吳超權(quán)，周 智，韋奇志，方珍文，陳長(zhǎng)艷，楊橋櫻，秦秀娟

（廣西食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021）

α-亞麻酸是人體必需的不飽和脂肪酸，需從日常飲食中獲取，α-亞麻酸在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂酗@著生理活性的EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸），具有降血脂、降膽固醇、抗血栓形成等作用[1]。歐美和日本等國(guó)家已經(jīng)立法，將α-亞麻酸作為藥物或食品添加劑，用來(lái)預(yù)防心血管疾病、癌癥、老年癡呆、視力低下等病癥。α-亞麻酸乙酯與α-亞麻酸有同樣的生理功能，且α-亞麻酸乙酯的化學(xué)穩(wěn)定性更好，應(yīng)用于保健食品的開(kāi)發(fā)前景廣闊。但其毒理學(xué)和安全性評(píng)價(jià)方面的研究不足，國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。因此，本文對(duì)α-亞麻酸乙酯進(jìn)行急性毒性和遺傳毒性研究，為α-亞麻酸乙酯作為保健食品原料進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供可靠的毒理學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HH-S恒溫水浴（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠(chǎng)）；BD240生化培養(yǎng)箱（德國(guó)賓德公司）；CHA-S氣浴恒溫振蕩器（常州國(guó)華）；KS130C振蕩器（艾卡儀器設(shè)備公司）；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀）；50I熒光顯微鏡（尼康）；BX63全自動(dòng)智能型數(shù)字顯微鏡（奧林巴斯）；CX31顯微鏡（奧林巴斯）。

1.2 試藥

α-亞麻酸乙酯（75 %）（河北欣奇典，批號(hào)：20150407），置陰涼干燥處儲(chǔ)藏，每次開(kāi)封后充入氮?dú)饷芊獗４?；玉米胚芽油[嘉里糧油（防城港），批號(hào)：20150105]；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱，批號(hào)：0570201）；頂層瓊脂培養(yǎng)基（Solarbio，批號(hào)：20150119）；Vogel-Bonner（V-B）培養(yǎng)基E（自配）；L-組氨酸（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：20150213）；D-生物素（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：20150223）；葡萄糖（天津大茂，批號(hào)：20150201）；Aroclor 1254誘導(dǎo)雄性SD大鼠肝臟微粒體酶S9及輔助因子（凍干型S9混合液，Moltox公司，批號(hào)：3726）；胎牛血清[Gibco by Life Technological Corporation (USA)]；吉姆薩染液（北京索萊寶公司）；環(huán)磷酰胺（Roche）；甲醇（國(guó)藥集團(tuán)）；1 %伊紅染液（Roche）；純化水（自制）。

1.3 菌株

鼠傷寒沙門(mén)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)用菌株TA97a，TA98，TA100，TA102（Moltox公司，中國(guó)代理商：上海寶錄），-80 ℃儲(chǔ)藏。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠，SPF級(jí)，雌雄兼用，由廣西食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK桂2014-0001，動(dòng)物飼養(yǎng)于本所屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（使用許可證號(hào)SYXK 桂2014-0002）；溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度58 %～70 %；飼喂小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK京2014-0010）及滅菌生活用水。

2 方法[2]

2.1 急性毒性試驗(yàn)

KM小鼠20只，雌雄各半，體重18.1～20.8 g，按性別分籠群養(yǎng)；禁食不禁水16 h后，按20 ml/kg以樣品直接灌胃1次。觀察灌胃后14 d內(nèi)小鼠的全身反應(yīng)及死亡情況，存活的動(dòng)物按性別計(jì)算增重值及增重率。

2.2 Ames試驗(yàn)

取經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門(mén)菌組氨酸缺陷型TA97a，TA98，TA100，TA102。試驗(yàn)時(shí)以溶媒將樣品α-亞麻酸乙酯（75 %）分別配制成50，10，2，0.4，0.08 mg/ml的供試液，供試液無(wú)懸浮和沉淀物。試驗(yàn)菌株37 ℃增菌培養(yǎng)10 h，將頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0 ml分裝于試管，每管依次加入試驗(yàn)菌液0.1 ml、樣品溶液0.1 ml、S9混合液0.5 ml（需代謝活化時(shí)），混勻后迅速傾入底層瓊脂平板，使形成5000，1000，200，40，8 μg/皿的供試物劑量，倒置于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育48 h。每試樣檢查皿加或不加S9混合液均做3個(gè)平行皿，記錄每組回變菌落數(shù)，重復(fù)1次。同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照、自發(fā)對(duì)照、陽(yáng)性誘變劑對(duì)照組。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：記錄每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果判定：受試物組回變菌落數(shù)增加一倍以上，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，或某一測(cè)試點(diǎn)有可重復(fù)的陽(yáng)性結(jié)果，即可認(rèn)為受試物誘變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性。陽(yáng)性誘變劑使用種類(lèi)和劑量見(jiàn)表1。

表1 陽(yáng)性誘變劑對(duì)照物及劑量

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

以玉米胚芽油將樣品α-亞麻酸乙酯（75 %）分別配制成0.5，0.25，0.125 g/ml，取KM小鼠60只，雌雄各半，體重26～29 g，分籠群養(yǎng)，按體重、性別隨機(jī)分成6組，分別為α-亞麻酸乙酯10，5，2.5 g/kg 3個(gè)劑量組、環(huán)磷酰胺40 mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組、玉米胚芽油溶媒對(duì)照組和純化水陰性對(duì)照組。各組動(dòng)物分別給予受試物2次，間隔24 h，灌胃量均為20 ml/kg，灌胃前16 h動(dòng)物禁食不禁水。第2次給藥后6 h，頸椎脫臼處死小鼠，隨即剖取股骨，用胎牛血清沖洗骨髓腔收集骨髓細(xì)胞，沖洗液經(jīng)離心制成濃度適中的細(xì)胞懸液，涂片，甲醇固定7 min，吉姆薩染液染色15 min，超純水沖洗、晾干；鏡下觀察嗜多染紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率用千分率表示；每只動(dòng)物計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，同時(shí)記錄成熟紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞（PCE/NCE）比值。采用雙側(cè)t檢驗(yàn)分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)果判定：樣品組與溶媒對(duì)照組相比，微核率有明顯劑量反應(yīng)關(guān)系且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，可確認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。若統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，則須進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果能重復(fù)者可確定為陽(yáng)性。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

以溶媒將樣品α-亞麻酸乙酯（75 %）分別配制成0.5，0.25，0.125 g/ml，取雄性小鼠30只，體重27.4～33.1 g，分籠群養(yǎng)，隨機(jī)均分為6組，每組5只，分別為α-亞麻酸乙酯10，5，2.5 g/kg 3個(gè)劑量組、環(huán)磷酰胺40 mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組、玉米胚芽油溶媒對(duì)照組和純化水陰性對(duì)照組。采用灌胃方式每天給予受試物1次，20 ml/kg，連續(xù)5 d。于首次給予受試物后的第35天，頸椎脫臼處死小鼠，隨即剖取兩側(cè)附睪，放入有適量生理鹽水（約2 ml）的平皿中。用眼科剪將附睪縱向剪1～2刀，靜止3～5 min，輕輕搖動(dòng)，用4層擦鏡紙過(guò)濾，吸濾液涂片?？諝庵懈稍锖螅眉状脊潭?5 min，充分干燥，置1 %伊紅染液中染色1 h，用水輕輕沖洗，晾干。在低倍鏡下尋找背景清晰、精子重疊較少的部位閱片，用高倍鏡順序檢查精子形態(tài)。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)結(jié)構(gòu)完整的精子1000個(gè)，觀察精子的畸形情況，畸形類(lèi)型可分為無(wú)鉤、香蕉形、胖頭、無(wú)定型、尾折疊、雙頭、雙尾等。采用Wilcoson秩和檢驗(yàn)分析處理數(shù)據(jù)。結(jié)果判定：樣品組與溶媒對(duì)照組比較，精子畸形率為溶媒對(duì)照組的倍量或差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有劑量反應(yīng)關(guān)系，判定為精子畸形陽(yáng)性。

3 結(jié)果

3.1 急性毒性試驗(yàn)

灌胃后至14 d內(nèi)小鼠的外觀、活動(dòng)、進(jìn)食、排泄等均未見(jiàn)明顯異常；無(wú)死亡現(xiàn)象；小鼠體重增長(zhǎng)情況正常，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，小鼠一次性灌胃給予α-亞麻酸乙酯（75 %），未見(jiàn)明顯的急性毒性反應(yīng)，最大耐受量大于20 ml/kg BW（17.62 g/kg BW）。按急性經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，樣品屬于無(wú)毒級(jí)（LD50＞15 000 mg/kg為無(wú)毒級(jí)）。

表2 α-亞麻酸乙酯（75 %）小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)體重增長(zhǎng)情況

3.2 Ames試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表3。樣品劑量為5000，1000，200，40，8 μg/皿對(duì)上述4個(gè)試驗(yàn)菌株加S9或不加S9，回變菌落數(shù)與溶媒對(duì)照相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），亦無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，未超出自發(fā)回變數(shù)的2倍，表明樣品在加S9或不加S9的條件下，對(duì)4個(gè)菌株的誘變結(jié)果呈陰性。提示樣品對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌無(wú)明顯致突變性。

3.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表4、表5。與溶媒對(duì)照組比較，α-亞麻酸乙酯3個(gè)劑量組微核率基本一致（P＞0.05）；各劑量組的骨髓PCE/NCE比值均在正常范圍，均不低于溶媒對(duì)照組的20 %，α-亞麻酸乙酯3個(gè)劑量組骨髓PCE/NCE比值與溶媒對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；表明樣品的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，樣品對(duì)小鼠骨髓PCE/NCE比值無(wú)明顯影響。按性別分別統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果相同。

表3 α-亞麻酸乙酯（75 %）Ames試驗(yàn)的菌株回變結(jié)果（n=6）

表4 α-亞麻酸乙酯（75 %）對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響

表5 α-亞麻酸乙酯（75 %）對(duì)小鼠骨髓PCE/NCE比值的影響

表6 α-亞麻酸乙酯（75 %）小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

3.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)，α-亞麻酸乙酯3個(gè)劑量組的小鼠精子畸形率與溶媒對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明樣品的小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性，提示樣品對(duì)小鼠精子無(wú)明顯致畸作用。具體精子畸形類(lèi)型數(shù)量及比值見(jiàn)表7。

4 討論

近年α-亞麻酸乙酯逐漸引起國(guó)際社會(huì)的關(guān)注，因其具有降血脂、保肝護(hù)肝、預(yù)防心血管疾病、抗血栓形成、預(yù)防老年癡呆、預(yù)防肝病、促進(jìn)小兒大腦發(fā)育等功能，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景[3-7]。但其安全性評(píng)價(jià)鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果提示：α-亞麻酸乙酯（75 %）的急性毒性最大耐受量大于17.62 g/kg BW；各劑量組對(duì)4種組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門(mén)菌株在存在或不存在S9代謝活化系統(tǒng)兩種條件下，回變菌落數(shù)與溶媒對(duì)照組相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，亦無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，未超出自發(fā)回變數(shù)的2倍，表明樣品在加S9或不加S9的條件下，對(duì)4個(gè)菌株的誘變結(jié)果呈陰性；α-亞麻酸乙酯（75 %）各劑量組的微核率與溶媒對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明其小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性；α-亞麻酸乙酯（75 %）各劑量組的精子畸形率與溶媒對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明其小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性。本研究表明α-亞麻酸乙酯（75 %）屬于無(wú)毒級(jí)，鼠傷寒沙門(mén)菌回復(fù)突變、骨髓細(xì)胞微核、小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)3項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，未見(jiàn)遺傳毒性作用。

表7 α-亞麻酸乙酯（75 %）小鼠精子畸形試驗(yàn)畸形類(lèi)型及比值