魏佳會(huì) 陳 佳 吳弼東 陳作紅 吳劍峰* 謝劍煒*

1(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所， 抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100850)2(中國(guó)人民解放軍第五醫(yī)學(xué)中心， 北京 100071) 3(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410081)

1 引 言

每年因誤食毒蘑菇導(dǎo)致中毒死亡的事件在世界各國(guó)時(shí)有發(fā)生，也是我國(guó)食物中毒事件中導(dǎo)致死亡的重要因素之一?？蓪?dǎo)致中毒的蘑菇種類較多，但引起死亡的主要是鵝膏菌，所占比例高達(dá)90%以上[1～4]。致死原因是其中含有的劇毒鵝膏肽類毒素，主要包括3類(鵝膏毒肽、鬼筆環(huán)肽、毒傘肽)[5]。鵝膏毒肽為慢性毒素，其主體結(jié)構(gòu)為雙環(huán)八肽，已鑒定的天然毒素有9種，人的致死劑量約為0.1 mg/kg[6]。其中，α-鵝膏毒肽(α-Amanitin)、β-鵝膏毒肽(β-Amanitin)在鵝膏菌中含量高、毒性強(qiáng)，是主要致死毒素，它們能選擇性抑制細(xì)胞RNA聚合酶的活性，阻止蛋白質(zhì)合成，最終導(dǎo)致肝臟等器官壞死[7～9]。鬼筆環(huán)肽為雙環(huán)七肽，屬于速效毒素，能專一性地打破絲狀肌動(dòng)蛋白與球狀肌動(dòng)蛋白之間的解聚與裝配平衡，動(dòng)物靜脈或腹腔注射后，一般2～5 h后死亡。毒傘肽為單環(huán)七肽，其中毒機(jī)制與鬼筆環(huán)肽一致[10]，但目前圍繞毒傘肽的相關(guān)研究較少。

誤食含有鵝膏肽類毒素的毒蘑菇后，其中毒癥狀具有一定潛伏期，常在肝腎等細(xì)胞大量損壞后才出現(xiàn)[11]，且鵝膏毒肽在血漿及尿液中代謝快、濃度低，導(dǎo)致常用的檢測(cè)方法(如熒光檢測(cè)技術(shù)[12,13]、紫外-可見(jiàn)吸收光譜檢測(cè)技術(shù)[14]、放射免疫法[15～18]和酶聯(lián)免疫吸附法[19,20]等)無(wú)法進(jìn)行有效檢測(cè)。因此，建立快速、有效的生物樣本中毒素的檢測(cè)方法，對(duì)于食物中毒的毒源鑒定和中毒病人的針對(duì)性治療具有重要意義。高效液相色譜(HPLC)因其具有靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是蘑菇毒素分析檢測(cè)最常用的檢測(cè)技術(shù)。Maurer 等[21]最先將高效液相色譜(HPLC)應(yīng)用于毒蘑菇中鵝膏毒肽的分析檢測(cè)。為提高檢測(cè)靈敏度，Maurer等[22]采用免疫親和提取方法分析尿液中的α-Amanitin和β-Amanitin，有效減少了組分之間的相互干擾。陳作紅等[23]利用HPLC 對(duì)9種主要的肽類毒素(鵝膏毒肽和鬼筆毒肽)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，基于各組分色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)樣比較以及峰面積與毒素含量之間的線性關(guān)系獲得肽類毒素的種類和含量。但毒蘑菇樣品因其種類較多，所含化學(xué)成分復(fù)雜，多種毒素同時(shí)有效分離困難, 而且僅依賴保留時(shí)間比對(duì)易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用尤其是串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry，MS-MS)聯(lián)用技術(shù)因其具有樣品需要量少、高靈敏度、高精確度、高分辨率鑒定和量化目標(biāo)分析物等突出優(yōu)勢(shì)，有效解決了多種蘑菇毒素同時(shí)檢測(cè)及確證等難點(diǎn)問(wèn)題，已逐漸成為食品與生物樣品分析中的主流技術(shù)，并被應(yīng)用于中毒患者體液及生物樣本中鵝膏毒肽的檢測(cè)[3,14, 24～31]。如Filigenzi 等[32]采用液相色譜-多級(jí)線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)中毒后人和動(dòng)物的血清和肝臟蕈菌毒素進(jìn)行定性與定量檢測(cè)，以MS/MS/MS 模式測(cè)定血清和肝臟中α-鵝膏毒肽的含量，方法的檢出限低于1 ng/g。 Tomková等[33]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)尿液中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽，檢出限可達(dá)1 μg/L; Zhang等[34]等采用UPLC-MS/MS測(cè)定血漿、血清及尿液中的鵝膏毒肽和鬼筆環(huán)肽，檢出限低于0.5 μg/L，并通過(guò)引入PRiME微洗脫技術(shù)，節(jié)省了人力和費(fèi)用。魏佳會(huì)等[35]等通過(guò)收集12 種劇毒鵝膏菌子實(shí)體,優(yōu)化毒素提取方法, 采用 HPLC 法建立了12 種鵝膏菌的特征指紋圖譜, 并引入潑尼松為內(nèi)標(biāo), 比較了各子實(shí)體中毒素的相對(duì)含量差異; 基于高效液相色譜-電噴霧離子化-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-ESI-QTOF/MS) 技術(shù)對(duì)各毒素進(jìn)行了鑒定。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，檢測(cè)對(duì)象主要為鵝膏毒肽和鬼筆環(huán)肽，較少涉及毒傘肽。

本研究基于多種蘑菇毒素對(duì)照品，采用高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法，通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法和分析條件，有效解決了血液和尿液樣本中各類毒素提取回收率低的問(wèn)題， 建立了一種可同時(shí)測(cè)定血漿和尿液中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、二羥鬼筆環(huán)肽、丙氨酸羥毒傘肽及二羥毒傘肽共3類重要鵝膏肽類毒素的分析方法。本方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏和回收率高的優(yōu)勢(shì)，每個(gè)樣品分析時(shí)間在10 min內(nèi)， 可用于鵝膏菌中毒患者生物樣本的定性與定量分析，為臨床準(zhǔn)確識(shí)別毒蘑菇中毒提供了技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200 HPLC色譜儀、Agilent 6430 三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Aglient公司); RVC 2-33 CD離心濃縮儀(德國(guó)Christ公司); KQ 250E超聲儀(昆山市超聲儀器廠); R200D電子天平(德國(guó)Sartorius公司); 3k30高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司); RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); 固相萃取儀(上?？普軆x器有限公司); Oasis HLB固相萃取柱、Oasis WCX固相萃取柱、Oasis Prime uElution HLB 96孔板均購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、二羥鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度>95%; 二羥毒傘肽(Viroidin)、丙氨酸羥毒傘肽(Ala-viroidin)由本實(shí)驗(yàn)室制備，純度>95%[35]; 微囊藻毒素LR Microcystin-LR(分析純，百靈威科技有限公司); 乙酸銨(98%,美國(guó)Acros Organics公司); 甲酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司).實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電陰率為18.2 MΩ cm)，由MilL-Q 10 超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)制備。中毒患者血尿樣品由湖南省湘雅醫(yī)院和湖南省人民醫(yī)院采集提供，0℃冰包運(yùn)至本實(shí)驗(yàn)室后,于-20℃保存，備用。

2.2 樣品前處理

采用固相萃取對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理[32]，具體操作步驟如下：選用固相萃取小柱HLB (1 mL，30 mg)，用1 mL甲醇、1 mL水依次活化，靜置平衡; 取500 μL樣品(血漿或尿樣)用超純水稀釋至1 mL，上樣，緩慢通過(guò)萃取柱，1 mL 5%甲醇(V/V)淋洗，2 mL 100%甲醇(V/V)分步洗脫，洗脫液在60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加入內(nèi)標(biāo)微囊藻毒素(濃度為 1 μg/mL)10 μL，以90 μL 10%甲醇(V/V)復(fù)溶，14000 r/min離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 毒素對(duì)照品的提取與分離

將采自云南、貴州、湖南等地的毒蘑菇干子實(shí)體研磨成粉末狀(部分樣品由湖南師范大學(xué)陳作紅教授提供)，參照文獻(xiàn)[35]中所述毒素提取方法處理樣品： 稱取2 g粉末于50 mL離心管中，加30 mL 含0.5%甲酸的50%(V/V)甲醇，室溫下，240 r/min振搖12 h，14000 r/min離心10 min，沉淀加入30 mL提取液，超聲30 s，同法離心，合并兩次上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1 mL水復(fù)溶，同體積石油醚去脂，再次旋干后，用50%甲醇溶液復(fù)溶，過(guò)濾，得樣品提取液。采用制備液相色譜對(duì)提取液進(jìn)行分離，色譜柱為Unisil 10-120 C18(21.2 mm×250 mm，21.2 μm); 流動(dòng)相A為水，B為甲醇，采用梯度洗脫(0～40 min， 10%～50% B; 40～60 min， 50% B; 60～65 min， 50%～10% B); 流速15 mL/min; 柱溫： 40℃; 進(jìn)樣量：1 mL; 檢測(cè)波長(zhǎng)：295 nm。將收集的各組分經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再進(jìn)行冷凍干燥，獲得毒素參考品。采用液相色譜及核磁共振對(duì)純度進(jìn)行表征，純度不低于95%。

2.4 鵝膏肽類毒素的液相色譜分離條件

色譜柱：Capcell Core C18(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)，保護(hù)柱：F3643 EXP Guard Cartridge Capcell Core C18S-2.7(2.1 mm×5 mm, 2.7 μm); 流動(dòng)相A為10 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇，采用梯度洗脫(0～0.5 min，15%B; 0.5～5.0 min，15%～60% B; 5.0～6.0 min，60%～70% B; 6.0～9.5 min, 70% B; 9.5～9.6 min, 70%～15% B); 流速為 0.3 mL/min; 柱溫40℃; 進(jìn)樣量10 μL。

2.5 鵝膏肽類毒素的質(zhì)譜檢測(cè)條件

電噴霧離子源(ESI); 正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式; 離子源溫度： 100℃; 霧化氣溫度： 325℃; 霧化氣氣流; 10.0 L/min; 噴霧電壓： 275 kPa; 毛細(xì)管電壓： 4 kV; 其它參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜的MRM 參數(shù)

Table 1 Mass spectrometry (MS) parameters for multiple reaction monitoring

毒素Toxins監(jiān)測(cè)離子對(duì)Mass transitions(m/z)碎片電壓Fragmentor(V)碰撞能Collision energy(eV)β-鵝膏毒肽 β-Amanitin920.4/259920.4/862505080α-鵝膏毒肽 α-Amanitin919.4/259919.4/862505080丙氨酸羥毒傘肽 Ala-viroidin869.4/237869.4/1582505080二羥鬼筆環(huán)肽 Phalloidin789.3/330789.3/1572504565二羥毒傘肽 Viroidin897.4/40897.4/237897.4/158250405080微囊藻毒素LR Microcystin-LR995.3/218995.3/1341807075

3 結(jié)果與討論

3.1 內(nèi)標(biāo)的選擇

為建立鵝膏肽類毒素的定量檢測(cè)方法，參照文獻(xiàn)[36～40]，首先對(duì)內(nèi)標(biāo)進(jìn)行了篩選和優(yōu)化?？紤]到鵝膏肽類毒素為環(huán)狀多肽，且一般宜選結(jié)構(gòu)類似物作為內(nèi)標(biāo)。本研究選取了利福平、微囊藻毒素RR(MC-RR)、微囊藻毒素LR(MC-LR)等主體結(jié)構(gòu)均為大環(huán)多肽的化合物作為內(nèi)標(biāo)候選對(duì)象。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MC-LR的提取回收率、色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜離子化效率均優(yōu)于利福平和MC-RR，因此，最終選擇MC-LR作為校正內(nèi)標(biāo)。

3.2 樣品前處理方法優(yōu)化

由于血漿及尿液中鵝膏肽類毒素含量較低，一般較難進(jìn)行直接檢測(cè)，需對(duì)其中所含的肽類毒素進(jìn)行富集凈化處理。參照文獻(xiàn)[34,41～44]中的樣品預(yù)處理方法，對(duì)于血漿樣品，首先考察了直接以乙腈為沉淀劑的提取效果，結(jié)果表明，α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽的回收率均低于50%。固相萃取柱是生物樣本分析中最常用的分離富集方法，本研究比較了Prime HLB μElution 96孔板、Waters Oasis HLB和Waters Oasis WCX共3種萃取小柱的提取效果，結(jié)果表明，Waters Oasis HLB對(duì)鵝膏毒肽、鬼筆環(huán)肽及毒傘肽的提取回收率均可達(dá)93.0%以上。分別考察了淋洗液和洗脫液對(duì)鵝膏肽類毒素凈化效果的影響，結(jié)果表明，淋洗液和洗脫液分別為甲醇-水(5∶95，V/V)和甲醇時(shí)，各毒素提取回收率最高，為使提取完全，最終選用2 mL甲醇進(jìn)行分步洗脫。優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件為：Waters Oasis HLB萃取小柱分離，淋洗液為5%甲醇溶液，洗脫液為2 mL甲醇，優(yōu)化提取效率的結(jié)果如圖1所示。基于上述前處理方法，對(duì)于尿液樣本，還考察了微孔濾膜過(guò)濾-直接進(jìn)樣的方式，結(jié)果表明，基質(zhì)干擾嚴(yán)重而且毒素?fù)p失多，故最終血漿、尿液都采用固相萃取分離方法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

圖1 4種提取方法的提取效果對(duì)比圖Fig.1 Comparison of extration efficiency of four kinds of extraction methods

3.3 高效液相色譜分離條件優(yōu)化

分別采用水-甲醇、水-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動(dòng)相，在CAPCELL PAK C18(2.1 mm ×100 mm, 2.7 μm)、CAPCELL PAK AQ(2.1 mm ×100 mm, 2.7 μm)色譜柱上進(jìn)行分離，結(jié)果表明，采用CAPCELL PAK C18(2.1 mm ×100 mm, 2.7 μm)色譜柱時(shí)，各毒素分離效果最佳。流動(dòng)相中含一定比例乙腈時(shí)，其洗脫能力過(guò)強(qiáng)，導(dǎo)致β-鵝膏毒肽、α-鵝膏毒肽保留時(shí)間過(guò)于集中，色譜峰無(wú)法完全分離; 而將乙腈更換為10 mmol/L乙酸銨溶液時(shí)，有效改善了各鵝膏毒肽色譜峰形，分離效果明顯改善，最終確定流動(dòng)相A為10 mmol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為甲醇; 通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫程序，實(shí)現(xiàn)了5種鵝膏類毒素的完全分離，且一次梯度洗脫分析僅需10 min， 5種毒素分離的總離子流色譜圖如圖2所示。

圖2 5種毒素分離的總離子流色譜圖1. α-鵝膏毒肽; 2. β-鵝膏毒肽; 3. 二羥鬼筆環(huán)肽; 4. 丙氨酸羥毒傘肽; 5. 二羥毒傘肽MC-LR微囊藻毒素-LRFig.2 High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) chromatograms of five amanita peptide toxins1, α-Amanitin; 2, β-Amanitin; 3, Phalloidin; 4, Ala-viroidin; 5, Viroidin; MC-LR: Microcystin-LR

3.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在電噴霧正離子模式MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，優(yōu)化各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)，使目標(biāo)分析物離子的信號(hào)達(dá)到最佳。確定各毒素以及內(nèi)標(biāo)的母離子， 根據(jù)離子對(duì)的豐度確定最佳碎片電壓(Fragmentor)以及碰撞電壓(CE)等。各毒素均監(jiān)測(cè)兩對(duì)特征離子對(duì)，其中豐度最大的作為定量離子對(duì)。 優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

3.5 線性范圍、檢出限及定量限

以空白血漿及尿液配制濃度分別為5、20、50、100、250和500 μg/L的樣品，采用HPLC-MS/MS檢測(cè)，根據(jù)信噪比(S/N)大于3的標(biāo)準(zhǔn)確定檢出限(LOD)，信噪比(S/N)大于10的標(biāo)準(zhǔn)確定定量下限(LLOQ)。如表2所示，α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽在血漿和尿液中的檢出限均為0.5 μg/L，定量下限均為5 μg/L，線性范圍均為5～500 μg/L; 丙氨酸羥毒傘肽、二羥鬼筆環(huán)肽以及二羥毒傘肽在血漿、尿液中的檢出限均為0.2 μg/L，在血漿、尿液中的定量下限分別為2 和1 μg/L，其定量上限均為500 μg/L; 5種鵝膏毒肽在各自濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9990～0.9998。本方法可同時(shí)測(cè)定血漿/尿液基質(zhì)中包括鵝膏毒肽、鬼筆環(huán)肽以及毒傘肽在內(nèi)3類鵝膏肽類毒素，靈敏度高、線性范圍寬， 能夠滿足公共衛(wèi)生突發(fā)事件、法醫(yī)毒物學(xué)和臨床毒物學(xué)檢測(cè)的需要。

表2 血漿與尿液樣品中鵝膏毒肽分析方法的線性方程、檢出限及定量下限

Table 2 Calibration curves, detection limits and quantitation limits for amainta peptide toxins in plasma and urine sample

3.6 準(zhǔn)確度和精密度

采用人空白血漿和尿液進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)，按照生物分析方法學(xué)指導(dǎo)原則[45]，回收率和精密度采用定量下限(LLOQ)樣品和質(zhì)控樣品進(jìn)行評(píng)估，包括批內(nèi)回收率、精密度和批間回收率、精密度。每個(gè)分析批次包括4個(gè)濃度水平分別為定量下限(LLOQ)、低濃度質(zhì)控樣品(LQC)、中濃度質(zhì)控樣品(MQC)和高濃度質(zhì)控樣品(HQC)，每個(gè)濃度點(diǎn)由5份獨(dú)立樣品組成，在血漿及尿液中分別加入5種毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以及內(nèi)標(biāo)溶液，處理后進(jìn)樣檢測(cè)。根據(jù)線性范圍配置4點(diǎn)不同濃度的質(zhì)控(QC)樣品，混合均勻后，再按樣品前處理方法進(jìn)行操作，色譜分析結(jié)果見(jiàn)表3，血漿中各毒素的準(zhǔn)確度為92.2%～114.7%， RSD在1.4%～10.9%之間; 尿液中的準(zhǔn)確度為92.6%～103.7%，RSD在1.9%～9.8%之間。上述結(jié)果表明，所建立的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法準(zhǔn)確、可靠，符合分析方法的要求。

表3 血漿和尿液樣品中鵝膏毒肽分析方法的準(zhǔn)確度和精密度

Table 3 Accuracy and precision of this method for detection of Amainta toxins in plasma and urine

毒素Toxins血漿 Blood日內(nèi) Intra-day (n=5)加標(biāo)濃度Added(ng/L)準(zhǔn)確度Accuracy(%)精密度RSD(%)日間 Inter-day(n=5)準(zhǔn)確度Accuracy(%)精密度RSD(%)尿液 Urine日內(nèi) Intra-day (n=5)加標(biāo)濃度Added(ng/L)準(zhǔn)確度Accuracy(%)精密度RSD(%)日間 Inter-day (n=5)準(zhǔn)確度Accuracy(%)精密度RSD(%)α-鵝膏毒肽α-Amanitinβ-鵝膏毒肽β-Amanitin二羥鬼筆毒傘肽Phalloidin二羥毒傘毒Viroidin丙氨酸羥毒散素Ala-viroidin5104.04.4102.45.2599.03.899.63.510104.74.397.46.910102.59.8102.77.0200100.42.599.23.5200102.44.0102.33.0375103.93.0100.76.037598.95.6100.23.9594.99.699.46.5596.91.996.73.81098.47.298.46.71094.75.497.84.5200104.62.1106.06.820094.53.199.06.5375111.03.6104.67.137592.73.498.17.55111.25.7114.45.7195.38.998.67.710103.86.8100.66.8297.72.8100.14.320097.24.1100.74.120093.35.598.05.9375106.57.8104.67.837595.25.499.35.42103.110.9111.56.4197.46.1103.77.9592.22.998.05.4293.26.995.65.5200103.11.4103.94.920093.94.796.76.3375106.71.8102.27.037592.62.498.36.62114.77.5110.37.5197.43.398.15.15101.33.593.14.7296.25.299.35.6200107.73.499.15.220099.24.599.73.6375107.43.4101.28.837592.84.198.36.8

3.7 基質(zhì)效應(yīng)和回收率

當(dāng)采用液相色譜質(zhì)譜法對(duì)生物樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，常存在較嚴(yán)重的基質(zhì)干擾。考察了6批來(lái)自解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心的正常血漿，以及低質(zhì)控(LQC)、高質(zhì)控(HQC)兩個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平獨(dú)立配制3份。將5種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制在初始比例的流動(dòng)相中得到樣品A; 對(duì)空白血漿、尿液進(jìn)行處理得到空白基質(zhì)，再在空白基質(zhì)中加入5種毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液得到樣品B; 在空白的血漿、尿液中加入5種毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后再進(jìn)行處理得到樣品C; 對(duì)樣品A和B同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，響應(yīng)值[(B-A)/A×100%]即為基質(zhì)效應(yīng)(ME)，對(duì)B和C同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，響應(yīng)值C/B即為回收率(RE)。結(jié)果如表4所示， 血漿和尿液中5種毒素的回收率為90.1%～114.6%，除個(gè)別添加濃度稍有基質(zhì)效應(yīng)外，其它條件下基質(zhì)不影響血漿或尿液中各種鵝膏肽類毒素的檢測(cè)，滿足測(cè)定要求。

3.8 實(shí)際中毒樣品分析

采用優(yōu)化的液相色譜質(zhì)譜方法對(duì)9名疑似毒蘑菇中毒患者的血漿及尿液樣品進(jìn)行了分析。樣品采樣時(shí)間在食用后48～72 h，在不同時(shí)間點(diǎn)采集了11份血漿與18份尿液樣品，按人員以A至M進(jìn)行編號(hào)(如D1～Dn為同一人的樣品)，檢測(cè)結(jié)果如表5所示，僅在一位中毒患者不同時(shí)間點(diǎn)采集的兩份血漿樣品中檢出α-鵝膏毒肽(D2與D5)，含量分別為3.4和4.4 μg/L，其尿液樣品中還檢出β-鵝膏毒肽和二羥鬼筆環(huán)肽，含量分別為28.8和13.8 μg/L; 另一患者僅在其尿液樣品中檢出二羥鬼筆環(huán)肽，含量為9.2 μg/L。所采集的血漿及尿液樣品中均未檢出毒傘肽。

表4 血漿及尿液樣品的回收率與基質(zhì)效應(yīng)

Table 4 Recoveries and matrix effect (ME) of amainta peptide toxins in urine and plasma sample(n=3)

毒素Toxins血漿 Blood加標(biāo)濃度Added(μg/L)回收率Rcovery(%)基質(zhì)效應(yīng)ME(%)尿液 Urine加標(biāo)濃度Added(μg/L)回收率Rcovery(%)基質(zhì)效應(yīng)ME(%)α-鵝膏毒肽α-Amanitinβ-鵝膏毒肽β-Amanitin二羥鬼筆毒傘肽Phalloidin二羥毒傘毒Viroidin丙氨酸羥毒散素Ala-viroidin10110.85.01098.64.7375105.09.137595.86.51098.09.21099.47.0375100.48.437590.13.410100.312.2298.310.1375103.59.637594.22.35107.414.6295.47.537598.07.137596.85.45113.87.6291.43.7375114.610.737593.65.6

表5 9名疑似毒蘑菇中毒患者的血漿及尿液中毒樣品的檢測(cè)結(jié)果

Table 5 Detection results of plasma and urine samples from 9 suspected poisoning patients by mushroom

樣品類型Type of samplesα-鵝膏毒肽α-Amatoxin(μg/L)β-鵝膏毒肽β-Amatoxin(μg/L)二羥鬼筆環(huán)肽Phalloidin(μg/L)血漿樣品(D2)Plasma3.4--血漿樣品(D5)Plasma4.4--尿液樣品(D7)Urine-28.813.8尿液樣品(E2)Urine--9.2

4 結(jié) 論

基于高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，采用固相萃取前處理方式，建立了可同時(shí)檢測(cè)血漿及尿液中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、二羥鬼筆環(huán)肽、二羥毒傘肽、丙氨酸羥毒傘肽共3類5種鵝膏肽類毒素的分析方法。本方法具有凈化效果好、回收率和靈敏度高、涉及毒素范圍廣和適用性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，能夠滿足鵝膏肽類毒素定性與定量分析的要求，為毒蘑菇中毒事件的診斷及救治提供了重要的技術(shù)支持。