唐敏敏 朱磊 欒楓婷 邵雪梅 趙航 魏瑞成 王冉

摘要：為掌握恩諾沙星在雪山雞不同組織中的殘留消除規(guī)律，合理確定該品種肉雞的休藥期，以雪山雞為研究對(duì)象，以臨床推薦劑量混飲恩諾沙星水溶液，連續(xù)飲用5 d。分別于停藥后0.16、1、3、5、7、9、12 d 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)取雞的肌肉、腎臟、肝臟和皮脂組織進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對(duì)凈化處理過(guò)的組織進(jìn)行恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星測(cè)定，使用內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，停藥后0.16 d恩諾沙星標(biāo)志殘留物以肝臟組織最高，肌肉組織最低。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)采用WT1.4計(jì)算軟件擬合，腎臟組織的休藥期為2.93 d，肌肉組織的休藥期為 6.25 d，肝臟組織的休藥期為7.77 d，皮脂的休藥期為14.46 d。雪山雞按照推薦劑量飲水給藥，建議休藥期為15 d。

關(guān)鍵詞：恩諾沙星;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;消除規(guī)律;休藥期

中圖分類號(hào)：S859.84?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：1002-1302（2020）21-0215-05

恩諾沙星為第三代喹諾酮類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌性強(qiáng)、生物利用度高、體內(nèi)不易被代謝等優(yōu)點(diǎn)，與其他抗生素聯(lián)用無(wú)交叉感染[1]，在禽類養(yǎng)殖中是喹諾酮類最優(yōu)良的藥物之一。但喹諾酮類藥物的毒副作用也不容忽視，如會(huì)造成肝損傷、引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的不良影響等[2]。人類長(zhǎng)期食用含低劑量喹諾酮類藥物的動(dòng)物性食品，容易誘導(dǎo)耐藥性傳遞，從而影響該類藥物的臨床療效。黃羽肉雞是指除了國(guó)外培育的白羽肉雞外的所有有色羽肉雞[3]，是中國(guó)特色的肉雞產(chǎn)業(yè)。其中，雪山雞是利用我國(guó)優(yōu)質(zhì)地方良種藏雞和茶花雞雜交選育而成的品種[4]，肉質(zhì)纖細(xì)順滑，味道鮮嫩可口，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。目前，我國(guó)使用的肉雞抗菌藥物殘留限量是引用國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）和部分發(fā)達(dá)國(guó)家的限量標(biāo)準(zhǔn)，存在不完全適用于我國(guó)地方雞種生產(chǎn)的現(xiàn)象，給我國(guó)黃羽肉雞產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。

目前，報(bào)道大多集中在恩諾沙星在畜禽動(dòng)物中的藥物動(dòng)力學(xué)研究[5-6]，也有學(xué)者研究了抗菌藥物在畜禽動(dòng)物體內(nèi)的殘留消除規(guī)律[7-8]，其中，禽類主要針對(duì)白羽雞，較少有對(duì)地方雞種的研究，基于此，本研究評(píng)估典型抗菌藥物（恩諾沙星、環(huán)丙沙星）在雪山雞不同組織中殘留消除規(guī)律，了解殘留消除時(shí)間，為制定黃羽肉雞中抗菌藥物的休藥期提供數(shù)據(jù)支撐，以期指導(dǎo)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

恩諾沙星可溶性粉，購(gòu)自南京杰科生物技術(shù)有限公司;恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)132847，純度99.00%），購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;環(huán)丙沙星鹽酸鹽（批號(hào)132903，純度92.19%），購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;恩諾沙星-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)272238，純度99.00%），購(gòu)自Witega公司;環(huán)丙沙星-D8 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)281436，純度99.80%），購(gòu)自Witega公司;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），購(gòu)自美國(guó)霍尼韋爾公司。

1.2 儀器設(shè)備

SXIEX Triple Quad 4500 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex公司），分析天平（德國(guó)賽多利斯CPA225D），高速勻漿機(jī)（LAB PRECITION HM 6300），離心機(jī)（Eppendorf 5810R），氮吹儀，渦旋混合器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)組選擇30日齡雪山雞品種64羽，大小一致，公母各半，期間不給任何抗菌藥物，于常州市立華牧業(yè)試驗(yàn)場(chǎng)飼養(yǎng)至60～70日齡，隨后開(kāi)始?xì)埩舸x試驗(yàn)。給藥組56羽，公母各半，對(duì)照組8羽，公雞4羽，母雞4羽。試驗(yàn)前后各組飼養(yǎng)條件相同。

1.3.2 給藥與樣本采集 按照恩諾沙星可溶性粉推薦的給藥途徑和給藥方式，具體按照恩諾沙星計(jì)算，混飲，每1 L水100 mg藥量，自由飲水，連用 5 d。2019年8月25日分別從停藥開(kāi)始的0.16、1、3、5、7、9、12 d屠宰取樣8羽（給藥組、公母各半）和1羽（空白對(duì)照組），分別采集雞胸肌肉、全肝、雙腎和皮脂樣品，做好標(biāo)記，于-20 ℃保存。

1.3.3 測(cè)定方法 本研究采用國(guó)家推薦標(biāo)準(zhǔn) GB/T 20366—2006（動(dòng)物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）[9]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 樣品前處理 稱取5 g試樣（精確至0.001 g），置50 mL離心管中，加入50 μL 1.0 μg/mL 混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，加入20.0 mL 甲酸-乙腈[甲酸 ∶ 乙腈（體積比）=2 ∶ 98]，渦旋混合 1 min，4 000 r/min離心5 min，提取液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，殘?jiān)捎?0.0 mL 酸化乙腈重復(fù)提取1次，合并提取液，備用。

在提取液中加入10 mL乙腈飽和的正己烷，振搖10 min。4 000 r/min離心5 min棄去正己烷層。乙腈層在50 C下氮吹儀吹至近干。用甲酸-乙腈溶液1.0 mL溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后作為試樣溶液，供LC-MS/MS測(cè)定。

1.3.5 液相色譜參考條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC@BEH C18色譜柱，粒徑1.7 μm，2.1 mm×100 mm。流動(dòng)相（A）：0.1%甲酸，流動(dòng)相（B）：0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫條件：0.0～1.0 min，3%B，1.1～6.0 min，B由20%升至45%，6.1～8.0 min，B保持95%，8.1 min B降為3%。

1.3.6 質(zhì)譜參考條件 離子源：電噴霧（ESI）離子源;掃描方式：正離子;檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）;離子化電壓（IS）：5 500 V，溫度（TEM）：500 ℃，噴霧器溫度（GS1）：60 psi，輔助加熱器（GS2）：60 psi;氣簾氣（CUR）：35 psi。定性、定量離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量見(jiàn)表1。

1.3.7 方法回收率和精密度 對(duì)照組樣品（未檢出恩諾沙星標(biāo)志物殘留）的肌肉、肝、腎、皮脂樣品作為空白對(duì)照，分別做加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法回收率

恩諾沙星、環(huán)丙沙星在1～50 ng/mL（內(nèi)標(biāo)濃度20 ng/mL）范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，恩諾沙星線性方程為：y=0.176 87x-9.68×10-3，相關(guān)系數(shù)r為0.9 994，環(huán)丙沙星線性方程為y=0.04 9 24x-3.456×10-4，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9。由恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（圖1）可知，恩諾沙星在胸肉中回收率為81.4%～115%;在腎臟中回收率為99.4%～122.1%;在肝臟中回收率為89.4%～94.9%;在皮脂中回收率為78.4%～95.4%。環(huán)丙沙星在胸肉中回收率為83.0%～105.0%，腎臟中回收率為94.3%～101.0%，肝臟中回收率為83.6%～109.1%，皮脂中回收率為82.1%～96.9%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。

2.2 雞肉各組織中藥物殘留及消除規(guī)律

恩諾沙星在動(dòng)物組織中的殘留標(biāo)志物為恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星的總量，在動(dòng)物體內(nèi)消除緩慢，半衰期長(zhǎng)。采用內(nèi)標(biāo)法定量，對(duì)所采集的各組雞不同組織中（肌肉、腎臟、肝臟和皮脂）恩諾沙星（以恩諾沙星和環(huán)丙沙星之和計(jì)）進(jìn)行檢測(cè)。不同時(shí)間點(diǎn)各殘留量及藥物殘留量均值見(jiàn)表2。由消除曲線（圖2）可知，在停藥后0.16 d，肝臟、腎臟、肌肉中的恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量達(dá)最大值，按照“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”計(jì)算，肝臟、腎臟、肌肉中恩諾沙星殘留標(biāo)示物總量分別為（1 725±237.7）、（621.4±123.4）、（213.1±69.6） μg/kg，其殘留量隨著時(shí)間均呈下降趨勢(shì)，且前期以較快速率下降，腎臟和肌肉的殘留量在停藥1 d后已低于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的最大殘留限量MRL，肝臟殘留量在停藥 3 d 時(shí)低于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的最大殘留限量MRL。皮脂的代謝情況與上述3種組織略有區(qū)別?皮脂中恩諾沙星及環(huán)丙沙星之和在停藥1 d時(shí)達(dá)到最大值，殘留量為（956.1±108.0） μg/kg，隨后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，這與張崇威等報(bào)道的結(jié)果[10]一致，直至停藥12 d才低于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的最大殘留限量MRL。各組織中殘留消除曲線表明，恩諾沙星及其代謝物在雪山雞的各組織中均有滯留，且主要代謝方式為肝臟和腎臟，1 d內(nèi)雪山雞各組織中恩諾沙星代謝速率由快到慢依次為肝臟、腎臟、肌肉、皮脂。

2.3 休藥期計(jì)算

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 31650—2019） 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，恩諾沙星作為廣譜殺菌藥物，殘留標(biāo)志物為恩諾沙星和環(huán)丙沙星之和;其中，規(guī)定家禽肌肉、皮脂中最大殘留不超過(guò)100 μg/kg、家禽肝組織中最大殘留不超過(guò) 200 μg/kg，腎組織中不超過(guò)300 μg/kg，采用CVMP制定的統(tǒng)計(jì)方法（雙單側(cè)95%置信區(qū)間），對(duì)恩諾沙星可溶性粉在雞組織中休藥期進(jìn)行計(jì)算[11]。恩諾沙星在各組織中的殘留消除擬合情況見(jiàn)圖3。根據(jù)WT1.4軟件計(jì)算出恩諾沙星腎臟組織的休藥期為2.93 d，肌肉組織的休藥期為6.25 d，肝臟組織的休藥期為7.77 d，皮脂的休藥期為14.46 d。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法

目前，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[12-13]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]，另一些新型快檢技術(shù)也迅速發(fā)展，如膠體金免疫層析法[16]、微流控芯片-質(zhì)譜法[17]等。由于質(zhì)譜檢測(cè)器具有高靈敏度優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性檢測(cè)，將其與液相色譜聯(lián)用，不僅可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行良好分離，并且可以彌補(bǔ)液相色譜不能對(duì)物質(zhì)定性的缺點(diǎn)。因此，本研究采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法，同時(shí)考慮到樣品基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜的離子抑制影響，采用內(nèi)標(biāo)法校正，從而提高準(zhǔn)確性，保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性[18]。

3.2 休藥期

蔣志偉等通過(guò)推薦劑量飲水給藥，研究恩諾沙星可溶性粉在黃羽肉雞體內(nèi)的殘留消除規(guī)律發(fā)現(xiàn)，乳酸恩諾沙星可溶性粉在肌肉、肝臟和腎臟的休藥期分別約為7.689、7.339、4.529 d[19]。吳波等研究了恩諾沙星在黃羽肉雞肌肉、肝、腎中殘留消除規(guī)律[20]，但均缺少對(duì)皮脂消除規(guī)律的研究，因此對(duì)休藥期的建議不夠完善。本研究結(jié)合雪山雞不同組織中殘留消除數(shù)據(jù)，通過(guò)休藥期軟件得到恩諾沙星在腎臟組織的休藥期為2.93 d，肌肉組織的休藥期為6.25 d，肝臟組織的休藥期為7.77 d，皮脂的休藥期為14.46 d，因此推薦休藥期為15 d。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第278號(hào)規(guī)定，恩諾沙星在肉雞中的休藥期為8 d。本研究試驗(yàn)雞品種為雪山雞，一般90 d左右出欄，其生長(zhǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng)，屬于慢速生長(zhǎng)品種，與其他肉雞品種相比，藥物代謝速度較慢，而皮脂在規(guī)定8 d內(nèi)未達(dá)到安全標(biāo)準(zhǔn)，因此，針對(duì)該品種，在獸醫(yī)臨床上使用恩諾沙星存在安全風(fēng)險(xiǎn)，休藥期需要在15 d以上，以確保肉雞可食組織的恩諾沙星標(biāo)志殘留物低于國(guó)家最高限量標(biāo)準(zhǔn)。

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