王蔚芳, 向 玲, 王 琳, 黃 濱, 李會濤

適宜濃度的維生素E促進半滑舌鰨生長激素基因的表達

王蔚芳1, 向 玲2, 王 琳1, 黃 濱1, 李會濤3

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 山東 青島 266003; 3. 山東百福生物科技有限公司, 山東 濟寧 273200)

本實驗旨在探究維生素E對半滑舌鰨垂體組織中生長激素基因表達的影響。作者在每千克等氮等能的基礎(chǔ)飼料中分別添加0、400和1 600 mg的DL-α-生育酚乙酸酯 (維生素E)投喂半滑舌鰨()成魚(464±2.6) g, 進行為期8周的養(yǎng)殖實驗; 另外, 在L-15培養(yǎng)基中添加0、18和54 μmol/L的維生素E, 對半滑舌鰨成魚(464±2.6) g的垂體細胞進行為期3 d的體外原代培養(yǎng)實驗。分別取垂體組織和原代細胞, 通過熒光實時定量PCR分析其mRNA的相對表達量。實驗結(jié)果表明: 垂體組織中mRNA的相對表達量隨著飼料中維生素E含量的增加而呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢, 在400 mg/kg組時顯著高于其他各組(<0.05); 隨著細胞培養(yǎng)液中維生素E濃度的升高,mRNA的相對表達量顯著增加(<0.05)。由此可見, 適宜濃度的維生素E能夠促進半滑舌鰨垂體組織中生長激素基因的表達。

半滑舌鰨(); 維生素E; 生長激素基因; 養(yǎng)殖; 垂體原代細胞

生長激素是一種由垂體前葉合成和分泌的多肽類激素, 能夠不通過靶腺而刺激生長, 動員脂肪分解, 促進蛋白質(zhì)的合成, 抑制葡萄糖的氧化, 提高對鉀、鈣、磷、硫等元素的利用[1]。相關(guān)研究表明生長激素能夠促進魚類的骨骼生長與肌肉蛋白質(zhì)的合成[2]。

維生素E又名生育酚, 最初發(fā)現(xiàn)時被認為是維持動物正常生殖所必需的一種脂溶性物質(zhì)[3]。維生素E在魚類生長、免疫功能等方面的研究已逐漸成為熱點[4, 5]。攝食維生素E含量為150 mg/kg飼料的點帶石斑魚(), 其增質(zhì)量率顯著提高[6]。用添加維生素E的配合飼料投喂鯔魚()幼苗, 能夠有效地促進其生長[7]。關(guān)于維生素E如何調(diào)控魚類的生長, 是否與生長激素有關(guān), 至今未見相關(guān)研究報道, 因此值得進一步探討。盡管維生素E是重要的抗氧化劑[8, 9], 但它還被證明可作為基因的調(diào)節(jié)因子[10]。新近水生動物研究表明適宜濃度的維生素E能夠促進大菱鲆促性腺激素基因的表達[11]。在陸生動物研究中指出, 飼料中添加15 IU/kg維生素E時, 蛋雛鴨血清生長激素含量顯著高于對照組[12]; 此外, 青大麥葉提取物(已鑒定為α-生育酚琥珀酸酯)可以促進體外培養(yǎng)的大鼠垂體前葉細胞分泌GH[13]。因此作者假設(shè)維生素E通過基因調(diào)節(jié)的功能影響生長激素基因的表達。

半滑舌鰨()屬鰈形目(Pleuronectiformes)、鰨亞目(Soleoidei)、舌鰨科(Cynoglossidae)、舌鰨屬(), 為中國的本地種, 主要分布在中國的黃渤海域[14]。其體型大、生長快、味道鮮美、高蛋白、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟價值高, 在中國的養(yǎng)殖規(guī)模也逐漸擴大[15]。半滑舌鰨與大菱鲆、牙鲆()同為中國最具發(fā)展?jié)摿Φ墓S化養(yǎng)殖和土池養(yǎng)殖的海水品種[16]。目前已經(jīng)開展了關(guān)于半滑舌鰨生長激素基因在大腸桿菌中原核表達的研究[17], 以及半滑舌鰨生長激素基因的多態(tài)性與生長激素及生長性狀相關(guān)性的研究報道[2]; 此外, 在飼料中添加1 200 mg/kg的維生素E可以有效提升半滑舌鰨親魚的繁殖性能[18], 在飼料中添加1 084.58 mg/kg的維生素E飼喂半滑舌鰨幼魚84 d, 經(jīng)遲緩愛德華氏菌攻毒后, 能有效降低其紅細胞的過氧化損傷[19]。而關(guān)于半滑舌鰨維生素E和生長激素關(guān)系的研究未見報道。因此, 參照半滑舌鰨垂體細胞體外原代培養(yǎng)方法[20],借助養(yǎng)殖和細胞培養(yǎng)實驗, 探究不同含量的維生素E與垂體組織中(養(yǎng)殖實驗)和垂體原代培養(yǎng)細胞中(細胞實驗)mRNA相對表達量之間的關(guān)系, 初步討論維生素E促生長的分子機制, 并為半滑舌鰨人工配合飼料的研制提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗用120條體質(zhì)量為(464±2.6)g健康的1齡半滑舌鰨雌性成魚, 購自萊州明波水產(chǎn)有限公司(山東, 萊州), 為當(dāng)年孵化和培育的同一批魚。

1.2 飼料制備與養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖實驗的飼料中維生素E添加量是參照肖登元等[18]在半滑舌鰨親魚飼料中的添加量(0、200和1 200 mg/kg)報道以及作者的預(yù)實驗結(jié)果進行設(shè)置。本實驗設(shè)3個組, 每組設(shè)3個重復(fù), 每組飼料中維生素E的添加量分別是0、400和1 600 mg/kg。維生素E以DL-α-生育酚乙酸酯(Sigma)的形式按照計算比例逐級混勻到次粉中。在基礎(chǔ)飼料中, 以魚粉、酪蛋白為主要蛋白源, 以魚油、豆油為主要脂肪源, 飼料配方及營養(yǎng)組成如表1。固體原料均過60目篩, 所有原料充分混合均勻后, 通過機械擠壓形成顆粒飼料(4 mm), 并在60℃的烘箱中干燥至濕度為10%, 用密封塑料袋保存在–20℃的冰柜中以供使用[18]。

養(yǎng)殖實驗在萊州明波水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖場進行。正式實驗開始前對所有的魚投喂7 d的基礎(chǔ)飼料(表1), 以適應(yīng)實驗條件。在測量魚體長和稱重后隨機分成九組到9個15 m3的圓形聚乙烯養(yǎng)殖桶中(直徑: 150 cm, 高度: 60 cm)進行流水養(yǎng)殖實驗, 每個桶里放養(yǎng)半滑舌鰨10尾, 養(yǎng)殖用水為過濾海水, 流速是50 L/min。每3個養(yǎng)殖桶隨機分成一組投喂相同的飼料, 每天早晚2次投喂, 投喂率為魚體質(zhì)量的2%, 進行為期8周的養(yǎng)殖實驗。實驗期間水溫范圍為24℃~27℃; 鹽度30~31, pH為7.8~8.1。溶解氧含量大于5.65 mg/L。每天早上清除糞便和多余的飼料以保持良好的水質(zhì)條件。

表1 實驗基礎(chǔ)飼料配方組成及營養(yǎng)組成

注:1維生素混合物(mg/kg或g/kg 飼料): 硫胺素, 25 mg; 核黃素, 45 mg; 鹽酸吡哆醇, 20mg; 維生素B12, 0.1 mg; 維生素K3, 10 mg; 肌醇, 800 mg; 泛酸, 60 mg; 煙酸, 200 mg; 葉酸, 20 mg; 生物素, 1.20 mg; 維生素A, 32 mg; 維生素D, 5 mg; 維生素E, 0mg; 次粉, 13.67 g;2礦物質(zhì)混合物(mg/kg或g/kg 飼料): 硫酸鎂, 1200 mg; 硫酸銅, 10 mg; 硫酸鋅, 50 mg; 硫酸鐵, 80 mg; 硫酸錳, 45 mg; 氟化鈉, 2 mg; 氯化鈷(1%), 50 mg; 硒代硫酸鈉(1%), 20 mg; 碘酸鈣(1%), 60 mg; 沸石, 13.485 g

1.3 垂體原代細胞培養(yǎng)

1.3.1 細胞培養(yǎng)基配制

先取4.76 g Hepes和9.6 g L-15培養(yǎng)基, 充分混溶于水, 4 h后用NaOH將pH調(diào)至7.4, 抽濾(除菌), 分裝, 即制成L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)中加入胎牛血清(終體積為5%)、青霉素(終濃度為100 U/mL)、鏈霉素(終質(zhì)量濃度為100 μg/mL), 即制成完全培養(yǎng)基, 4℃下保存。所有操作在細胞培養(yǎng)室進行, 有專用櫥柜和冰箱放置物品, 所有解剖工具、器皿等經(jīng)高壓消毒后使用, 實驗過程中用的水、磷酸緩沖液(PBS)等為無菌型商品。

1.3.2 細胞分離

在細胞培養(yǎng)室的準備室內(nèi), 用75%酒精浸泡魚頭后, 無菌條件下取20條成魚垂體組織, 移入超凈工作臺內(nèi)后更換培養(yǎng)液和培養(yǎng)皿, 保證無菌操作。隨后垂體組織剪成1 mm3小塊, 用PBS沖洗, 加入0.25%的胰蛋白酶, 用量約為組織塊的10倍, 放入18℃水浴鍋中45 min。水浴后用2 mL PBS吹打組織塊, 倒入200目/70μm的尼龍網(wǎng)過濾, 取濾液以100/min的速度離心10 min, 除去上清液, 并重懸沉淀, 分裝至六孔板, 1 mL/孔, 置于24℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3.3 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)液中維生素E濃度是參照大菱鲆的相關(guān)研究[11], 細胞實驗分3組, 每組3個重復(fù), 維生素E的添加量分別為0、18和54 μmol/L。將維生素E預(yù)先溶解在無水乙醇中, 然后加入到L-15完全培養(yǎng)基中(無水乙醇的終濃度為0.1%,), 置于24℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d[20]。

1.4 RNA的提取與cDNA文庫的構(gòu)建

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后, 分別在每個養(yǎng)殖桶隨機取3尾魚, 無菌取出垂體組織; 細胞實驗結(jié)束后, 將每孔垂體細胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中, 以100 g/min的速度離心 10 min之后取細胞沉淀。加入1 mL TRIzol (Invitrogen, USA), 按照程序提取總RNA, 使用Nanodrop2000定量并調(diào)整至相同濃度備用, 并取適量RNA進行瓊脂糖凝膠電泳, 檢測RNA完整度, 取質(zhì)量較好的RNA作為cDNA文庫構(gòu)建的模板。

以總RNA模板構(gòu)建cDNA文庫, 選用Prime-Script RT regent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara, Japan)進行反轉(zhuǎn)錄實驗, 操作流程參照該使用說明書進行, 制成的cDNA文庫保存于–20℃冰柜中。

1.5 定量PCR分析

在GeneBank中獲得半滑舌鰨生長激素基因序列(HQ334196), 通過Primer Premier 5軟件進行引物設(shè)計, 由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成, 引物濃度為10 μmol/L。應(yīng)用實時熒光定量PCR(qPCR)分析不同水平維生素E條件處理下生長激素基因的表達情況。以20×cDNA稀釋液為模板, 進行熒光定量PCR擴增, 參照TB GreenII(Tli RNaseH Plus)(Code No. RR820A)試劑盒說明, 擴增體系為20 μL(包括10 μL TB GreenII (Tli RNaseH Plus), 0.8 μL PCR Forward Primer, 0.8 μL PCR Reverse, 1 μL cDNA模板, 7.4 μL RNase-free dH2O)。為減小實驗誤差, 每個樣品均設(shè)置3個重復(fù), 18S核糖體RNA基因作為內(nèi)參引物[21], 與目的基因在相同條件下進行擴增, 引物序列見表2。反應(yīng)按95℃ 10 min, 95℃ 10 s, 58.4℃ 15 s, 72℃ 20 s, 再依次按照95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 95℃ 15 s繪制溶解曲線。實驗中PCR產(chǎn)物通過溶解曲線確定擴增準確性及特異性, 使用2–??Ct法計算mRNA相對表達水平[22]。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

研究中所有實驗均設(shè)置3個平行處理, 所得數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤差表示, 并通過SPSS 19軟件進行one-way ANOVA分析及基于LSD最小顯著差異法的多重比較。當(dāng)值<0.05時, 認為具有顯著差異。

2 結(jié)果

從圖1中可知, 攝食維生素E含量為400 mg/kg飼料的實驗組的魚的表達水平顯著高于其他各組(<0.05); 當(dāng)維生E添加量為1 600 mg/kg時,表達量為1.91%, 顯著高于對照組的1.13%(<0.05)。在細胞實驗中, 隨著維生E濃度的升高,mRNA表達量顯著上升(<0.05), 當(dāng)維生E濃度為54 μmol/L時,mRNA表達量最大(圖2)。

圖1 飼料中維生素E含量對半滑舌鰨垂體組織中生長激素mRNA表達的影響

圖2 維生素E濃度對半滑舌鰨垂體原代細胞中生長激素mRNA表達的影響

3 討論

魚類生長激素是由魚類腦垂體前葉合成分泌的由191個氨基酸組成的單鏈多肽, 為非糖蛋白激素, 且具有明顯的種族特異性[23]。其作為信號分子與遍布組織的生長激素受體結(jié)合, 啟動細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制, 活化一系列信號蛋白, 調(diào)節(jié)基因的表達。生長激素對機體的主要代謝功能表現(xiàn)為促進體組織的生長及細胞體積和數(shù)量的增加[24]。研究表明飼料中添加維生素E對羅非魚()[25]、鯉魚()[26]、云紋石斑魚()[27]的生長有明顯的促進作用。維生素E的促生長作用是否與生長激素有關(guān)？目前關(guān)于維生素E調(diào)控生長激素水平的研究報道有限且集中在陸生動物中, 但其體內(nèi)、體外研究結(jié)果相似, 即維生素E可以提高生長激素水平[12, 13, 28]。在本養(yǎng)殖實驗中, 飼料中添加維生素E顯著上調(diào)半滑舌鰨mRNA的表達量(<0.05), 這提示維生素E有可能參與并促進了mRNA的表達。為了規(guī)避體內(nèi)眾多因素的干擾, 作者開展了體外細胞培養(yǎng)實驗, 進一步驗證維生素E和mRNA的表達的相關(guān)性。在體外垂體原代細胞培養(yǎng)中,mRNA表達量隨著細胞培養(yǎng)液中維生E濃度的升高而顯著增加(<0.05), 證實了維生素E確實參與并促進了mRNA的表達, 也進一步為養(yǎng)殖實驗的結(jié)論提供了依據(jù)。

雖然維生素E參與了mRNA的表達, 但本實驗數(shù)據(jù)顯示維生素E的應(yīng)用劑量會影響mRNA的表達水平。在飼料中添加400 mg/kg維生素E時,mRNA表達量最高, 而進一步添加至1 600 mg/kg時其表達量顯著降低(<0.05), 這也與實驗魚的生長數(shù)據(jù)吻合, 即1 600 mg/kg時半滑舌鰨的增質(zhì)量率顯著低于400 mg/kg組(<0.05), 且對應(yīng)的半滑舌鰨的死亡率顯著高于400 mg/kg組(<0.05)(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。這說明mRNA表達量受維生素E劑量的影響。相關(guān)研究也指出, 維生素E缺乏或者過量都會影響魚的生長[29]。然而本研究體外細胞實驗結(jié)果沒有出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象, 這可能與維生素E的濃度設(shè)置有關(guān), 因為其濃度梯度的設(shè)置是參考相關(guān)實驗設(shè)計而沒有進一步增加其梯度, 在今后開展相關(guān)研究實驗時有必要考慮這一點。目前, 幾乎未見關(guān)于維生素E和mRNA表達的相關(guān)報道, 其相互關(guān)系和作用機制值得進一步探討和研究。

關(guān)于維生素E調(diào)控基因表達的機制尚未十分明確。相關(guān)研究指出,mRNA的合成依靠Ca2+胞吐作用方式, 且環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的磷酸化在mRNA合成表達的信號通路中起著關(guān)鍵的作用[30]。Ca2+濃度的上調(diào)會抑制CREB磷酸化過程, 從而可能影響mRNA的轉(zhuǎn)錄過程[31]。據(jù)此分析, 維生素E作為抗氧化劑能與氧化型低密度脂蛋白進行有效拮抗刺激Ca2+的攝入作用, 從而抑制細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高[32], 引起下游信號調(diào)控基因的表達。另外一種可能則是維生素E通過與生育酚轉(zhuǎn)運蛋白或者ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合的方式直接轉(zhuǎn)運到垂體細胞內(nèi), 作為基因調(diào)節(jié)因子, 從而影響mRNA合成表達。也可能是維生素E通過改變相關(guān)代謝酶的活性(蛋白激酶C、磷酸酯酶A2等)[33, 34]引起下游信號蛋白CREB磷酸化從而調(diào)節(jié)mRNA的表達。本實驗結(jié)果表明了維生素E對mRNA表達的促進作用, 且為證明維生素E作為基因調(diào)節(jié)因子提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究表明維生素E能夠上調(diào)mRNA的表達, 但應(yīng)用劑量要適宜。在本實驗條件下, 飼料中添加400 mg/kg維生素E時,mRNA表達量最高, 而進一步添加至1 600 mg/kg時會抑制其表達。

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An appropriate concentration of vitamin E promotes gene expression of growth hormone in

WANG Wei-fang1, XIANG Ling2, WANG Lin1, HUANG Bin1, LI Hui-tao3

(1.Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology of Qingdao, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2.College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3.Shandong Baifu Biotech Co., Ltd., Jining 273200, China)

This study aimed to investigate the effect of vitamin E on expression of the growth hormone genein pituitary tissues of half-smooth tongue sole (). DL-alpha-tocopherol acetate was added to the basic diet (vitamin E) at concentrations of 0, 400, and 1600 mg/kg diet to feed (464 ± 2.6) g semi-smooth tongue sole for 8 weeks. In addition, 0, 18, and 54 μmol/L vitamin E were added to L-15 medium for primary pituitary cell culture for 3 d. The expression ofin pituitary tissues and primary pituitary cells was analyzed by real-time quantitative PCR. The results showed that in theexperiment,mRNA expression significantly (0.05) increased when dietary vitamin E increased from 0 to 400 mg/kg and then significantly decreased in the group that

1600 mg/kg (0.05). In theexperiment, the expression level ofincreased significantly with increasing vitamin E concentration (0.05). Therefore, the proper concentration of vitamin E could promote the expression ofin the pituitary tissue of half-smooth tongue sole.

; vitamin E; growth hormone gene; aquaculture; primary pituitary cell

Aug. 2, 2019

[National Natural Science Foundation of China, No. 31872578, No.31502177]

S968.9

A

1000-3096(2020)02-0113-07

10.11759/hykx20190802001

2019-08-02;

2019-10-14

國家自然科學(xué)基金面上項目(31872578); 國家自然科學(xué)基金青年項目(31502177)

王蔚芳(1980-), 女, 吉林通化人, 副研究員, 主要從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)相關(guān)研究, E-mail: wangwf@ysfri.ac.cn; 李會濤,通信作者, E-mail: yulees@163.com

(本文編輯: 譚雪靜)