余劍吟，廖有武，顧正清，朱 源

（江蘇大學 藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

辣椒堿（capsaicin）是辣椒中含有的一種辛辣的生物堿成分[1]，來源于茄科植物辣椒的成熟果實，是常用的食品添加劑中的活性成分。在臨床上主要用于治療風濕性關節(jié)炎等神經(jīng)性疼痛，可作為一種作用較溫和、副作用較少的超長效止痛劑使用[2]。近年，科學家發(fā)現(xiàn)辣椒堿具有抗炎[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、減肥[6]等多種活性。但辣椒堿的刺激性、難溶性和吸收差成為其口服制劑開發(fā)的瓶頸。已有報道表明，納米載體如脂質體[7]、微乳[8]、納米膠束[9]的包覆作用可提高辣椒堿的口服吸收并降低其胃黏膜刺激性。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）由鈣磷灰石自然礦物化形成，廣泛應用于骨組織再生、修復、牙科整形及相關治療[10]，近年亦廣泛用作基因傳遞的非病毒載體[11]及抗腫瘤藥、抗生素、抗炎藥等藥物傳遞的緩控釋載體[12]?？诜﨟A作為蛋白質、多肽類藥物的載體也有相關報道[13]。作為一種常見的無機材料，HA具有較好的降低辣椒堿刺激性的作用，但單一組分的HA存在脆性大、降解速度不易控制等缺點[14]。本文在制備納米HA的基礎上，將二氧化硅（SiO2）引入復合載體體系，通過SiO2包覆于載藥HA表面實現(xiàn)辣椒堿的控制釋放，同時考察該復合載體對于辣椒堿體內(nèi)外釋藥特性的影響，并考察SiO2用量對復合納米粒體系體內(nèi)外性質的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA124S-CW電子天平（北京賽多利斯）；JY92-II型超聲波細胞粉粹機（寧波新芝）；低溫冷凍高速離心機（德國Hereaus公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒）；HJ-6A六聯(lián)磁力加熱攪拌器（江蘇金壇佳美儀器廠）；THZ-82水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇中大儀器廠）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；Avatar 370傅立葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet公司）；JSM-7001F掃描電鏡（日本電子公司）；D8 ADVANCEX-射線衍射儀（德國Bruker公司）；島津LC-20ATV高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試藥

辣椒堿原料藥（上海遠慕，批號：180821，含量＞95 %）；辣椒堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110839-201806，含量99 %）；硝酸鈣，磷酸，三乙醇胺，正硅酸四乙酯，無水乙醇，氨水，乙酸乙酯，環(huán)己烷等試劑（分析純，國藥集團）；甲醇，乙腈（色譜純，國藥集團）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 負載辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒的制備

2.1.1 納米HA的制備 稱取適量硝酸鈣[Ca(NO3)2·4H2O]置燒杯中，加水20 ml，超聲溶解，將超聲波探頭置于硝酸鈣水溶液中，超聲處理（功率：600 W，20 s/次，間隔3 s）20次，逐滴加入磷酸，使Ca:P（摩爾比）=1.67，繼續(xù)逐滴加入氨水10 ml，超聲處理20次，得乳白色混懸液，10 000 r/min離心10 min，所得沉淀用無水乙醇和水各洗滌3次，轉移至蒸發(fā)皿中，加入少量水分散，置于真空干燥箱中（50 ℃，-100 kPa真空度）干燥，得粉末狀納米HA。

2.1.2 負載辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒的制備 按2.1.1 項下工藝操作，加入適量磷酸后，逐滴加入溶解有2 g辣椒堿的無水乙醇-氨水（3:1）溶液40 ml，超聲處理20次，得乳白色混懸液。取混懸液15 ml，置100 ml三頸瓶中，65 ℃水浴，磁力攪拌下逐滴加入三乙醇胺0.45 ml，繼續(xù)滴加適量正硅酸四乙酯（TEOS），5 h后，10 000 r/min離心10 min，沉淀用水洗滌3次，轉移至蒸發(fā)皿中，加入少量水分散，于真空干燥箱（50 ℃，-100 kPa真空度）干燥，得負載辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒。為考察TEOS加入量對負載辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒成形、釋藥行為及藥動學特征的影響，制備時TEOS用量分別為3，7.5，15 ml，制得3種載辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒，分別標記為處方1、處方2、處方3。

2.2 載辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒性質評價

2.2.1 色譜條件 負載藥物的復合納米粒中藥物含量采用高效液相色譜（HPLC）測定，紫外檢測器檢測，具體色譜條件如下：色譜柱為Symmetry?C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（含0.1 % 磷酸）（70:30），流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為280 nm。

2.2.2 標準曲線的建立 取適量的辣椒堿對照品，精密稱定，用甲醇溶解后配制濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0， 25.0，50.0 μg/ml的辣椒堿對照品溶液。精密量取對照品溶液20 μl，注入效液相色譜儀中，記錄樣品峰面積。以辣椒堿峰面積為縱坐標（Y），辣椒堿對照品溶液濃度為橫坐標（X），最小二乘法進行線性回歸，得標準曲線為Y=13 922X+467.76，線性范圍0.5～50 μg/ml，表明辣椒堿濃度與其HPLC峰面積有良好的線性關系（r=0.9999）。

2.2.3 方法學驗證

2.2.3.1 精密度試驗 取辣椒堿對照品適量， 精密稱定，用甲醇溶解后配制濃度分別為1.0，25.0，50.0 μg/ml的辣椒堿對照品溶液。精密量取對照品溶液20 μl，注入效液相色譜儀。高、中、低3個濃度對照品溶液含量RSD分別為2.13 %，1.36 %，2.57 %（n=5），表明該方法精密度較好。

2.2.3.2 準確度試驗 取辣椒堿對照品適量， 精密稱定，用甲醇溶解后配制濃度分別為1.0，25.0，50.0 μg/ml的辣椒堿對照品溶液。精密量取對照品溶液20 μl，注入效液相色譜儀。測得高、中、低3個濃度對照品溶液的平均回收率分別為99.5 %±1.26 %，103.1 %± 1.92 %和99.1 %±1.44 %（n=5），RSD分別為1.27 %，1.86 %和1.45 %，表明該方法準確度較高。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取辣椒堿對照品適量， 精密稱定，用甲醇溶解后配制濃度分別為1.0，25.0，50.0 μg/ml的辣椒堿對照品溶液。分別在0，2，4，8，12，24，36，48，72 h精密量取對照品溶液20 μl，注入效液相色譜儀。高、中、低3個濃度對照品溶液在72 h內(nèi)含量RSD分別為2.53 %，0.91 %，1.20 %，表明該方法穩(wěn)定性較好。

2.2.4 載藥量測定 取載辣椒堿HA/SiO2復合納米粒（處方1、處方2、處方3）各約50 mg，精密稱定，置于離心管中，分別加入甲醇3 ml、乙醇3 ml，4000 r/min超聲處理20 min，取上清，沉淀繼續(xù)重復以上操作2次，合并上清，按2.2.1項下色譜條件操作，將峰面積代入標準曲線方程，計算樣品的載藥量，載藥量=納米粒中藥物量/納米粒重量，結果見表1。由表1可見，隨著TEOS加入量的增加，復合納米粒的載藥量降低，當TEOS用量達15 ml時（處方3），載藥量極大降低。以乙醇為溶劑測得的載藥量高于甲醇，其原因可能是辣椒堿在乙醇中溶解度較高。HA/SiO2復合納米粒載藥量最高可達約20 mg/100 mg。

表1 復合納米粒載藥量測定結果

2.2.5 載藥復合納米粒形態(tài)學考察 取少量載藥HA/SiO2復合納米粒，用導電膠固定于樣品座上，噴金，掃描電鏡（SEM）觀察其形態(tài)，結果見圖1。由圖1可見，載藥復合納米粒電鏡形態(tài)為類球形分布，當TEOS加入量為3 ml時，載藥復合納米粒粒徑約為200～400 nm，隨著TEOS加入量增加，載藥復合納米粒粒徑逐漸增大，達約1 μm，并有黏聚的趨勢。

圖1 載藥HA/SiO2復合納米粒SEM照片

2.2.6 HA/SiO2復合納米粒X-射線衍射（XRD）分析 取HA納米粒和3種不同處方的HA/SiO2復合納米粒進行XRD分析。工作條件：CuKα靶，電壓40 kV，電流40 mA；測量范圍：15～60°；掃描速度：4°/min。結果見圖2。與HA納米粒相比，HA/SiO2復合納米粒XRD圖譜中在20～25°出現(xiàn)較為寬泛的SiO2特征衍射峰，隨TEOS用量增加，在25.9°和31.8°等處的HA特征結晶峰顯著減小并逐漸消失，說明SiO2對HA的包裹增加，這與SEM觀察到的復合納米粒粒徑的增加是一致的。

圖2 HA/SiO2復合納米粒XRD圖譜

2.2.7 HA/SiO2復合納米粒紅外（IR）分析 取HA納米粒和3種不同處方的HA/SiO2復合納米粒，采用傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）對其結構進行表征，結果見如圖3。HA和SiO2在某些波段的特征峰是重疊的，如1093 cm-1、965 cm-1處有HA中P-O的伸縮振動峰，而在1110 cm-1處有SiO2中Si-O-Si 反對稱伸縮振動峰；965 cm-1處有HA中P-O的伸縮振動峰，而SiO2的 FT-IR光譜在970 cm-1處有Si-OH的彎曲振動吸收峰。另有一些特征峰是二者特有的，如566 cm-1、604 cm-1兩處HA中P-O的彎曲振動峰在HA/SiO2復合納米粒圖譜中消失；而HA/SiO2復合納米粒圖譜中出現(xiàn)了800 cm-1和470 cm-1左右的Si-O鍵對稱伸縮振動峰，3445 cm-1處較弱的寬峰可能為結構水中-OH的反對稱伸縮振動峰。同時，1038 cm-1處HA中的P-O的伸縮振動峰在HA/SiO2復合納米粒圖譜中消失，HA/SiO2復合納米粒圖譜中970 cm-1處的吸收峰應為Si-OH的彎曲振動吸收峰。結果顯示，3種處方的HA/SiO2復合納米粒FT-IR圖譜中，HA的特征峰均消失，SiO2的特征峰明顯，且隨著復合比例中TEOS的用量增大其峰強度也有所增加。

圖3 HA/SiO2復合納米粒FT-IR圖譜

2.3 HA/SiO2復合納米粒體外釋藥研究

取辣椒堿原料藥5 mg及含辣椒堿5 mg的3種HA/SiO2復合納米粒，精密稱定，封裝于透析袋（截留分子量3500）中，分別加入相應的釋藥介質1 ml，兩端扎緊后置于錐形瓶中，分別加入pH 1.2鹽酸溶液和pH 7.4磷酸鹽緩沖液100 ml作為釋藥介質，37±1 ℃水浴振蕩，振蕩頻率為100 r/min。分別于0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，60，72 h取樣1 ml，同時補充相應釋藥介質1 ml。按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算樣品累積釋藥率。兩種介質中辣椒堿原料藥和3種載有辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒的體外釋藥曲線見圖4。

由圖4可見，TEOS的用量會影響HA/SiO2復合納米粒中藥物的釋放速率，隨著TEOS用量增多，辣椒堿累積釋藥率降低。處方1累積釋藥率在兩種介質中均最高。

圖4 不同介質中原料藥及復合納米粒的體外釋藥曲線

2.4 載辣椒堿HA/SiO2復合納米粒大鼠口服藥動學研究

2.4.1 血漿樣品預處理方法 取大鼠血漿200 μl，置離心管中，加內(nèi)標溶液（10 μg/ml α-萘酚甲醇溶液）50 μl和乙腈500 μl，渦旋1 min，加乙酸乙酯和環(huán)己烷各1.5 ml，渦旋3 min，4000 r/min離心 10 min，取上清，置干凈離心管中，37 ℃水浴氮氣揮干溶劑，用甲醇100 μl復溶后渦旋1 min，4000 r/min離心5 min，吸取上清 20 μl，進行HPLC分析。

2.4.2 血漿樣品標準曲線的建立 稱取辣椒堿對照品適量，甲醇溶解，分別配制濃度為0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 μg/ml的辣椒堿對照品溶液。取空白血漿200 μl加入離心管，分別加入50 μl上述辣椒堿對照品溶液，配制辣椒堿濃度為125，250，500，1000，2000，4000 ng/ml的大鼠血漿標準溶液，按2.4.1項下方法處理后取20 μl，高效液相色譜儀分析，色譜柱為Symmetry?C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為乙腈:水（含0.05 % 磷酸）=45:55，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm。以辣椒堿峰面積（As）對內(nèi)標峰面積（Ai）的比值為縱坐標（Y），辣椒堿血漿標準溶液的濃度為橫坐標（X），最小二乘法進行線性回歸，得血漿樣品標準曲線為Y=0.0001X-0.0031，線性范圍125～4000 ng/ml（n=6，r=0.9989）。

2.4.3 動物實驗方法 健康雄性SD大鼠18只[180±20 g，SPF,江蘇大學動物中心提供，動物使用許可證號：SCXK（蘇）2018-0012]，隨機分為3組，每組6只，給藥前禁食12 h，自由飲水。按90 mg/kg的劑量分別口服灌胃辣椒堿原料藥CMC-Na混懸液和2種載辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒（處方1、處方2）的水混懸液，于給藥后0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，48，72 h，大鼠眼球后叢靜脈采血約0.4 ml，置肝素抗凝管中，4000 r/min 離心10 min，分離血漿，-20 ℃下冷凍存儲直至分析，解凍分析前離心處理（10 000 r/min，10 min）。

2.4.4 參數(shù)擬合及結果 按2.4.2項下色譜條件測定血漿樣品中辣椒堿濃度，采用BAPP2.3生物利用度研究數(shù)據(jù)處理通用程序（中國藥科大學藥代中心提供）進行參數(shù)擬合，按非隔室模型法計算相關藥動學參數(shù)。辣椒堿原料藥、處方1和處方2的載辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒大鼠體內(nèi)藥時曲線見圖5。主要藥動學參數(shù)見表2。

與原料藥相比，載有辣椒堿的HA/SiO2復合納米粒的t1/2、MRT顯著延長，其中t1/2為原料藥的5.2～6.2倍，MRT為原料藥的4.7～5.7倍，達峰時間顯著延長，達到6～12 h，且最大血藥濃度提高至原料藥的1.6～2.4倍；72 h內(nèi)體內(nèi)藥時曲線下面積AUC0-72h顯著提高，與原料藥相比，處方1與處方2的相對生物利用度分別提高至1546.1 %和921.6 %。結果顯示，HA/SiO2復合納米粒能顯著提高辣椒堿大鼠體內(nèi)生物利用度，且具有一定的緩釋作用，隨著SiO2包覆的增加，生物利用度提高程度有所下降。處方1對于辣椒堿生物利用度的提高更為明顯。

圖5 辣椒堿原料藥及載藥HA/SiO2復合納米粒大鼠口服給藥體內(nèi)藥時曲線

表2 辣椒堿原料藥及載藥HA/SiO2復合納米粒大鼠口服給藥藥動參數(shù)

3 討論

本文研究了TEOS用量對所制備的載辣椒堿HA/SiO2復合納米體系的影響，相比于辣椒堿原料藥，復合納米粒中藥物體外釋藥與體內(nèi)生物利用度均有所提高，但隨著TEOS用量的增加，即SiO2包覆程度的增加，納米粒的粒徑增加，載藥量下降，體外累積釋藥率下降，體內(nèi)增加口服生物利用度的水平也有所下降。因此TEOS用量的優(yōu)化對HA/SiO2載藥復合納米粒的增溶、緩釋、提高生物利用度作用尤為重要。

除了TEOS用量，HA的納米化對實現(xiàn)難溶性活性成分辣椒堿的增溶促吸也很重要。本文在構建復合納米粒體系時，首先考察了制備工藝與參數(shù)、前驅體溶液種類與濃度、干燥方式等多種因素，獲得了粒徑為50 nm左右的納米HA，為復合載體的構建奠定了基礎。

難溶性活性成分的增溶緩釋技術與高效傳遞載體研究是解決其臨床應用的重要方向，無機納米載體因其穩(wěn)定性和可控釋藥成為該方向的熱點之一。但關于其體內(nèi)生物降解及其復合體系的協(xié)同作用，仍需深入研究，以真正發(fā)揮其高效、穩(wěn)效作用并加速產(chǎn)業(yè)化進程。