錢玉梅，孫藝爽

（1.河南省腫瘤醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450008；2.武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071）

北芪五加片收載于中國藥典2015年版一部[1]，是由黃芪和刺五加浸膏加工而成的中成藥復(fù)方制劑，具有益氣健脾、寧心安神的功效，臨床多用于心脾兩虛、心神不寧所致的失眠多夢、體虛乏力、食欲不振等病癥的治療?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅以黃芪甲苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)，未對處方中其他成分進(jìn)行定量檢測，單一成分難以全面反映北芪五加片的整體質(zhì)量，文獻(xiàn)中也僅檢索到對該制劑中紫丁香苷的含量檢測[2]。中成藥復(fù)方制劑其臨床治療效果往往都是多個有效成分共同作用的結(jié)果，多指標(biāo)控制模式已逐步應(yīng)用于中成藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。該制劑方中黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，性甘，味微溫，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、生津養(yǎng)血等功效，主要含黃酮類、多糖類、皂苷類等成分，其中毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素等為其黃酮類主要成分，黃芪甲苷為其皂苷類主要成分，中國藥典2015年版一部黃芪藥材項(xiàng)下以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡糖苷為其控制指標(biāo)；方中刺五加浸膏為五加科植物刺五加的干燥根和根莖或莖經(jīng)加工制成的浸膏，中國藥典2015年版一部刺五加浸膏項(xiàng)下以紫丁香苷、刺五加苷E和異嗪皮啶為其控制指標(biāo)。本試驗(yàn)首次采用高效液相色譜（HPLC）波長切換技術(shù)，同時對北芪五加片中毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的含量進(jìn)行測定，所建立的方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏，為北芪五加片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和完善提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AG285型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-400KDE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

毛蕊異黃酮葡糖苷對照品（批號：111920-201606，含量97.6 %），芒柄花素對照品（批號：111703-201504，含量100.0 %），紫丁香苷對照品（批號：111574-201605，含量95.2 %），刺五加苷E對照品（批號：111713-201804，含量97.9 %），異嗪皮啶對照品（批號：110837-201608，含量100.0 %，中國食品藥品檢定研究院）；芒柄花苷（批號：486-62-4，含量95.0 %），毛蕊異黃酮（批號：20575-57-9，含量98.0 %，上海純優(yōu)）；北芪五加片（規(guī)格：每片重0.5 g，批號：180805，181025，190127，山西晉新雙鶴藥業(yè)）；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為30 ℃；流動相為乙腈-0.1 %磷酸溶液，梯度洗脫（0～11.0 min，29.0 %A；11.0～34.0 min，29.0 %A→37.0 %A；34.0～49.0 min，37.0 %A→42.0 %A；49.0～55.0 min，42.0 %A→ 29.0 %A），流速為1.0 ml/min；檢測波長分別為254 nm（0～34.0 min，檢測毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素）[3-4]和220 nm（34.0～55.0 min，檢測紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶）[1,5]；進(jìn)樣量為10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶對照品適量，用50 %甲醇制成每1 ml含毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶分別為0.676，0.932，0.894，2.736，0.598，0.352，0.138 mg的單成分對照品儲備溶液；再分別精密吸取上述單成分對照品儲備溶液各2.5 ml，用50 %甲醇制成混合對照品溶液（各對照品濃度分別為：毛蕊異黃酮葡糖苷33.8 mg/L、芒柄花苷46.6 mg/L、毛蕊異黃酮44.7 mg/L、芒柄花素136.8 mg/L、紫丁香苷29.9 mg/L、刺五加苷E17.6 mg/L、異嗪皮啶6.9 mg/L）。

2.2.2 供試品溶液 取北芪五加片適量，除去薄膜衣，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，加50 %甲醇25 ml，密塞，稱重，超聲提取30 min，放冷，50 %甲醇補(bǔ)重，搖勻，過濾，制成北芪五加片供試品溶液，備用。

2.2.3 陰性樣品溶液 按中國藥典2015年版一部北芪五加片項(xiàng)下的處方比例及工藝，分別制備缺黃芪、缺刺五加浸膏的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)方法操作，制成兩種陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取2.2項(xiàng)下制備的4種溶液各適量，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。結(jié)果顯示所記錄色譜圖基線平穩(wěn)，北芪五加片中所測定成分毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶與其他峰均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)按所測定成分色譜峰計均大于4000；陰性樣品在所測各成分的保留時間處無色譜峰干擾，色譜圖見圖1。

圖1 北芪五加片HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下單成分對照品儲備溶液各0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 ml，用50 %甲醇稀釋成系列混合對照品溶液，依法進(jìn)樣檢測，以毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，以10倍信噪比計算各待測成分的定量限（LOQ），結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2.1項(xiàng)下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積。結(jié)果所測定成分峰面積的RSD分別為0.72 %，0.66 %，1.61 %，0.54 %，1.12 %，0.89 %和1.31 %。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次北芪五加片樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，依法測定測得毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積，計算所測定成分含量。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的平均含量分別為0.885，1.221，1.031，3.679，0.718，0.391，0.148 mg/g，RSD分別為1.17 %，1.08 %，0.25 %，1.24 %，1.73 %，0.86 %和1.92 %。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份北芪五加片供試品溶液，于0，2，4，8，16，24 h依法進(jìn)樣測定，記錄毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積。結(jié)果北芪五加片供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定（室溫），毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶峰面積的RSD分別為0.69 %，0.73 %，1.59 %，0.56 %，1.08 %，1.72 %和1.29 %。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶峰對照品適量，用50 %甲醇制成每1 ml分別含上述對照品0.446，0.608，0.522，1.836，0.352，0.198，0.074 mg的加標(biāo)用混合對照品溶液。取同一批次已知含量的北芪五加片9份，除去薄膜衣，研細(xì)，每份0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入加標(biāo)用混合對照品溶液0.5 ml 3份、1.0 ml 3份、1.5 ml 3份（對照品加入量約相當(dāng)于樣品含有量的50 %，100 %，150 %），按2.2.2項(xiàng)方法制成加樣回收樣品溶液，依法進(jìn)樣檢測毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積，計算回收率及RSD值，結(jié)果見表2。

表2 毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表接上頁

2.9 樣品測定

取3個批次的北芪五加片，分別按2.2.2項(xiàng)下方法每個批次平行制備3份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件檢測毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積，計算測定成分的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 北芪五加片制備方法的優(yōu)化

試驗(yàn)中首先考察提取溶劑對毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶提取率及色譜峰峰形的影響。在超聲提取60 min的同一條件下，選取甲醇[1,3-4,6]、50 %甲醇[1-2,5,7]、乙醇、50 %乙醇為提取溶劑，結(jié)果以50 %甲醇為提取溶劑時，毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶綜合提取率最佳，同時待測成分色譜峰峰形較好；采用50 %甲醇為提取溶劑，對比了超聲提取[1-7]、加熱回流提取[8]、微波輔助提取的提取效率，結(jié)果3種提取方式下待測定成分毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶綜合提取率差異不大，考慮到供試品溶液制備的便捷性和試驗(yàn)操作的可普及性，選取超聲提取作為北芪五加片供試品溶液的制備方式；同時對超聲時間進(jìn)行了進(jìn)一步摸索，最終確定采用50 %甲醇超聲提取30 min用于制備北芪五加片供試品溶液。

表3 含量測定結(jié)果（n=3，mg/g）

3.2 流動相的優(yōu)化

在確定流動相時，首先考察了乙腈-水[4,8]、甲醇-水[2]流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水為流動相時待測定成分芒柄花苷、芒柄花素達(dá)不到基線分離，以乙腈-水為流動相時待測成分毛蕊異黃酮、紫丁香苷、異嗪皮啶峰存在拖尾；對此作者又考察乙腈-0.1 %甲酸溶液[1,3]、乙腈-0.1 %磷酸溶液[1,5-6]流動相系統(tǒng)，最終確定采用乙腈-0.1 %磷酸溶液為流動相，按2.1項(xiàng)下流動相比例對待測成分毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶進(jìn)行梯度洗脫，在該流動相條件下，所記錄色譜圖基線平穩(wěn)，待測成分毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶峰形對稱，分離度符合規(guī)定要求。

3.3 檢測波長的選擇

在檢測波長的選擇過程中，分別取待測成分對照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果毛蕊異黃酮葡糖苷在219，254 nm和290 nm處有較大吸收，毛蕊異黃酮在218，253 nm和291 nm處有較大吸收，芒柄花苷在255 nm和301 nm處有較大吸收、芒柄花素在254 nm和300 nm處有較大吸收，紫丁香苷在220 nm和264 nm處有較大吸收，刺五加苷E在221 nm和272 nm處有較大吸收，異秦皮啶在223 nm和341 nm處有較大吸收，同時參考相關(guān)文獻(xiàn)[1,3-5]，最終確定采用波長切換法，毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的檢測波長為254 nm，紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的檢測波長為220 nm，在此波長條件下，待測成分色譜峰分離效果較好，峰形較佳，雜質(zhì)峰干擾少，靈敏度較高。

本研究首次建立一種HPLC波長切換法同時測定北芪五加片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的含量，方法簡便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可實(shí)現(xiàn)對北芪五加片多種有效成分的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了可靠的數(shù)據(jù)依據(jù)。