǎn)移，猝滅AuNCs的熒光，實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)Cu2+的目標(biāo)。AuNCs因其毒性小、水溶性好，在生物成像、生物標(biāo)記方面具有良好的應(yīng)用前景。AuNCs發(fā)射紅色的熒光可避免復(fù)雜生物基質(zhì)背景熒光的干擾，在pH=5.5的條件下, 可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu2+快速、靈敏、高選擇性地檢測(cè)，提供了一種簡(jiǎn)便、快速、可靠的檢測(cè)Cu2+的方法。本方法有望被拓展到疾病診斷、生物成像、生物標(biāo)記、水質(zhì)分析等領(lǐng)域。